img090 2

2. Wywołanie i /bud u nie. Ma mokrym jeszcze clmimntogramic zaznaczyć linię czol Po wysuszeniu chromatgramu wywołać go w 0,5% roztworze ninhydryny, za znaczyć obwody i punki środkowe plam aminokwasów. Obliczyć współczynniki R_f i za ich pomocą zidenyfikować plamy badanej mieszaniny aminokwasów.

Ćwiczenie 4.7. Ilościow)rozdział mieszaniny kilku aminokwasów w drodze spływowej chromatografii bibułowej jednowymiarowej

Zasada: Ilościowy charakti tej chromatografii polega na nakropleniu i rozwinięciu na jednym arkuszu bibuły Whtman nr 1 zarówno plam dla wzrastających stężeń wzór: wego roztworu aminokwas>w, jak i plam badanego roztworu aminokwasów. Rozdzi aminokwasów przeprowada się na drodze chromatografii jednowymiarowej zstępuj cej arkuszowej w prostokąiych szczelnych komorach Chropa, w temp. ok. 20°C. Odczynniki:

1)    0,0025 M roztwór wzorowy aminokwasów (zawierający cysteinę, argininę, kwas glutaminowy, alaninę i Icucynę) przygc&wany przez 2-krolne rozcieńczenie 0,005 M roztworu aminokwasów w 0,1 M roztworze HO.

2)    0,005 M roztwór wzorcoty aminokwasów w 0,1 M roztworze HC1. W małej zlewce (ok. 25 ml) | przygotować odpowicdni:odważki aminokwasów i rozpuścić w 10 ml roztworu HC1 ogrzar do temperatury ok. 60 ( Następnie przenieść je ilościowo do kolby miarowej na 100 ml] i uzupełnić do kreski HO 2 x destylowaną. Roztwór wzorcowy przechowuje się w mały pojemnikach w stanic zairożonym w temp. ok. - 10’C.

3)    0,0025 M, 0,0033 M i 0,00 M roztwory badanych aminokwasów.

4)    0,5% roztwór ninhydryn>v acetonie.

5)    0,005% roztwór CuS0₄ v75% etanolu.

6)    CHjCOOH lodowaty cz.a.

Wykonanie:

1.    Przygotowanie rozpuszcalnika. Jest nim n-butanol/CH₃COOH/H₂0 (4:1:5) wstawiony do pokoju chromzograficznego na okres co najmniej 24 godz. (Układ dwufazowy: rozwijać w faz: butanolowej).

2.    Przygotowanie chromattąramu. Na arkuszu bibuły Whatman nr 1 nakreślić ołówkiem równolegle do Irótszego brzegu 2 linie w odległości 5 i 9 cm. Linia pionowa równoległa do dhgiego brzegu arkusza bibuły oddziela „pole roztworów wzorcowych" od „pola rozworów badanych”. Na linii startu (9 cm od brzegu) zaznacza się punkty nakropenia plam w odległości 3,5 cm od siebie, a na kontrolne próby pozostawia się pas szrokości 6 cm przy wspomnianej linii pionowej.

Na linii startu nakrapla sit roztwór wzorcowy aminokwasów w ilości 10, 20, 30 i 40 pl za pomocą mikropbetki o pojemności 10 pl, a roztworu badanego: 20 pl (3 oddzielne plamy). Chronuogram rozwijać jednorazowo przez cały arkusz bibuły, przestrzegając jednocześnie tasycenia komory fazą wodną butanolowego rozpuszczalnika oraz kondycjonownia nakroplonego chromatogramu w ciągu 1-2 godz.

3.    Wywoływanie ehromatognmu. Suchy chromatogram rozcina się wzdłuż pionowej linii i wywołuje przcprowadając go jednym ruchem przez 0,5% roztwór ninhydryny w acetonie, znajdujący się wwanicnce porcelanowej. Na chromatogramie uwidaczniają się plamy aminokwastw w następującej kolejności od linii startu: Cys, Lys. His, Arg, Asp, Ser, Gly, Glu.Thr, Ala, Pro, Tyr, Met, Val, Phe, Len-file.

