9

148 Enzymy

3.    Rozpocząć reakcję enzymatyczną, dodając kolejno do wszystkich prób po 1 ml 10 m.V pNPP).

4.    Dokładnie po 10 minutach reakcję przerwać przez dodanie 5 ml 0,1 M NaOH.

5.    Do prób kontrolnych dodać 0,2 ml roztworów surowicy.

6.    Odczytać A_4Io prób badanych i kontrolnych wobec ślepej próby odczynnikowej.

7.    Od wartości A₄i₀ prób badanych odjąć wartości uzyskane dla prób kontrolnych (jes wartości A_4]o prób kontrolnych są bliskie zera, można wykonywanie tych prók pominąć).

8.    Z krzywej standardowej odczytać ilość pNP zwolnionego w czasie reakcji. Oblicz;.; aktywność fosfatazy zasadowej w jednostkach na 1 1 surowicy (jednostki Bessey'a).

Materiały i odczynniki

wzorcowy roztwór p-nitrofenolu - 10 mM wodny roztwór p-nitrofenolu (pNP 139,1 mg/100 ml

10 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu sodu (pNPP) w buforze reakcyjnym; roztwc* przygotować na świeżo

bufor reakcyjny: 0,IM bufor glicyna-NaOH o pH 10,4 z 1 mM MgCl₂: przechowywać w lodówce -    0,1 M NaOH

surowica wieprzowa lub bydlęca

4.7.3.2. Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej wobec fosforanu p-nitrofenoR metodą nieciągłą

Zasada metody

Enzym w środowisku kwaśnym hydrolizuje fosforan p-nitrofenolu (pNPP) dc wolnego fosforanu i p-nitrofenolu (pNP), który po zalkalizowaniu próby przyjmuje żółte zabarwienie. Ilość p-nitrofenolu zwolnionego w reakcji mierzona przy 410 nm jest miar; aktywności enzymu.

Schemat reakcji hydrolizy pNPP został przedstawiony w poprzednim rozdziale (R\ 4.18). Za jedną jednostkę aktywności fosfatazowej przyjęto taką ilość enzymu, które zwalnia 1 pmol p-nitrofenolu w ciągu \ minuty w temperaturze 37°C.

Wykonanie krzywej standardowej dla p-nitrofenolu

1.    10 mM roztwór wzorcowy pNP rozcieńczyć wodą 20 razy (uzyska się w ten sposób 0,5 mM standardowy roztwór pNP).

2.    Do kolejnych probówek odmierzyć podane w tabeli poniżej ilości 0,5 mM roztwor. pNP i uzupełnić 0,1 M buforem octanowym o pH 5,1 do końcowej objętości 1 ml.