Fitopatologia leśna (25)

waż na ogół na nasionach czy cebulach nie ma objawów chorobowych, a po; to materiał ten jest rozprowadzany w celach handlowych po całym świ a z nim także wirusy.

Po okresie od kilku do kilkunastu dni po zakażeniu roślin zielnych ukazuj na nich objawy chorobowe. U drzew i krzewów okres inkubacji może być dł^ i wynosić kilka tygodni czy nawet miesięcy. Objawy powodowane przez wi można zakwalifikować do trzech grup: przebarwienia, zniekształcenia i nef Przebarwienia mogą być widoczne na liściach, kwiatach i owocach. Na li£^ najczęściej występuje mozaika, to jest jasnozielone lub nawet żółte plamki, i gi czy linie obok miejsc ciemniej zielonych. Na kolorowych kwiatach wysf pstrość w postaci jaśniejszych smug i wzorów, a na owocach plamy jaśniej normalnej barwy owocu. Zniekształcenia mają najczęściej postać skarłow kędzierzawości, zwężenia liści lub liściozwoju. Niektóre wirusy powodują wstawanie na liściach czy owocach drobnych zielonych, listewkowatych nr tzw. enacji. Nekrozy mogą mieć postać brunatnych plam na liściach, nekio* nych pierścieni, zamierania szczytów pędów czy nekrotycznych smug na ł gach. Wirus może też spowodować przedwczesną śmierć całej rośliny.

Wykrywanie i rozpoznawanie wirusów roślin, czyli ich diagnoza, jest d trudne i wymaga na ogół zastosowania kilku metod. W najprostszym wyjr diagnozujemy na podstawie charakterystycznych objawów chorobowych^ docznych na roślinie. Na tej podstawie przeprowadza się np. selekcję negat) polegającą na usuwaniu roślin chorych z plantacji nasiennych. Metoda ta jednak obarczona dość dużym błędem, ponieważ możemy pominąć rośliny^ re, ale nie wykazujące objawów lub z objawami słabo widocznymi. Nie por też na ogół określić, jakim wirusem zakażona jest usuwana roślina.

Inne metody są bardziej skomplikowane, ale też i znacznie dokładn^! Do najczęściej stosowanych należą: metoda biologiczna, metoda serolog! mikroskopia elektronowa i metody molekularne. Często dopiero łączne zas wanie wszystkich tych metod pozwala na zidentyfikowanie wirusa.

Metoda biologiczna jest najstarsza i podstawowa, nazywana też metodą wskaźnikowych. Polega ona na użyciu gatunków roślin, które reagują na OL ślonego wirusa wyraźnymi i charakterystycznymi (specyficznymi) objawami robowymi. Rośliny wskaźnikowe zakaża się sztucznie (inokuluje) badanymi sem i na podstawie ich reakcji dokonuje się wstępnej identyfikacji. Objawy robowe ukazujące się na inokulowanych liściach nazywamy objawami lok mi, a objawy widoczne na liściach nieinokulowanych, na ogół młodszych, tL wamy objawami systemicznymi. Rośliny wskaźnikowe najczęściej należą do dżin: Solanaceae, Chenopodiaceae, Fabaceae', są nimi m.in.: Nicotiana łab N. glutinosa, Datura stramonium, Chenopodium amaranticolor, Cli. album, Pi lus vulgaris, Pisum sativum. Roślinami wskaźnikowymi mogą też być ro drzewiaste, szczególnie jeśli badamy wirusy drzew. Drzewiaste rośliny ws ' kowe zakażamy na ogół przez szczepienie wegetatywne.

Za pomocą roślin wskaźnikowych badamy też wrażliwość wirusa na wf zewnętrzne w momencie, gdy znajdzie się on w soku rośliny po zniszczenfl| struktury komórkowej, czyli tzw. stabilność wirusa w soku, wcześniej oki jako właściwości fizyczne. Określa się trzy podstawowe cechy: punkt inakt) termicznej, graniczne rozcieńczenie i trwałość in vitro. Cechy te wskazują, kiej temperaturze, rozcieńczeniu oraz po jakim czasie przebywania poza f wirusy tracą infekcyjność. Dane te są różne dla różnych wirusów: punkt in

ieznej waha się od 42 do 95°C, graniczne rozcieńczenie od 100 do MO a trwałość in vitro od kilku godzin do kilku miesięcy.

