izolacja limfocytow 2

Izolacja limfocytów

1.    Do jałowych, szklanych probówek przenieść 1,5 ml gradisolu (strzykawką), dla każdego pacjenta przygotować dwie szklane probówki

2.    Krew do szklanych probówek dodawać ostrożnie po ściankach , tak aby nie wymieszała się z gradisolem (stosować końcówki z filtrem). Przenieść całą krew z probówki pobranej na ontykoagulant

3.    Zrównoważyć probówki na wadze. Wirować 30 min.,2000 obrotów (4°C)

4.    Ściągnąć warstwę limfocytów. Jest to środkowy pierścień w formie białego „kożuszka”. Przenieść do nowych szklanych probówek

5.    Dodawać stopniowo 5 ml PBS na worteksie na małych obrotach.

6.    Zrównoważyć probówki i wirować 4 min., 1800 obrotów (4°C). Jeśli limfocyty nie osiądą żwirować raz jeszcze zwiększając obroty.

7.    Zlać supematant jednym zdecydowanym ruchem, odsączyć na bibule.

8.    Przygotować bufor lizujący w ilości 5 ml na probówkę w stosunku 4 (H2O DEPC) : 1 (bufor amonowy do lizy erytrocytów). Bufor należy przygotowywać na bieżąco.

9.    Do każdej probówki na worteksie stopniowo dodawać 5 ml sporządzonego buforu (tak_ aby osad odczepił się od dna probówki)

10.    Inkubować 10 min w 4°C (wstawić do wirówki), gdy pozostało dużo erytrocytów inkubować 15 min.

11.    Wirować 4 min 2000 obrotów (4°C).

12.    Zlać supematant postępując tak jak w pkt 7

13.    Dodawać stopniowo PBS na worteksie

14.    Wirować 4 min 2000 obrotów (4°C).

15.    Zlać supematant postępując tak jak w pkt 7

Tak wyizolowane limfocyty można zawiesić w 1 ml PBS łącząc ze sobą wszystkie limfocyty z dwóch szklanych probówek oraz sprawdzić orientacyjnie ich ilość, licząc w komorze Burkera ( pobrać 10pl). Wybrać 1 z 9 większych oraz 3 zló mniejszych kwadratów i policzyć limfocyty:

Liczbę limfocytów obliczyć ze wzoru:

Śr. arytm. x 16 x 10 000/ ml x ilość ml

Przenieść do eppendorfek odpowiednią ilość. Żwirować (2 min.) zlać supematant i zostawić do osuszenia na 10 min. Zamrozić w - 70°C