IMGT39

*    pobudzają powstawanie korzeni przybyszowych (auksyny),

*    wywołują tworzenie i rozkrzewianie się pędów (cytokininy)

4 stymulują wydłużanie się międzywęźli (gibereliny),

4 przyspieszają procesy starzenia się roślin (etylen i kwas abscysynowy)

Witaminy dodaje się do pożywek bardzo rzadko ponieważ większość roślin potrafi sama syntetyzować je in vitro. Z grupy B stosuje się niekiedy biotynę, tiaminę, ryboflawinę, pirydoksynę, kwas foliowy lub pantotenian wapniowy; z grupy C -kwas L- askorbinowy, z grupy PP - kwas nikotynowy, a z grupy E - tokoferol. Do pożywki uniwersalnej MS (62) dodaje się zwykle mioinozytol - pochodną alkoholową cukrów prostych oraz glicynę -aminokwas będący źródłem azotu organicznego.

Węgiel aktywny, dodawany do pożywki w dawce wynoszącej zazwyczaj 20 g 4', stabilizuje pH pożywki, działa aseptycznie, pochłania fenole i melaniny - barwniki powodujące brązowienie i czernienie tkanek, sprzyja ukorzenianiu mikrosadzonek i wpływa korzystnie na tworzenie się in vitro zarodków somatycznych.

Ryc. 55. Mikrosa-dzonki funkii rosnące w naczyniu szklanym, na pożywce zestalonej agarem

Pożywkę rozlaną do naczyń szklanych sterylizuje się przez 20-35 minut w autoklawie, w temperaturze 110-121 °C, pod ciśnieniem 50-100 kPa.

Przed sterylizacją należy ustalić odczyn pożywki. Wartość pH powinna być w tym momencie wyższa o 1,0 od odczynu pożądanego w trakcie wzrostu rozwoju kultury. Trzeba bowiem pamiętać, że sterylizacja obniża kwasowość o ± 0,5. Dalsze obniżanie pH (również o ± 0,5) następuje w czasie regeneracji eksplantatu. Przy pH 4,5 agar staje się płynny i następuje witryfikacja eksplantatu. Poniżej 4,^r> i powyżej 7,0 wzrost rośliny zostaje zahamowany.

Dla większości roślin rosnących w szkle optymalny zakres pH zawiera się w przedziale 5,5-6,0, co oznacza, że przed umieszczeniem w autoklawie pożywka powinna mieć odczyn zbliżony do obojętnego 6,5-7,0.

3. Projektowanie składu pożywek

Inokulację eksplantantów przeprowadza się na pożywce o składzie ustalonym wcześniej drogą prób. W tzw. broad spectrum experiment zaproponowanym przez de Fossarda (1976), do prób przeznacza się tylko cztery komponenty, soe

mineralne, sacharozę, jedną cytokininę i jedną auksynę. Każdy komponent w trzech stężeniach: niskim, średnim i wysokim. W sumie V = 81 kombinacji.

1.    sole mineralne według Murashige'a i Skooga (1962)

1/4, 1/2 lub pełny skład

2.    sacharoza

10, 20 lub 40 g-l ’

3.    kinetyna lub benzyloadenina

0,01; 0,5 lub 5 mgT¹

4.    auksyna IBA lub NAA

0,01; 0,1 lub 1 mg-l-¹

Auksyny syntetyczne (IBA, NAA) można zastąpić kwasem 3-indoliło-octowym (IAA) w stężeniach dziesięciokrotnie wyższych: 0,1; 1,0 i 10 mg-l'.

Kinetynę w kombinacji z jedną wybraną auksyną stosuje się dla eks-plantatów merystematycznych, benzyloadeninę (BA) dla eksplantatów tworzących pędy przybyszowe.

Tego rodzaju wstępne doświadczenie, o charakterze typowo rozpoznawczym, niezbędne jest oczywiście tylko wtedy, gdy zupełnie nie wiadomo od czego zacząć, aby zainicjować kulturę in vitro i uzyskać pełną regenerację rośliny w warunkach laboratoryjnych. Dotyczy ono głównie nowości, które nie były wcześniej rozmnażane in vitro lub były, ale opracowana dla nich technologia jest chroniona tajemnicą.

4. Rodzaje eksplantatów

Eksplantat jest to odcięty, oderwany lub w inny sposób odizolowany od rośliny macierzystej organ, tkanka lub komórka albo fragment organu, tkanki lub komórki - dający początek kulturze in vitro.

Eksplantaty pierwotne (ex vivó) powinny być fizjologicznie młode (ju-wenilne), gdyż tylko takie obdarzone są wysoką zdolnością restytucyjną. Należy w związku z tym inicjować kulturę in vitro z eksplantatów zawierających merystemy in statu nascenti. Merystem wierzchołkowy pędu jest ju-wenilny w stopniu najwyższym. Inne tkanki powinny być pobierane z najmłodszych organów. To samo dotyczy inicjacji kultury z całych organów, np. liści, pąków, nasion lub wyizolowanych z nich zarodków.

Eksplantaty wtórne (ex vitro) są lepsze, zdrowsze i bardziej juwenilne. Pobiera się je z roślin rosnących w szkle. Do zapoczątkowania kultury in vitro nadają się młode organy lub ich fragmenty (np. całe liście, same blaszki liściowe lub ogonki liściowe), tkanki (merystemy, kalus, protokorm', komórki lub same tylko protoplasty.

89