104 Rozdział 8
System ten u E. coli indukuje co najmniej cztery białka:
Ada metylotransferazę DNA I. kodowaną przez gen acia,
AlkA - 3-metylo-glikozylazę DNA II kodowaną przez gen alkA\ usuwa 3-metylo adeninę, 3-metylowaną guaninę, eteno-guaninę i 02-metylowa-ne pirymidyny,
AlkB - oksygenazę. która hydroksyluje grupę metylową N3MeC i N'MeA (jednocześnie oksydacyjnie dekarboksylując a-keto-glutaran), hydroksy-lowana grupa metylowa spontanicznie rozpada się z uwolnieniem formaldehydu,
dehydrogenazę izowalerianową koenzymu A, kodowaną przez gen aidB, która w nieznany sposób zwiększa odporność na czynniki alkilujące.
Białko Ada (ang. adaptative response) uwalnia grupy metylowe z 06-mety-loguaniny (06MeG) i 04-metylotyminy (0JMcT) oraz z metylofosfotrójestrów powstających na skutek metylacji grup fosforanowych w szkielecie fosfocukro-wym DNA. Badania wykazały, że grupa metylowa z 06MeG z DNA jest przenoszona na cysteinę (Cys32) enzymu, powodując jego bezpowrotną inaktywację. Przeniesienie grupy metylowej z fosfotrójestru w DNA na cysteinę (Cys69) w łańcuchu białka Ada powoduje, że staje się ono aktywatorem transkrypcji genu ada i pozostałych genów odpowiedzi adaptacyjnej. Metylotransferaza DNA 1 działa w komórce tylko jeden raz, dlatego musi być syntetyzowana w dużych ilościach. W komórkach E. coli występuje drugi enzym metylotransferaza DNA II, kodowana przez gen ogt, wykazuje mniejszą specyficzność wobec substratu i nie usuwa grup metylowych z grup fosforanowych.
Metylotransferazy znaleziono również w komórkach wyższych eukariota, w tym także u człowieka. U ludzi znaleziono jedną metylotransferazę podobną do kodowanej przez gen ogt u E. coli. Enzym usuwa głównie grupę CH3 z 06MeG, w ograniczonym stopniu z 04MeT, nie usuw a zaś grup alkilowych z łańcucha fos-focukrowego DNA. Wykazano, że ludzki enzym ma duże regiony o podobnej sekwencji aminokwasowej do metylotransferaz I i II u E. coli choć podobieństwo nukleotydowe jest niewielkie.
Fotodimery pirymidyn, naprawiane przez system zwany fotoreaktywacją. Promieniowanie ultrafioletowe powoduje powstawanie dimerów pirymidynowych, reszty pirymidynowe sąsiadujące w jednej nici zostają połączone w iązaniami kow alencyjnymi (ryc. 8.2). Takie zmiany pow odują zatrzymanie replikacji i ekspresji genów do czasu usunięcia uszkodzenia. Naprawa zachodzi przy udziale jednego enzymu fotoliazy, przywrócenie pierwotnej struktury odbywa się bez usuwania napraw ianej zasady. Fotoliaza to monomeryczny polipeptyd (54 kDa), kodowany przez gen phr, jego wiązanie się z dimereni nie wymaga światła. Po związaniu z uszkodzoną nicią DNA uzyskuje zdolność absorpcji światła w( zakresie bliskiego nadfioletu i światła niebieskiego (długość fali 300-500 nm). Pochłaniany foton w obecności 2 kofaktorów' (FAD i metylotetrahydrofolianu)
(ilmoi cyklobutyłowy
/
uszkodzona zasada
przyłącza się fotoliaz;
naprawa dimeru i odłączenie fotoliazy
i.rrrrr l miojsce AP^^ |
i ti i i.r glikozydnzn DNA |
MIII 1 ■ 1 1 1 1 1 1 | |
^dnonukleotydowa^luka^ |
endonukleaza AP |
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | |
1 ii ii ti r |
polimoraza DNA + ligaza DNA ~rrr"i"T r |
Ryc. 8.3. Mechanizm wycinania uszkodzonej zasady
✓
TTTT
l
/ absorbcja światła
7
1—
J_lilii
Ryc. 8.2. Fotochemiczna naprawa dimeru w nici DNA
aktywuje fotoliazę, która rozdziela dimer na monomeryczne nukleotydy, a następnie oddysocjowuje od DNA. Ten system naprawy występuje u wielu bakterii oraz w komórkach eukariotycznych, także u niektórych kręgowców (z wyjątkiem człowieka).
Wyżej omówione systemy rozpoznają uszkodzenia DNA spowodowane przez mutageny, identyfikują zasady lub nukleotydy o zmienionej strukturze chemicznej, nie potrafią jednak rozpoznawać źle wstaw ionych nukleotydów podczas replikacji. Poreplikacyjna naprawa uszkodzonego DNA polega na naprawie błędów w nici potomnej. U E. coli istnieje kompleks enzymatyczny, który odróżnia nową nić DNA od matrycy, wycina źle wstawione nukleotydy i zastępuje je komplementarnymi nukleotydami. W czasie replikacji błędy pojawiają się w nowo syntetyzowanej nici, dlatego ważne jest rozpoznanie, która nić DNA uległa uszkodzeniu. Sprawa jest prosta, gdy w nici występują zmodyfikowane nukleotydy (np. dimer pirymidyny), gdy jednak w nowo syntetyzow anej nici wystąpi niekom-plementamy nukleotyd, to jak aparat naprawczy może odróżnić nić rodzicielską (prawidłową) od potomnej (z błędem)?
Znacznikiem wyróżniającym nici DNA jest metylacja zasad. Mianowicie w obrębie sekwencji 5-GATC’-.V metylowane są reszty adeniny, natomiast w' sekwencjach 5-CCA(i(j-.V i 5-(XTGG-3‘ metylacji podlega cytozyna. Nić ro-