biolab1

A) BADANIE PROCESU GLIKOLIZY W KOMÓRKACH DROŻDŻY

Wykonanie:

Do dwóch szerokich plastikowych probówek wlać po 3 ml zawiesiny drożdży (przed wlaniem zamieszać zawiesinę drożdży) i 2 ml buforu fosforanowego o pH 5,5. Do probówki pierwszej wlać 2 ml 2% cysteiny (lub 1% alaniny), a do probówki drugiej 2 ml wody. Obie probówki umieścić w łaźni wodnej o temp. 37°C. a następnie do każdej dodać po 1 ml 10% roztworu glukozy i dokładnie wymieszać. Po 10 minutach od rozpoczęcia glikolizy do obu probówek dodać po 2 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowcgo, wymieszać i odwirować (10 min., 4000 obrotów/min.).

TEST Z 2. -/-DISITROEESYLOHYDRAZYSA NA OBECNOŚĆ riROGROSIASlT do krótkich probówek (na 10 ml) odmierzyć po I ml uzyskanych klarownych supernatantów, dodać po 0,5 ml nasyconego roztworu 2.4-dinitrofcnylohydrazyny* (DNPH) i wymieszać. Następnie z tak uzyskanych roztworów' pobrać po 200 pl i przenieść do nowych probówek zawierających po 1 ml 10% NaOH. Jeżeli w mieszaninie reakcyjnej obecny jest pirogronian to tworzy się czerwone zabarwienie.

kwas    2,4-dinitrofcnylohydrazyna

pirogronowy

2.4-dinitrofcnylohydrazon kwasu pirogronowego

h₂o

* 0.02% roztwór 2,4-dinitrofenylohydrazyny (dinitrophcnylhydrazine - DNPH) w I M roztworze HC1

TEST Z DXS \'A OBECNOŚĆ GLUKOZY: W zastosowanej metodzie wykorzystywane są właściwości redukujące sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują grupy nitrowe kwasu 3,5-dinitrosalicylowego do grup aminowych, a same utleniają się do kwasów onowych. Powstające aminowe pochodne kwasu 3,5-dinitrosaiicylow'ego mają barwę pomarańczową. Intensywność zabarwienia zależ)' od ilości sacharydów redukujących w- próbie.

kwas 3,5 dwunitrosalicylowy kwas 3,5 dwuaminosalicylowy źółtopomarańczowy    czerwonobrunatny

Wykonanie: do probówek skalowanych na 20 ml odmierzyć po 200 pl klarownych supernata tów. Do kolejnej probówki odpipetować 200 pl roztworu glukozy otrzymanego przez zmieszanie ml glukozy 10% i 9 ml wody destylowanej (odpowiada to stężeniu glukozy obecnej w próbach f< mentacyjnych jeśli nie podlegałaby ona glikolizie - kontrola dodatnia).

Do wszystkich probówek (właściwych i kontroli) dodać po 2 ml roztworu kwasu 3 dinitrosalicylowego, wymieszać i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Następnie pró oziębić i uzupełnić wodą destylowaną do kreski. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 5 nm. Na podstawie uzyskanych wyników omówić intensywność przebiegu glikolizy w róZn) warunkach.