1. Budowa i funkcje centrum aktywnego

Centrum aktywne enzymy

• jest to obszar cząsteczki enzymu, w którym cząsteczka(i) substratu zostaje związana i poddana katalizowanej reakcji,

• ma budowę trójwymiarową, leży w zagłębieniu cząsteczki E niedostępnym dla wody

• stanowi tylko niewielką część cząsteczki enzymu

Aminokwasy centrum aktywnego

• k - aminokwasy kontaktowe - leżą w odległości 0,2 nm od substratu; biorą udział w wiązaniu substratu z enzymem oraz bezpośrednio udział w katalizie,

• p - aminokwasy pomocnicze - nie stykają się z substratem, lecz pełnią określoną rolę w katalizie,

• s - aminokwasy stabilizujące strukturę przestrzenną centrum aktywnego.

2. Energia aktywacji

Energia aktywacji jest to najmniejsza ilość energii, którą trzeba dostarczyć 1M substratów aby każda z cząsteczek stała się reaktywna.

Reagują bowiem tylko te cząsteczki które znajdują się na odpowiednio wysokim poziomie energetycznym, czyli te które są w stanie aktywnym.

Różnica pomiędzy podstawowym poziomem energetycznym a poziomem odpowiadającym stanowi aktywacji [G_A] zwana jest barierą energetyczną.

Po jej pokonaniu następuje reakcja, w czasie której wydziela się energia będąca różnicą stanów energetycznych substratu i produktu.

3. Kopolimeryzacja

Specyficzny sposób sieciowania. Obejmuje 2 etapy:
I etap - polega na modyfikacji enzymów zawierających podwójne wiązania (najczęściej pochodna kwasu akrylowego i metakrylowego)
II etap - to proces kopolimeryzacji zmodyfikowanych enzymów przy użyciu takich związków jak np. akrylamid, metakryloamid, N-winylopirolidan
Enzymy posiadające liczne funkcjonalne grupy wykorzystywane w reakcjach wiążących je z nośnikami lub z odczynnikami stosowanymi do sieciowania.
Nie mogą to być natomiast grupy kontaktowe centrum aktywnego enzymu. W celu ich zabezpieczenia przeprowadza się immobilizację w obecności substratów lub ich analogów, które po procesie można usunąć.

4. Powinowactwo enzymu do substratu

Enzymy charakteryzują się zwykle dużą specyficznością pod względem katalizowanej reakcji, jak i również konwertowanych substratów. Za wysoką specyficzność odpowiada kształt cząsteczki enzymu dopasowany do substratów geometrycznie, ale także pod względem oddziaływań hydrofobowo-hydrofilowych oraz elektrostatycznych. Enzymy wykazują także wysoki poziom stereospecyficzności, regioselektywności i chemoselektywności^[27].

Niektóre z enzymów zaangażowanych w kopiowanie i ekspresję informacji genetycznej, poza bardzo wysoką specyficznością i precyzją, wykazują także zdolność działania "korekcyjnego" (ang. reading-proof activity). Przykładem może być polimeraza DNA I, która katalizuje syntezę nici DNA w czasie jej replikacji i naprawy^[28]. Polimeraza ta nie tylko jest wysoce precyzyjna, ale i zdolna do natychmiastowej poprawy ewentualnie zaistniałego błędu (źle wbudowanego nukleotydu). W rezultacie, dzięki tym dwóm właściwościom (precyzja syntezy i korekcja błędów), ryzyko popełnienia błędu przez ssacze polimerazy, który nie zostanie zauważony w procesie syntezy, wynosi mniej niż jeden na miliard wprowadzonych nukleotydów^[29]. Podobne mechanizmy korekcyjne posiadają polimerazy RNA^[30], syntetazy aminoacylo tRNA^[31] i rybosomy^[32].

