GENETYKA Anna Sadakierska Chudy , Grażyna Dąbrowska str2

106 Rozdział 8

dzicielska jest metylowana w wielu takich miejscach, metylacja nici potomnej wymaga czasu i jest opóźniona w stosunku do replikacji. Dzięki temu po rozpoznaniu błędu przez system naprawczy enzym usuwający nieprawidłowo wbudowane nukleotydy przecina niemetylowaną nić, a niezmieniona nić rodzicielska może służyć jako matryca podczas naprawy błędów.

8.2.1. Naprawa typu BER - wycinanie uszkodzonych zasad

System typu BER (ang. ba.se excision repair) naprawia niewielkie uszkodzenia zasad azotowych, wyróżniamy w nim trzy etapy (ryc. 8.3):

- 1 etap - uszkodzona zasada usuwana jest za pomocą enzymów glikozylaz DNA, które przecinają wiązanie p-N-glikozydowc (między zasadą i cukrem) i powstaje miejsce AP, u E. coli występuje 11 różnych glikozylaz wykazujących specyficzność substratową (tab. 8.1),

// etap - enzym endonukleaza AP przecina wiązanie fosfodiestrowe po stronie 5'uszkodzenia, kreując wolny koniec 3'OH; niektóre glikozylazy DNA (AP-liazy) mają aktywność nukleolityczną w'obec miejsc AP i nacinają łańcuch fosfocukrowy po stronie 3' miejca AP - wówczas wraz z en-donukleaząAP tworzą l-nukleotydową lukę w DNA,

III etap - enzym polimeraza DNA I (poi I) wiąże się do wolnego końca 3'OH i wypełnia lukę, tworząc nową nić na matrycy DNA; jeśli w poprzednim etapie nie została usunięta pozbawiona zasady reszta fosfocukrowa, to polimeraza odsuwa jej 5' koniec od matrycy zostanie odcięty przez aktywność egzonukleolityczną samej polimerazy lub innego enzymu; ostatecznie ligaza DNA łączy nić, syntetyzując ostatnie wiązanie fosfodiestro-we. U różnych organizmów w syntezie nowej nici biorą udział inne rodzaje polimerazy, np. E. coli - polimeraza DNA I, ssaków - polimeraza DNA p, drożdży polimeraza DNA 5.

W komórkach ludzkich odtworzono in vitro przy użyciu oczyszczonych enzymów cały mechanizm naprawy BER. W ten sposób potwierdzono, że podobnie jak u E. coli w systemie tym uczestniczą: specyficzne glikozylazy DNA, endonu-kleaza AP, polimeraza DNA p, ligaza. U człowieka występuje tylko jedna endonukleaza AP (HPAl), która tnie nić DNA wyłącznie po stronie 5‘ miejsca AP.

Jednym z przykładów tego typu naprawy jest system usuwający uracyl z DNA. W cząsteczce DNAcytozyna może ulec spontanicznej deaminacji do uracylu, który normalnie paruje z adeniną. Taka zmiana jest mutagenna, ponieważ prow adzi do zamiany paty G-C w parę A-U w^r nici potomnej. Enzym glikozylaza uracy-lowa rozpoznaje takie miejsce w DNA i hydrolizuje wiązanie między uracylem a deoksyrybozą. Z helisy DNA usunięta zostaje zasada (enzym ten nie usuwa ty-miny) i powstaje w ten sposób miejsce AP, pozostałe etapy przebiegają według etapów opisanych powyżej.

-——    —————n

Tabela 8.1. Różne rodzaje glikozylaz DNA u E. coli

Enzym	Sub.strat
Ura -DNA glikozylaza	uracyl w DNA
5-mC-DNA glikozylaza	5-metytylocytozyna w DNA
1 lx-DNA glikozylaza	hipoksantyna w DNA
l^:apy-DNA glikozylaza	formamidopirymidyny lub 8-hydroksyguanina w DNA
3-mA-DNA glikozylaza I	3-mctyloadenina w DNA
3-mA-DNA glikozylaza 11	3-metyloadenina w DNA, 7-mctyloguanina lub 3-metyloguanina w DNA
PD-DNA glikozylaza	dimery pirym idy nowe w DNA
Hmu-DNA glikozylaza	hydroksymetylouracyl w DNA
T-G-DNA glikozylaza	pary G-T w DNA
MutY-DNA glikozylaza	pary G-A w DNA
endonukleaza III	5,6-hydrat tyminy w DNA

8.2.2. Naprawa typu NER - wycinanie uszkodzonych nukleotydów

System NER (ang. nucleotide excision repair) naprawia już poważniejsze uszkodzenia, np. połączenia wewnątrz nici lub połączenia zasad z dużymi grupami chemicznymi. U organizmów pozbawionych systemu fotoreaktywacji usuwa di mery w naprawie ciemnej. Wycinany odcinek DNA może być różnej długości, może obejmować jeden lub kilka nukleotydów. U E. coli istnieją dwie formy nu prawy:

a)    naprawa krótkich łat wycinany fragment ma zwykle 12 nukleotydów,

b)    naprawa długich łat - wycinany fragment może mieć długość 2 kpz.

Naprawa krótkich łat

Proces ten przebiega w- trzech etapach (ryc. 8.4):

/ etap - cały proces inicjuje kompleks enzymów, którymi sąendonukleazy UvrABC rozpoznające uszkodzony nukleotyd (np. dimer pirymidynowy):

-    w miejsce uszkodzenia przyłącza się trimer zbudowany z 2 monomerów białka A i monomeru białka B,

-    białko A oddysocjowuje,

-    przyłącza się białko UvrC,

-    dimer UvrB i C tnie w dwóch miejscach nić DNA w pewnym oddaleniu od uszkodzenia (na końcu 5' o osiem nukleotydów, na końcu 3' o cztery nukleotydy).

// etap - helikaza DNA II (kodowana przez gen uvrD) usuwa wycięty 12-nukleotydowy fragment dzięki rozerwaniu wiązań wodorowych. Oddysocjowuje białko UvrC, a UvrB pozostaje (prawdopodobnie zapobiega ono uszkodzeniu jednoniciowego DNA lub pomaga w skierowaniu polimerazy DNA).