ScannedImage 9

Izolacja kwaśnej fosfatazy z nasion łubinu

2g mąki otrzymanej przez zmielenie nasion łubinu zalewa się porcjami 20 ml buforu ekstrakcyjnego i uciera się w moździerzu w temperaturze pokojowej przez 10 min. Następnie wirujemy po zrównoważeniu w wirówce K-24 przy 10 tys. obrotów przez 10 min. Po odwirowaniu osad odrzucamy, a supematant służył nam będzie jako źródło kwaśnej fosfatazy.

1. Wpływ pH na aktywność kwaśnej fosfatazy.

Do 10 czystych probówek dodajemy roztwór p-nitrofenylofosforanu rozpuszczonego w buforze cytrynianowym o różnym pH.

Do prób 1, 3, 5, 7 i 9 dodajemy roztworu NaOH przed dodaniem fosfatazy, zatem ta silna zasada obecna w probówce spowoduje inaktywację enzymu. Próby 1, 3, 5, 7 i 9 będą więc próbami zerowymi odpowiednio dla prób 2, 4, 6, 8 i 10 w których enzym będzie działał w różnym pH.

Schemat doświadczenia ilustrującego wpływ pH na aktywność kwaśnej fosfatazy

Numer próby	Dodać po lmł buforu o pH (zawierającego substrat):	Dodać po 4ml 0,IM NaOH	Dodać po 0,2ml	Po 15 min inkubacji w temp. pokojowej dodać po 4ml 0,1M NaOH
			enzymu i wymieszać
1	3,0	+	+	-
2	3,0	-	+	+
3	4,0	+	+	-
4	4,0	-	+	+
5	5,0	+	+	-
6	5,0	-	+	+
7	6,0	+	4-	-
8	6,0	-	+	+
9	7,0	+	+	-
10	7,0	-	+	+

9