Z kolei niektóre enzymy uczestniczące w produkcji metabolitów wtórnych charakteryzują się stosunkowo szerokim zakresem akceptacji różnych substratów. Sugeruje się, że odgrywają one bardzo ważną rolę w ewolucji nowych szlaków metabolicznych

5. inhibicja odwracalna

1. Odwracalna - kompetycyjna

- niekompetycyjna

- akompetycyjna

- mieszana

INHIBICJA KOMPETYCYJNA (WSPÓŁZAWODNICZĄCA)

• inhibitor kompetycyjny zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu wiążących substrat,

• inhibicję kompetycyjną można znieść przez zwiększenie stężenia substratu

• V_max nie ulega zmianie, zwiększa się K_m

INHIBICJA NIEKOMPETYCYJNA (NIEWSPÓŁZAWODNICZĄCA)

INHIBITOR NIEKOMPETYCYJNY

• wiąże się w miejscu katalitycznym (nie w miejscu wiązania substratu) lub poza nim, wywołując zmiany konformacyjne niekorzystne dla miejsca katalitycznego

• inhibitor nie jest strukturalnie podobny do substratu, nie może wiązać się w miejscu wiązania substratu, tylko w miejscu katalitycznym lub poza nim => obniża szybkość maksymalną katalizy

• zmniejsza szybkość katalizy enzymatycznej poprzez zmniejszenie liczby obrotów enzymu (obniża stężenie funkcjonalnego enzymu, pozostała część funkcjonalnego enzymu zachowuje się jak bardziej rozcieńczony roztwór enzymu)

• inhibitor niekompetycyjny nie wpływa na przyłączanie substratu do enzymu - nie wpływa na powinowactwo E do S

• nie zmienia K_m, obniża V_max

Nie można znieść inhibicji niekompetycyjnej zwiększając stężenie substratu, lecz poprzez związanie inhibitora przez inny związek

INHIBICJA AKOMPETYCYJNA

INHIBITOR AKOMPETYCYJNY

• wiąże się w innym miejscu niż miejsce wiązania substratu, wiąże się do kompleksu ES tworząc nieaktywny katalitycznie kompleks ESI

• związanie substratu przez enzym odsłania miejsce wiązania inhibitora

• obniża V_max i K_m

• nie można go znieść przez zwiększenie stężenia substratu

Ten typ inhibicji jest dość rzadki i może dotyczyć niektórych enzymów multimerycznych, katalizujących reakcje z udziałem wielu substratów.

INHIBICJA MIESZANA

inhibitor może wiązać się do E lub kompleksu ES

• nie ważne założenie o niezależności miejsc wiązania S i I, tak jak w inhibicji niekompetycyjnej

• inhibitor może się wiązać w centrum aktywnym (miejscu wiązania substratu lub miejscu katalitycznym) lub poza nim

• inhibitor wpływa jednocześnie na wiązanie substratu, jak również liczbę obrotów enzymu

6. Enzymy oligomeryczne

Enzymy oligomeryczne

• składają się z 2 lub więcej podjednostek,

• podjednostka jest to element oligomeru łączący się z innymi wyłącznie wiązaniami nikowalencyjnymi,

• podjednostka może się składać z 1 łańcucha polipeptydowego lub kilku połączonych wiązaniami kowalencyjnymi,

• masa oligomeru pow. 35 kDa - 1000 kDa, zdarza się do 10000 kDa

• np. oksydaza glukozy (homodimer - 2 identyczne podjednostki katalityczne), heksokinaza (heterodimer - 2 różne podjednostki).

W skład enzymów oligomerycznych mogą wchodzić podjednostki regulatorowe (nie mające centrum aktywnego), na których znajdują się centra allosteryczne, do których przyczepiają się aktywatory i inhibitory.

7. Efektor allosteryczny

Allosteryczne efektory - Nie zawsze tworzą kompleksy, które podlegają dalszym zmianom, ale zmieniają konformację enzymu - wpływają na jego powinowactwo do substratu

Kinetykę enzymów allosterycznych opisuje model sigmodalny

Zależność sigmoidalna jest wynikiem kooperatywnego wiązania substratu. Związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmieniać powinowactwo innych miejsc aktywnych enzymu - na ogół zwiększenie powinowactwa

8. Wpływ pH i temp na reakcję enzymatyczną

Wpływ temperatury

Działa na cząsteczki S i E.

↑ temp. => ↑ En. kinetycznej cz. S

Cząsteczki substratu szybciej się poruszają, zderzają się częściej, więcej z nich może osiągnąć stan przejściowy.

W pewnym momencie osiągnięta zostaje temp. optymalna dla działania enzymu.

Temperatura optymalna - temperatura, przy której szybkość reakcji enzymatycznej biegnie z maksymalną szybkością, a nie ma miejsca jeszcze denaturacja białka enzymatycznego.

Zbyt wysoka temperatura powoduje drgania w cząsteczkach enzymu i dochodzi do rozerwania wiązań w enzymie.

