0 0 2

strzykawki. Metoda ta jest dość pracochłonna, lecz odzyskiwany nią DNA chi* ? rakteryzuje się wysokim stopniem czystości. Technikę tę cechuje ponadto dok niska (< 30%) efektywność odzysku fragmentów DNA o długości przekraczaj cej 3 kpz.

Materiał: DNA w żelu poliakrylamidowym.

Odczynniki:

1)    Bufor do clucji o pH 8,0: 0,5 M CH₃COONH₄ - 10 mM (CHjCOOjjMg - 0,1% roztwór SDS-I mM EDTA.

2)    96% roztwór etanolu.

3)    Bufor TE o pH 7,6: 10 mM Tris/HCI - I mM EDTA.

4)    3 M roztwór CHjCOONa.

5)    70% roztwór etanolu.

Ważniejsze przyrządy: Lampa UV.

Wykonanie:

1.    W żelu owiniętym w folię zlokalizować, używając lampy UV, pasma DNA, który ma być odzyskiwany. Za pomocą skalpela lub innego ostrego narzędzia wyciąć fragment żelu zawierający dane pasmo razem z folią i następnie wyjąć żel z folii Przenieść wycięty fragment do probówki i rozdrobnić go na jej ściankach używając np. końcówki pipety.

2.    Dodać 1-2 objętości (w odniesieniu do objętości fragmentu żelu) buforu do clucji (odcz. 1) i inkubować w temp. 37^CC z ciągłym mieszaniem. Inkubacja małych fragmentów DNA (<500 pz) powinna trwać 3 4 godz., większych — 12-16 godz.

3.    Odwirować (12000 xg w temp. 4^CC przez 1 min), przenieść supernatant do nowi probówki bacząc, aby nie przenosić kawałków poliakrylamidu.

4.    Do pozostałego osadu poliakrylamidu dodać 0,5 objętości buforu do clucr. (odcz. 1), krótko wytrząsać i wirować tak jak w punkcie poprzednim. Połączyć obydwa supernatanty.

5.    Usunąć pozostałości poliakrylamidu przepuszczając cluat przez kolumnę bądź strzykawkę z filtrem lub watą szklaną.

6.    Dodać 2 objętości etanolu o temp. 4^CC i inkubować 30 min w lodzie. Odzyskać DNA przez odwirowanie (12000xry w temp. 4^DC przez 10 min).

7.    Rozpuścić DNA w 200 gl buforu TE (odcz. 3), dodać 25 gl CH₃COONa (odcz. 4i i powtórnie wytrącić etanolem tak jak w poprzednim punkcie. Płukać osad w 70Vc roztworze etanolu, wirując jak poprzednio, i rozpuścić go w buforze TE tak. aby końcowa objętość roztworu wynosiła 10 gl.

Uwagi:

1)    Aby zmniejszyć uszkodzenia radiacyjne, należy stosować lampę emitującą długofalowe promieniowanie UV.

2)    Wycinając pasmo z żelu należy unikać wycinania zbędnych fragmentów poliakrylamidu, zmniejszając w ten sposób szansę zanieczyszczenia DNA.

3)    Po wycięciu danych pasm można żel sfotografować w celu archiwizacji położenia odzyskanych fragmentów.

4)    Jeżeli objętość buforu do elucji nic przekracza 0,5 ml (etap 2.), to późniejsi: wytrącanie etanolem (etap 6.) można przeprowadzić w tej samej probówce.

450