4. Ilościowe oznaczanie aminokwasów. Na chromatognimie ujmuje się plamy odpowiedniego aminokwasu z roztworu badanego i wzorcowego w prostokąty o powierzchni odpowiadającej największej plamie. Identyczne pole wykreśla się na pasku bibuły przeznaczonym na próby kontrolne w linii poszczególnych aminokwasów wzorcowych i badanych. Wycięte prostokątne pola z plamami aminokwasów roztworu badanego i wzorcowego kroi się wzdłuż utkania bibuły na wąskie paski (ok. 2 3 mm), które wkłada się do probówki, przestrzegając ich równoległego ułożenia. Elucję barwnych pasm przeprowadza się za pomocą 5 ml 0,005% CuS0₄ w 75% etanolu. Czas elucji: 1 godz. Pomiaru absorbancji dokonuje się w foto-kolorymetrze przy /. = 520 nm.

Seria roztworów' wzorcowych aminokwasów pozwala wykreślić krzywą kalibracyjną obrazującą zależność absorbancji od stężenia aminokwasów, ewentualnie wartości absorbancji dla np. 1 pg aminokwasu wzorcowego. Znając średnią wartość absorbancji roztworu badanego aminokwasu oblicza się łatwo stężenie danego aminokwasu w eluacie, następnie w hydrolizacie i wreszcie w badanym białku.

Uwagi: t) Prolina i hydroksyprolinu reagują bardzo słabo z ninhydryną, natomiast z izatyną dają intensywną barwę błękitną. Chromatogramy zawierające te aminokwasy rozwija się w układzie M-butanol/HCOOH/H₂0 (75:15:10) przez 18 godz. Po wysuszeniu wywołuje się je w 2% roztworze i/atyny w butanolu zawierającym 4% CHjCOOH lodowatego. Prolina ukazuje się w postaci intensywnych niebieskich plam na żółtym tle całego chromatogramu. Zawartość proliny oznacza się planimctrycz-nie, pr/ckalkowując za pomocą nakłuć igłą obrysy plam z bibuły na papier milimetrowy. Porównanie ilościowe powierzchni plam roztworów wzorcowych i badanych wyznacza stężenie proliny w roztworze z błędem nic większym niż ±5%. 2) Ilościowe oznaczanie tryptofanu patrz ćw. 9.7.

Ćwiczenie 4.8. Elektrochromatograficzny rozdział aminokwasów (patrz ćw. 5.3).

Ćwiczenie 4.9. Oznaczanie N-końcowego aminokwasu metodą dinitrofenylowania i za pomocą chromatografii bibułowej dwuwymiarowej (patrz ćw. 6.25).

Ćwiczenie 4.10. Chromatografia bibułowa jednowymiarowa nukleotydów RNA

(patrz ćw. 10.30).

Ćwiczenie 4.11. Chromatografia bibułowa jednowymiarowa zasad azotowych DNA

(patrz ćw. 10.31).

4.5. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA 4.5.1. Podstawy teoretyczne

U podstaw leżą te same procesy, które decydują o pomyślnym rozdzielaniu substancji innymi metodami chromatograficznymi. Są to procesy: odwracalnej adsorpcji fizycznej, wymiany jonowej i rozdziału substancji między dwie fazy ciekłe. Najczęściej zachodzi kombinacja wszystkich trzech jawisk, z przewagą jednego lub drugiego.

Właściwego wyboru jednej z wymienionych technik do rozdziału badanej mieszaniny trzeba dokonać po rozpatrzeniu różnic strukturalnych związków wchodzących w jej skład. Jak wynika z tabeli 4.4, różnice w rozmiarach cząsteczek (wyrażające się

125