Wpływ pH

pH środowiska wpływa na:

wiązanie substratu przez E, aktywność katalityczną E, stan jonizacji substratu, zmiany w strukturze przestrzennej E.

pH wpływa na stopień zdysocjowania (uprotonowania):

• grup funkcyjnych centrum aktywnego,

• grup funkcyjnych, które uczestniczą w katalizie,

• grup funkcyjnych substratu, które uczestniczą w wiązaniu do enzymu,

• grup funkcyjnych leżących w pobliżu centrum aktywnego, które decydują o konformacji tego centrum aktywnego.

Optymalne pH działania - wartość pH, przy której szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna.

Krzywe zależności v/pH mogą być też prostolinijne.

Niewielkie odchylenie pH od wartości optymalnych powoduje nagły spadek szybkości reakcji enzymatycznej.

9. Kompleksy wieloenzymowe

• KOMPLEKSY WIELOENZYMOWE

W formie

- rozpuszczalnej

- związanej z błonami

- związanej ze strukturamu subkomórkowymi

Enzymy w nich występujące katalizują sprzężone ze sobą reakcje chemiczne. Działają w sposób bardzo ekonomiczny: reakcje mogą przebiegać przy niższym stężeniu substratu, zapewniona jest:

- maksymalna szybkość reaktywacji koenzymów i

- regulacja procesu.

Asocjacja enzymów tworzących kompleks ma charakter bardzo swoisty podobnie jak podjednostek w oligomerach.

Kompleksy te cechuje jednak

- regularna i zwarta budowa geometryczna oraz

- duża trwałość.

Oddzielone enzymy stają się nieaktywne.

10. Reaktywność enzymów

Jeśli chodzi o reaktywność to trzeba napisać co to jest katalityczna Kcat.

Kcat- stała katalityczna, jest miarą reaktywności enzymu czyli jego zdolności do katalizowania reakcji. Charakteryzuje ona przebieg reakcji w etapach następujących po utworzeniu kompleksu E-S, aż do rozpadu z uwolnieniem produktu.
Kcat określa więc liczbę moli substratu przetworzonego przez 1 mol enzymu w czasie 1s w warunkach, w których enzym wykazuje maksymalną aktywność.

11. Wymień i scharakteryzuj etapy reakcji enzymatycznej.

Trzy zasadnicze etapy reakcji enzymatycznej

Etap pierwszy

związanie cząsteczek substratu na powierzchni enzymu, powstanie kompleksu ES

Etap drugi

oddziaływanie S i E polegające na przegrupowaniach elektronowych pomiędzy grupami funkcyjnymi S i grupami funkcyjnymi aa kontaktowych E, naprężeniach wiązań w substracie

→ wzbudzonej formy kompleksu E-S

→ E-S‡ „utworzenia stanu przejściowego”

Etap trzeci

zajście reakcji katalitycznej, przekształcenie kompleksu E-S w kompleks E-P i rozpad tego ostatniego na E i P

12. czterocyfrowa klasyfikacja enzymów

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej, po nazwie zwyczajowej należy podawać czterocyfrowy symbol klasyfikacyjny enzymu np.

dehydrogenaza alkoholowa EC 1.1.1.1 (enzym ten nosi nazwę systematyczną oksydoreduktaza alkohol: NAD i katalizuje reakcję):

Alkohol + NAD = aldehyd lub keton + NADH + H⁺

Pierwsza cyfra wskazuje na przynależność enzymu do jednej z głównych 6 klas. Są to:

1. Oksydoreduktazy - reakcje oksydoredukcyjne

2. Transferazy - przenoszenie określonych grup pomiędzy związkami

3. Hydrolazy - rozkład różnych wiązań z udziałem cząsteczki wody

4. Liazy - odłączenie różnych grup od substratu bez udziału wody

5. Izomerazy - reakcje izomeryzacji

6. Ligazy [syntetazy] - wytwarzanie wiązań pomiędzy atomami w cząsteczkach substratów.

Druga cyfra dotyczy podziału na podklasy określające:

W klasie 1 i 2 - rodzaj grupy, której dotyczy reakcja,

W klasie 3, 4, 6 - typ wiazania rozrywanego lub tworzonego,

W klasie 5 - rodzaj izomeryzacji.