^{1 000} toda serologiczna wykorzystuje fakt, że wirus, a szczególnie jego białko, ł ściwości antygenowe i po wprowadzeniu do krwi zwierząt wyższych, np. ₀₀b_Udza je do produkcji specyficznych białek, tzw. przeciwciał. Przeciw-znajdują się w surowicy krwi, skąd łatwo można je uzyskać i używać ich ^różnych testów serologicznych. Rośliny nie wytwarzają przeciwciał. Jeśli an-^d° (wirus) i specyficzne dla niego przeciwciała zetkną się ze sobą, także in vi-więc poza komórką, łączą się i wytrącają, tworząc osad widoczny niekiedy okiem. Zaletą testów serologicznych jest specyficzność, ponieważ surowi-*°uczulona na jeden gatunek wirusa reaguje tylko z tym wirusem lub jego szczeci Różna jest czułość testów serologicznych. Najmniej czuły jest test agluty-Jadi dużo bardziej czułe są testy precypitacji i dyfuzji w żelu agarowym. Wymienione testy nie są już dzisiaj stosowane.

Od 1976 roku wprowadzono bardzo czuły test serologiczny zwany w skrócie ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Test ten i jego modyfikacje są aktualnie stosowane na całym świecie do masowego badania zdrowotności roślin. Należy podkreślić szczególne znaczenie testu ELISA przy wykrywaniu wirusów roślin drzewiastych, w stosunku do których wszystkie wcześniej znane metody serologiczne były za mało czułe i z tego względu nieprzydatne. Test ELISA jest dość skomplikowany, ale dzięki automatyzacji można przebadać wiele próbek w czasie 1-2 dni. Zasada testu ELISA jest następująca: do studzienek w płytce polistyrenowej daje się surowicę uczuloną na poszukiwanego wirusa i przeciwciała są adsorbowane wewnątrz studzienek. Następnie do studzienek dodaje się sok z badanych roślin. W przypadku obecności w tym soku wirusa jego cząstki łączą się z przeciwciałami. W kolejnym etapie do studzienek dodaje się ponownie surowicę, która jednak uprzednio została chemicznie połączona z enzymem alkaliczną fosfatazą. W przypadku obecności w soku rośliny wirusa surowica sprzężona z enzymem zostanie przez wirusa zatrzymana na płytce, a w razie braku wirusa zostanie wypłukana przez odpowiednie bufory stosowane do płukania płytki po każdym etapie reakcji. Na końcu do studzienek dodaje się tzw. wywoływacz (fosforan paranitrofenylowy), który w obecności fosfatazy jest rozkładany z wydzieleniem paranitrofenolu o żółtym zabarwieniu, co świadczy o obecno-^w badanej próbie. W przypadku braku wirusa reakcja barwna nie za-gjoozi. Zawartość wirusa w próbce można ocenić przez pomiar ekstynkcji przy ^nm’ ^0<^P^0w'^a<^^aj4^ceJ żółtej barwie, znane są techniki serologiczne pozwalające wykryć kilka wirusów wmocześnie przez zastosowanie tzw. surowic poliwalentnych albo pozwalające ^P*y® tylko określone szczepy poszczególnych wirusów przez zastosowanie ^surowic monoklonalnych

*^atac*^{1 stosu}j^{e s}'ć ^w wirusologii metody identyfikacji polegające jjwyjcrywaniu kwasów nukleinowych, nazywane ogólnie metodami molekular-^w wynaHi!^{0 meto<}ty skomplikowane i drogie, ale najbardziej czułe i stosowane wości ^aC^’ identyczność wykrywanego wirusa nie może budzić wątpli-EShlm |^W ’^^enty^k^acji obiektów kwarantannowych. Metoda hybrydyzacji runą kom° ,^e*^tu*^arn^ (cDNA) polega na wyłapywaniu przez kwas nukleinowy wi-^ementarnego, sztucznie przygotowanego łańcucha kwasu nukleino-^^^^^ⁿego sondą molekularną. Sonda jest odpowiednio oznakowana pier-■ bioaktywnym lub chemicznie i jej obecność w próbie, świadczy

(^47