BACILLUS - ŹRODŁO ENZYMÓW BAKTERYJNYCH
Charakterystyka
gramdodatnie laseczki (brak LPS i OM); nie posiadają błony zewnętrznej - ułatwiona sekrecja enzymów;
tlenowce lub względne beztlenowce
urzęsienie perytrychalne lub biegunowe
znane gatunki mezofile, termofilne, psychrofilne, psychotropowe (zimnolubne)
tworzą endospory o różnym kształcie i rozmieszczeniu w komórce (podstawa klasyfikacji)
powszechne; występują w glebie, w wodzie, na roślinach, w przewodzie pokarmowym zwierząt
najbardziej popularne: B.pumilus, B.cereus, B.subtilis
producenci antybiotyków polipeptydowych: gramicydyny, polimyksyn, bacytracyny
B.thuringiensis syntetyzuje endotoksynę stosowaną jako biopestycyd
B.sphericus → acylaza penicylinowa
Inne enzymy: fosfataza alkaliczna, lipaza
Technologia produkcji egzoenzymów Bacillus sp:
I. Proces biosyntezy:
hodowla wgłębna, okresowa, w klasycznych fermentorach
podłoże: źródło węgla, witaminy, zasady azotowe
zakres temperatury 28-40C
warunki hodowli dobierane indywidualnie do szczepu
II. Wyodrębnienie enzymu z podłoża hodowlanego:
filtracja
oczyszczanie
Metody stabilizacji:
dodatek związków chemicznych: siarczan amonu, glicerol, niektóre sole
chemiczna modyfikacja enzymów (acylacja, alkilacja)
selekcja i konstrukcja mutantów wytwarzających enzymy o większej stabilności
immobilizacja - trwałe związanie z nośnikiem, tworzą nierozpuszczalne w wodzie połączenia
Związanie enzymu z nośnikiem
usieciowanie (polimeryzacja) cząsteczek enzymu bez udziału nośnika → sprzężanie z aldehydem glutarowym
zamknięcie enzymu w nośniku żelowym, włóknistym polimerze (octan celulozy)
mikrokapsułkowanie - otoczenie enzymu błoną półprzepuszczalną
Zalety unieruchamianych enzymów:
są mniej wrażliwe na czynniki zewnętrzne
korzystne zmiany właściwości katabolicznych
większe możliwości kontroli procesu
wielokrotne użycie
produkt pozbawiony śladów enzymu
idealny materiał w procesie technologicznym wykorzystującym ciąg reakcji enzymatycznych
możliwość zautomatyzowania procesu
mniejsze zanieczyszczenie środowiska
INŻYNIERIA ENZYMÓW PRZEMYSŁOWYCH:
I. Klonowanie i ekspresja naturalnych wariantów enzymów w innym biorcy
Dotyczy enzymów pochodzących z gatunków termofilnych (wykazujących optimum wzrostu w temperaturze powyżej 90C), trudnych do hodowli na skalę przemysłową. Biorcami są drobnoustroje o niższych wymaganiach.
Sklonowano w Bacillus subtilis geny kodujące:
termostabilną -amylazę i subtilizynę z B. amyloliquefaciens
-amylazę B. stearothermophilus
ksylanazę z B. pumilus
acylazę penicylinową z B. sphericus
Uzyskanie subtylizyny niezależnej od Ca2+ Bacillus amyloliquefaciens
Uzyskanie struktury trójwymiarowej metodą krystalografii rentgenowskiej, ustalenie która część jest odpowiedzialna za wiązanie Ca2+
Ukierunkowana mutageneza → delecja kilku aminokwasów wiążących Ca2 → brak zmiany struktury, ale utrata aktywności
Zwiększenie stabilności enzymów poprzez wymianę niektórych aminokwasów
Test kazeinowy - badanie właściwości proteolitycznych enzymu wskazujących na otrzymanie enzymu niezależnego od Ca2+ o wyższej aktywności, niż enzym wyjściowy.
II. Zmiana specyficznych właściwości białka enzymatycznego
Inżynieria białka - zmiany w sekwencji aminokwasowej białka, w celu zmian jego właściwości
Zmiany dotyczą:
siły wiązania enzymu z substratem
tolerancji i aktywności w pH i T, które inaktywują natywne białko
wymagań względem kofaktorów
modyfikacji miejsca wiązania substratu w celu zwiększenia specyficzności enzymu
zmian miejsca oddziaływania allosterycznego, aby usunąć feedback inhibition
zwiększenia odporności na komórkowe proteazy
Modyfikowanie właściwości enzymów- strategie:
zmiana przypadkowego aminokwasu metodą prób i błędów; najczęściej prowadzi do otrzymania nieaktywnego białka
zmiana aminokwasów zaprojektowana w oparciu o strukturę trójwymiarową enzymu → mutageneza ukierunkowana:
poprzez delecje, wstawienie innego kodonu
oparta o metody PCR, np. użycie polimerazy bez zdolności do korekty; niedomiar jednego z nukleotydów
Uzyskanie struktury 3D enzymu:
modelowanie komputerowe
krystalografia rentgenowska
Modyfikowanie właściwości ksylanazy B.circulans
→ modelowanie komputerowe 3D struktury w celu zaprojektowania miejsc wprowadzenia mostków dwusiarczkowych stabilizujących trójwymiarową strukturę białka, zwiększa termostabilność i oporność na rozpuszczalniki organiczne
→ zmiana aminokwasów tak, aby powstały mostki dwusiarczkowe (z grup sulfhydrylowych dwóch reszt cysteiny)
Mechanizmy regulujące syntezę egzoenzymów u Bacillus spp - indukcja i represja
większość egzoenzymów podlega indukcji
w obecności induktora (produktu degradacji substratu) synteza enzymu wzrasta nawet 1000x
synteza enzymów podlega represji katabolicznej:
węglowej - obecność łatwodostępnego źródła węgla
azotowej - obecność różnych form azotu
Regulacja biosyntezy subtylizyny u Bacillus:
obecność białka (substratu) w podłożu hodowlanym B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis zwiększa wydajność syntezy tylko kilkukrotnie
intensywna synteza enzymu nie zależy od obecności białka; rozpoczyna się przed sporulacją
na syntezę nie ma wpływu źródło azotu - brak represji azotowej
represja kataboliczna bez udziału cAMP-CAP, regulatorem jest GTP
Poziom wewnątrzkomórkowego GTP jest zależny od stężenia glukozy
GTP reguluje ekspresję genu kodującego białko spoOA
Wejście w sporulację wiąże się ze wzrostem stężenia GTP, indukcją syntezy spoOA oraz indukcją syntezy subtylizyny.
|
Przemysłowe nazewnictwo cukrów |
Skład |
Dekstroza/glukoza |
Cukier gronowy |
Cukier prosty |
Sacharoza |
Cukier buraczany |
Dwucukier(fruktoza+glukoza) |
Laktoza |
Cukier mlekowy |
Dwucukier(galaktoza+glukoza) |
Syrop glukozowy |
Cukier skrobiowy |
Glukoza+maltoza(dwucukier glukoza+glukoza) |
Ksyloza |
Cukier drzewny |
Cukier prosty (pentoza) |