Trzecia cyfra wskazuje przynależność do odpowiedniej pod-podklasy grupującej enzymy:

- działające na określone grupy substratów lub

- działające w obecniści określonych akceptorów

- a w przypadku enzymów proteolitycznych - posiadające specyficzne centrum aktywne.

Czwarta cyfra jest numerem porządkowym enzymu w danej pod-podklasie

13. Swoistość substratowa

Wybiórczość substratowa polega na tym, że:

- enzym szczególnie aktywnie katalizuje przemianę związku zawierającego oprócz grupy reagującej również inne grupy funkcyjne, a brak tych grup albo zablokowanie ogranicza ewentualnie eliminuje działanie enzymu lub

- enzym działa tylko na jeden z izomerów optycznych danego związku ( stereoswoistość) lub

- enzym jest szczególnie aktywny wobec związków o określonej długości łańcucha węglowego.

14. Immobilizacja w układach dwufazowych

IMMOBILIZACJA ENZYMÓW LUB KOMÓREK

- zespół metod umożliwiających unieruchomienie enzymów lub całych komórek w wyniku ich związania na powierzchni nośnika (adsorpcja, wiązania kowalencyjne), zamknięcie w porach żelu lub kapsułkach z półprzepuszczalnych błon bądź unieruchomienia w wyniku kowalencyjnego usieciowania.

Największe zastosowanie immobilizowanego enzymu w produkcji przemysłowej dotyczy izomerazy glukozowej.

15. Rodzaje modyfikacji kowalencyjnych

Do pierwszej grupy możemy zaliczyć hydrolizę wiązań peptydowych. Ma ona miejsce podczas przekształcania proenzymów w formę aktywną. Do tej grupy zaliczyć należy także niecelowe modyfikacje z którymi możemy mieć do czynienia podczas oczyszczania i izolowania enzymów. Do pierwszej grupy należą także modyfikacje polegające na redukcji wiązań disulfidowych w cząsteczce enzymu.

Do drugiej grupy modyfikacji (dotyczących tworzenia nowych wiązań pomiędzy grupami bocznymi aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym enzymu) zaliczamy:

tworzenie wiązań disulfidowych pomiędzy grupami

16. Chemiczna modyfikacja enzymów.

W cząsteczkach enzymów tylko niewielka liczba grup funkcyjnych (zawierających atom polarny) jest niezbędna do aktywności katalitycznej (kontaktowe, pomocnicze, stabilizujace). Pozostałe grupy można modyfikować bez względu na aktywność.

Chemiczne modyfikacje grup funkcyjnych polegają na przekształceniu je w inne grupy na drodze reakcji chemicznych z odpowiednimi odczynnikami.

Reakcje te stosuje się do badania i identyfikacji grup czynnych enzymów.

Możemy podzielić je na 2 grupy:

A. selektywne modyfikacje grup w centrum aktywnym enzymu

B. modyfikacje z użyciem odczynników przekształcających wszystkie dostępne grupy funkcyjne w enzymie.

Grupa A stwarza możliwość badania struktury I-rzędowej wokół zmodyfikowanych aminokwasów oraz dostarcza informacji o charakterze reszt aminokwasowych biorących udział w wiązaniu enzymu z substratem i o rodzaju tych wiązań.

17. Co to są protomery i gdzie występują

strukturę [IV-rzędową] enzymu oligomerycznego określa ułożenie przestrzenne podjednostek [protomerów] oraz zespół ich kontaktów oraz oddziaływań wzajemnych.

Protomery mogą być zbudowane z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych.

18. biokatalizatory

Zalety stosowania biokatalizatorów:

• Mogą być wielokrotnie używane, otrzymany produkt pozbawiony jest praktycznie nawet śladowych ilości enzymu. Jest to ważne szczególnie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym. Stwierdzono klinicznie, że śladowe ilości białka enzymatycznego mogą powodować reakcje immunologiczne objawiające się np. uczuleniami.

