img039 (4)

(np przez zastosowanie aldehydu glutarowego o wzorze: CHO-(CH2)3-CHO), wymuszoną flokulację komórek (H) lub samoa gregację drobnoustrojów, np. wzrost w postaci kuleczek (I).

Dobór metody otrzymania biokatalizatora unieruchomionego zależy przede wszystkim od jego zastosowania. Obecnie do wykorzystywanych przemysłowo metod immobilizacji należą:

•    sieciowanie enzymów i komórek aldehydem glutarowym, który wchodzi w reakcję z grupami NH2- białka enzymatycznego lub ściany komórkowej tworząc połączenia typu zasady SchifFa,

•    adsorpcja na nośnikach stałych (może być połączona z sieciowaniem),

•    zamykanie w żelach, najczęściej alginianowych, karagenowych, agarozowych, poliwinylowych i poliakryloamidowych,

•    kowalencyjne wiązanie biokatalizatorów z nośnikami metodą zależną od ich chemicznej budowy.

*

Cele ćwiczenia:

(1)    poznanie metody immobilizacji drobnoustrojów w alginianie wapnia,

(2)    sprawdzenie stabilności matrycy alginianowej w różnych środowiskach oraz

(3)    określenie efektywności działania immobilizowanej beta-fruktofuranozydazy (w żelu alkohol poliwinylowy (PVA)-alginian) w reakcji hydrolizy sacharozy.

2. Odczynniki i materiały 2.1. Materiał biologiczny

•    zawiesina komórek drobnoustrojów (drożdże) w soli fizjologicznej

•    p-fruktofuranozydaza pułapkowana w żelu będącym mieszaniną alginianu i alkoholu poliwinylowego (PVA), który zestalono jonami Ca⁺² oraz aldehydem glutarowym.

2.2,Odczynniki

Do immobilizacji (ćwiczenie 4.1):

•    3% wodny roztwór alginianu sodu

•    lód

•    l%CaCl₂

•    0.85% NaCl (sól fizjologiczna)

•    0.15 M cytrynian sodu,

•    2% NaCl z 0.2%EDTA

•    2% K2HPO4

Do oznaczania aktywności immobilizowanej p - fruktoforanozydazy (ćwiczenie 4.2)

•    preparat(y) immobilizowanej p - fruktoforanozydazy

•    3 % roztwór sacharozy o pH 5

•    odczynnik miedziowy:

•    odczynnik Nelsona

1 Sprzęt

•    wstrząsarka termostatowana (40°C)

•    waga analityczna o dokładności 0,0 lg

•    butelki lub kolbki Erlenmayera z zamknięciem o poj. lOOml

•    spektrofotometr

•    mieszadła magnetyczne

•    strzykawki i igły, sitka

•    probówki, pipety miarowe

•    sitka, bagietki, łopatki

4. Wykonanie ćwiczenia

4.1. Immobllizacja drobnoustrojów metodą pułapkowania w alginlanie wapnia

Połączyć roztwór alginianu sodu z zawiesiną komórek drobnoustrojów w stosunku 1:1, dokładnie wymieszać i odpowietrzyć. Tak uzyskaną zawiesiną komórek w alginianie napełnić pojemnik strzykawki, założyć igłę i wkraplać ją do 1%, oziębionego roztworu chlorku wapnia, przy delikatnym mieszaniu na mieszadle magnetycznym. Powstałe w efekcie jonotropowego żelowania alginianu jonami wapnia sferyczne formy żelu, pozostawić do utwardzenia przez ok. 0.5 godziny, po czym oddzielić je na sitku, przepłukać wodą i przenieść do soli fizjologicznej.

Sprawdzić stabilność nośnika alginianowego (kulek zawierających pułapkowane komórki) w środowiskach: soli fizjologicznej oraz roztworów cytrynianu, fosforanu i wersenianu sodowo-potasowego (EDTA). W tym celu umieścić jednakowe porcje kulek (4-6 szt.) w probówkach z wymienionymi wyżej roztworami (obj. ok. 3-5 ml) i pozostawić je w tych środowiskach na 15-30 minut, często i energicznie mieszając zawartość. Obserwować czy w probówkach zachodzą jakieś zmiany.

Wyjaśnić przyczyny zaobserwowanych zmian.