CCF20091110003

Postępowanie:

I)    Ekstrakcja tłuszczowców

10 g świeżego mózgu świńskiego zhomogenizować w 150 ml mieszaniny chloroform: metanol ( 1 ), przenieść roztwór do rozdzielacza i pozostawić do rozwarstwienia się faz. Usunąć górną fazę wodną a do fazy organicznej dodać 30 ml 0,1 M roztworu KC1 ( 4). Mieszaninę wytrząsnąć i pozostawić do rozwarstwienia. Ponownie usunąć fazę wodną (górną) i część fazy organicznej (10 ml) przenieść do probówki i zatężyć przez częściowe odparowanie na łaźni wodnej w temp. 80 - 90°C lub przez przepuszczanie strumienia azotu.

II)    Przygotowanie komory chromatograficznej

Wyłożyć wnętrze komory bibułą chromatograficzną i zwilżyć ją wybranym rozpuszczalnikiem do chromatografii (2 ). Wlać ten sam rozpuszczalnik do komory, aby utworzył na dnie warstwę o grubości 1 cm

III)    Naniesienie próbek na płytki TLC

Miękkim ołówkierą narysować linię startową równoległą do dolnej krawędzi płytek (10 x 10 cm) w odległości 1,5 cm od krawędzi. Zaznaczyć miejsca naniesienia prób i wzorców Nanieść kolejno po 10 ul próby (ekstraktu) oraz wzorców w postaci pasma jak pokazuje rysunek niżej (szerokość pasma nie powinna być większa jak 2-3 mm, długość około 1 cm

Linia startowa

Schemat naniesienia próbek na płytkę TLC

Po naniesieniu wszystkich prób, wysuszyć płytki suszarką. Wstawić płytki do komory i prowadzić rozdział w jednym z podanych układów tak długo, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się około 0,5 cm od górnej krawędzi płytki.

Wyjąć płytki z komory chromatograficznej, ołówkiem szybko zaznaczyć położenie czoła rozpuszczalnika a następnie wysuszyć je suszarką fryzjerską i poddać odpowiedniemu wybarwianiu. W tym celu kolejne płytki spryskać odpowiednio:

a)    roztworem błękitu bromotymolowego

b)    lub roztworem siarczanu amonu, osuszyć płytkę papierowyn ręcznikiem i ogrzać w suszarce laboratoryjnej lub gorącej płycie

c)    roztworem ninhydryny i umieścić w suszarce ( 80°C ) na około 20 minut

d)    roztworem dipikryloaminy

e)    roztworem molibdenianu amonu i umieścić pod lampą UV na kilkanaście minut do pojawienia się niebieskich plam w miejscach występowania fosfolipidów

f)    jedną płytkę umieścić w eksykatorze w parach jodu, po pojawieniu się brunatnych plam-płytkę wyjąć i sfotografować lub obrysować plamy ołówkiem (szybko zanikają)

( pod wyciągiem - jod szybko sublimuje i jest szkodliwy !)