• Można je łatwo oddzielić od produktów katalizowanej reakcji

• Możliwość prowadzenia procesów ciągłych. Produkt jednej reakcji w sposób ciągły może być poddawany na drugą kolumnę wypełnioną enzymem unieruchomionym i tam dalej przekształcany

• Ich stabilność termiczna oraz odporność na działanie inhibitorów, trucizn lub odczynników organicznych jest wyższa od enzymów wolnych

• Łatwa technologia i aparatura do procesów z ich użyciem

• Możliwość stosowania przemian złożonych przez unieruchomienie kilku kolejno działających enzymów

• Dzięki unieruchomieniu enzymu korzystnej zmianie ulegają jego właściwości katalityczne, co umożliwia przeprowadzenie operacji biotechnologicznej w szerszym zakresie i w bardziej rygorystycznych warunkach

• Ich zastosowanie zmniejsza potencjalne zanieczyszczenie środowiska

• Tworzenie zazwyczaj mniejszej ilości produktów ubocznych

Wady stosowania biokatalizatorów:

• Stosowanie immobilizowanych biokatalizatorów ogranicza się tylko do substratów występujących w stanie ciekłym lub w formie roztworów. Przyczyną tego jest brak możliwości łatwego oddzielenia biokatalizatora po zakończeniu procesu i prawie zupełne zahamowanie reakcji przebiegającej na granicy dwóch faz stałych.

• Immobilizacja powoduje obniżenie powinowacta enzymu do substratu - zwiększenie stałej Michaelisa oraz zmniejszenie V_max

• podczas jego długotrwałego stosowania następuje zmniejszenie aktywności katalitycznej spowodowane prawdopodobnie częściową desorpcją biokatalizatora lub jego inaktywacją pod wpływem temp, kwas lub siły jonowej

• utrudnienie zmian oscylacyjnych podczas katalizowania reakcji oraz przestrzenne ograniczenie dostępu substratu

• częściowe wymywanie komórek ze złoża

19. Podaj dwa przykłady kompleksów wieloenzymowych oraz wymień enzymy wchodzące w skład takich kompleksów

Przykłady:

Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej przeprowadza oksydacyjną dekarboksylację kwasu pirogronowego do acylo-CoA

Kompleks syntetazy kwasów tłuszczowych.

Układ enzymatyczny, który katalizuje syntezę długołańcuchowych nasyconych kwasów tłuszczowych z:

- acylo-CoA

- malonylo-CoA oraz

-NADPH

nazywamy syntetazą kwasów tłuszczowych.

Syntetaza (drożdży) stanowi kompleks wieloenzymatyczny. Kompleks zbudowany jest z dwóch rodziajów łańcuchów polipeptydowych, ma skład podjednostek α₆β₆

Łańcuch α - zawiera:

- białkowy nośnik grup acylowych

- enzym kondensujący oraz

- reduktazę β-ketoacylową

Łańcuch β - zawiera:

- transferazę acetylową

- transferazę molonylową

- dehydratazę β-ketoacylowa oraz

- reduktazę enoilową.

20. Czym się różni centrum katalityczne od substratowego?

Miejsce katalityczne jest to obszar, w którym zachodzi reakcja. Struktura tego miejsca decyduje o swoistości enzymu względem katalizowanej reakcji, czyli swoistości działania, która polega na tym, że dany enzym katalizuje tylko jedną z reakcji chemicznych, w których może brać udział przyłączony substrat.

Miejsce wiazania substratu jest to miejsce określające swoistość enzymu, która dotyczy niezwykłej wybiórczości w stosunku do substratów.

21. Co to jest apoenzym?

Apoenzymy - białkowe części enzymu, które po połączeniu z odpowiednimi koenzymami  lub grupami prostetycznymi tworzą holoenzymy.

22. Na czym polega znakowanie pseudosubstratami?

ZNAKOWANIE PSEUDOSUBSTRATAMI - które są związkami zbliżonymi do substratów strukturą przestrzenną. Ich grupy reaktywne, chociaż inne niż grupy substratu, zajmują te same pozycje w cząsteczce i łączą się z tymi samymi grupami reaktywnymi w centrum aktywnym enzymu. W wyniku reakcji z pseudosubstratami powstaje stabilne połączenie kowalencyjne nie ulegające dalszym przekształceniom (inaktywacja enzymu).

Pseudosubstratami esteraz i proteinaz serynowych oraz niektórych lipaz są nieorganiczne zwiazki fosforu.

23. Co to jest chromatografia powinowactwa biologicznego? W jakim celu jest stosowana i na czym polega?

Chromatografia powinowactwa- Szczególny typ chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się specyficzne powinowactwo dwóch substancji. Rozdział opera się o różne powinowactwa rozdzielanych substancji do liganiu. DO złoża jakim jest upakowany w kolumnie nośnik, dołącza się kowalencyjnie ligandy, które wiążą specyficzne, swoiście oczyszczane białka (1 ligand 1 enzym lub grupa enzymów podobnych)

Eluat - faza ruchoma opuszczająca złoże chromatograficzne zawiera sam rozpuszczalnik, bądź rozpuszczalnik wraz z rozdzielanymi białkami.

Swoistą adsorpcję zastosowano po raz pierwszy już w 1910 r. do izolowania alfa-amylazy. Ligandem była skrobia, a rozpuszczalnej formy tego wielocukru użyto do Lucji enzymu.

Rodzaje elucji:

- specyficzna - wprowadzenie tego samego lub innego ligandu, który konkuruje o E z ligandem na nośniku

Odpowiedni ligand (zw. z którym enzym wiąże się swoiście) np. analog substratu, efektor allosteryczny, koenzym, przeciwciało unieruchamia się w fazie stałej przez połączenie go z nierozpuszczalnym obojętnym nośnikiem (najczęściej pochodną agarazy). - biologiczna

24. Co to jest i do czego jest stosowane sączenie molekularne i chromatografia hydrofobowa?

Rodzaj chromatografii adsorpcyjnej, której białka wiążą się z fazą stacjonarną za pomocą wiązań hydrofobowych. Rozdział opiera się o różnice w oddziaływaniach hydrofobowych. Rozdział białek następuje na podstawie różnic w sile oddziaływań hydrofobowych pomiędzy grupami hydrofobowymi kowalencyjnie związanymi z osnikiem a obszarami hydrofobowymi rozdzielanych białek. Właściwości hydrofobowe wbiałek wynikają z obecności aminokwasów hydrofobowych; Od najbardziej do najmniej hydrofobowych: tryptofan, izoleucyna, fenyloalanina,, tyrozyna, leucyna, walina, metionina, alanina

Chromatografia hydrofobowa- Opiera się na różnicach oddziaływań miedzy unieruchomionymi na odpowiednim nośniku związku hydrofobowym a hydrofobowymi obszarami cząsteczki białka. Najczęściej stosowane są: alkilowe i amino alkilowe pochodne agarozy.

Chromatografia sita molekularnego - filtracja żelowa sączenie molekularne chromatografia rozdzielcza; rozdział na podstawie różnic wielkości i kształcie cząsteczek. Białka ulegają rozdziałowi między 2 fazy płynne: faza ruchoma (płyn na zewnątrz ziaren żelu); faza stacjonarna (płyn zalegający wewnątrz żelu), fazę ruchomą i stacjonarną stanowi sam roztwór.

25. Co jest miarą efektywności etapu oczyszczania
    Oceny stopnia czystości wyizolowanego enzymu

Kryteria:

• Jednorodność (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, ogniskowanie izoelektryczne, immunoelektroforeza)

• Kryteria katalityczne - oznaczanie obcych aktywności enzymatycznych przy zastosowaniu substratów lub oznaczanie aktywności właściwej w przypadku izolowania enzymów uprzednio już otrzymanego w stanie oczyszczonym

• Kryteria molekularne - zastosowane gdy mamy dane na temat enzymów czystych i scharakteryzowanych pod wzglądem parametrów molekularnych i składu chemicznego, wielkość i kształt cząsteczek (stałe sedymentacji, współczynnik dyfuzji, objętość właściwą, masa cząsteczkowa)

Najszersze zastosowanie znajdują kryteria:

• Elektroforetyczne

• Immunoelektroforetyczne

• Katalityczne

26. wartosci okreslające użyteczność immobilizowanego biokatalizatora

Wartości charakteryzujące użyteczność biokatalizatorów:

• Stabilność - półokres trwania mierzony w dniach lub godzinach przechowywania w danej temperaturze do utraty 50% aktywności enzymatycznej.

• Stabilność operacyjna - półokres trwania aktywności biokatalizatora mierzonej w warunkach ciągłego katalizowania danej reakcji.

• Szybkość objętościowa - szybkość przepływu substratu przez reaktor w procesie ciągłym, mierzona stosunkiem objętości przepływającego przez reaktor substratu do objętości reaktora.

• Produkcyjność - ilość produktu wytworzona przez 1kg biokatalizatora w ciągu określonego czasu.

• Efektywność ekonomiczna -

E=A_o*W*0,5t

A_o - aktywność początkowa

W - wydajność immobilizowania

0,5t - półokres trwania

27. . Opisać etapy procesu immoblizowania

Proces immobilizacji obejmuje dwa etapy:

I-etap - nośnik traktowany jest odczynnikami które reagują z określonym rodzajem jego funkcjonalnych grup wprowadzając grupy aktywne wykazujące zdolność do reagowania i odpowiednimi grupami łańcuchów bocznych białka enzymatycznego.

II etap - enzym jest wiązany z aktywnymi grupami nośnika. Do aktywacji nośników zawierających grupy hydroksylowe najczęściej stosuje się:

• kw. Chlorooctowy dający pochodne karboksylowe

• chlorek p-nitrobenzoilu dający pochodne nitrowe, które poprzez redukcję można przekształcić w pochodne amionowe lub di azowe

• epicholohydrynę dającą pochodne epoksydowe

• bromek kwasu bromooctowego lub dichlorotriazynę dającą reaktywne grypy halogenowe.

Stosuje się m.in.:

• diwinylosulfon

• benzoaminon

• etylenodiaminę

• chlorki sulfonowe

Do aktywacji grup aminowych nośnika najczęściej stosuje się aldehyd glutarowy, którego grupa aldehydowa tworzy z grupą amionową zasadę Schiffa.

Inne stosowane odczynniki:

• chlorek p-nitrobezoilu

• etylenodiamina

• hydrazyna

Gdy enzymy są im mobilizowane kowalencyjnie na nieorganicznym nośniku jak szkło lub aluminium stosuje się technikę sprzęgania silanem.

Grupy aktywne nośnika powinny znajdować się w odpowiedniej odległości od jego rdzenia, aby zapobiec zakłóceniom sterycznym podczas wiązania enzymu i podczas reakcji enzymatycznej. W związku z tym podczas aktywacji nośnika często wprowadza się tzw. odstępni ki. Mogą nimi być łańcuchy węglowodorowe zawierające od 2-10atomów C np. podczas aktywacji poliamidu stosuje się aldehyd glukozowy a następnie di hydrazyd kwasu adypinowego. Coraz więcej nośników zawierających różnorodne grupy funkcyjne produkowanych jest przemysłowo. W katalogach znajduje się ich pełna charakterystyka.

28. Oceny stopnia czystości wyizolowanego enzymu

W ocenie przydatności etapów oczyszczania bierzemy też pod uwagę:

• Pracochłonność

• Koszt

• Możliwość powiększania skali procesu

• Postać i trwałość pozyskiwanych procesów [tu o możliwości uniknięcia kłopotliwych operacji międzyetapowych lub stabilność w przypadku gdy na określonym etapie przerywamy preparatykę np. w celu akumulacji materiału]

Kryteria:

• Jednorodność (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, ogniskowanie izoelektryczne, immunoelektroforeza)

• Kryteria katalityczne - oznaczanie obcych aktywności enzymatycznych przy zastosowaniu substratów lub oznaczanie aktywności właściwej w przypadku izolowania enzymów uprzednio już otrzymanego w stanie oczyszczonym

• Kryteria molekularne - zastosowane gdy mamy dane na temat enzymów czystych i scharakteryzowanych pod wzglądem parametrów molekularnych i składu chemicznego, wielkość i kształt cząsteczek (stałe sedymentacji, współczynnik dyfuzji, objętość właściwą, masa cząsteczkowa)

Najszersze zastosowanie znajdują kryteria:

• Elektroforetyczne

• Immunoelektroforetyczne

• Katalityczne

29. Immobilizacja komórek w sieci żeli polisacharydowych.

Najczęściej używanym polisacharydem jest algininian, liniowy kopolimer kwasów D-mannuronowego i L-glukoronowego. Sole sodowe lub potasowe alginianu rozpuszcza się w roztworze wodnym zawierającym biokatalizator. Mieszanina jest wkraplana do roztworu zawierającego jony Ca^2+, Ba ²⁺ lub inne które tworzą wiązania między łańcuchami polisacharydów tworząc żel. Żele tego typu mogą być nietrwałe w roztworach soli kompleksujących metale (fosforany, cytryniany). Można je stabilizować polietylenoiminą i aldehydem glutaronowym.

Inne stosowane polisacharydy to:

• chitoza - zbudowany z reszt glukozoaminy, w której rozpuszcza się w rozcieńczonych kwasach organicznych (pH 5).Miesza się z mocnymi komórkami i wkrapla do roztworu fosforanu sodu(pH 8). Ten żel rozpuszcza się w buforze octanowym. Przy (?) się żelifikację z zawiesiną alginianu Ca lub z nośnikami żywicy epoksydowej.

• Karageninian K - zbudowany z reszt sulfonowanej galaktozydazy, którego roztwór wodny ogrzany do temp. 40-55^oC miesza się z zawiesiną komórek i schładza do 10^oC uzyskując żel stabilizowany po pocięciu w 0,3M KCl. Żel można dodatkowo utwardzić aldehydem glut arowym i diaminoheksanem.

Duża porowatość biożeli umożliwia namnożenie komórek i wzrost grzybni.

30. Co to jest sieciowanie

Polega na łączeniu cząsteczki enzymów w duże agregaty w wyniku działania dwu lub wielofunkcyjnych odczynników. Do sieciowania stosuje się:

• aldehyd glutarowy

• tetrazowaną benzydynę

• di izocyjaniany

• diimidoeten

Czasem enzymy są sieciowane z innymi białkami tj. albumina, żelatyna co może zapobiegać obniżeniu aktywności i stabilności. Metoda sieciowania często jest używana w kombinacji z innymi metodami np. w celu stabilizacji enzymów im mobilizowanych metodą fizycznej adsorpcji.

31. Immobilizowanie enzymów - kowalencyjne wiązanie z nośnikiem

Cząsteczka enzymu połączona kowalencyjnie z nośnikami ma ograniczone możliwości zmian konformacyjnych prowadzących do denaturacji i inaktywacji. Jednocześnie może pełnić funkcję katalityczną jeżeli te połączenia nie dotyczą grup funkcyjnych a kontaktowych i gdy nie zakłócają struktury centrum katalitycznego i allosterycznego.

Jako nośnik stosuje się:

• Różnego typu żele

• Naturalne i sztuczne polimery.

Używany materiał musi być:

• Stabilny chemicznie i mechanicznie w warunkach procesu przebiegającego w reaktorze;

• Posiadać grupy funkcyjne odpowiednie do związania enzymu.

Najczęściej używane są:

• Liczne polisacharydy np. agarowe, dekstran, skrobia, celuloza zawierające wiele hydroksylowych reszt wykorzystuje się do wprowadzenia licznych grup wiążących enzym

• Syntetyczne polimery np. nylon, poliakrylonitryla np. orlon, poliestry

• Liczne nieorganiczne nośniki o dobrych właściwościach mechanicznych tj. różne rodzaje szkła, ziemia okrzemkowa, bentonit i inne materiały (po ich odpowiedniej aktywacji)

32. Na czym polega immobilizacja w układach dwufazowych?

W dwufazowych układach enzym jest utrzymywany w jednej z faz, a produkt reakcji może być usunięty z reaktora z drugą fazą. Wykorzystywane są dwufazowe układy organiczno - wodne oraz wodno - wodne.

Układ organiczno-wodny jest stosowany do przemian związków hydrofobowych np. steroidów. Enzym znajduje się w fazie wodnej, a substraty i produkt w fazie organicznej. Rozpuszczalniki organiczne dobiera się pod kątem rozpuszczalności substratu i produktu oraz wpływu na enzym, który może ulegać denaturacji an granicy faz, szczególnie przy gwałtownym mieszaniu. Granice faz stabilizowane są przez dodanie do układu zw. powierzchniowo czynne i (?) jonowe.

Układ wodo - wodny powstaje w wyniku mieszania z nikompatybilnych (niemieszalnych, niezdolnych do dopasowania się) polimerów. Enzym znajduje się w jednej z faz. Międzyfazowe napięcia w tym systemie są bardzo małe a ilość energii niezbędna do utworzenia emulsji niewielka, stąd nieznaczny (w porównaniu z innymi metodami) stopień inaktywacji enzymu.

33. Dlaczego podczas izolowania i oczyszczania enzymów po każdym etapie oznacza się efektywność enzymu i zawartości białka?

Izolując i otrzymując enzymy kontrolujemy stopień oczyszczenia enzymów i wydajność procesu po każdym etapie. Możemy w ten sposób zweryfikować przydatność wybranych metod i technik oraz ocenić przydatność poszczególnych etapów. Informacje uzyskujemy używając w oczyszczonym preparacie efektywność enzymu i zawartość białka. Na podstawie uzyskanych wyników można wywnioskować o efektywności etapu, o selektywności , o zachowaniu wobec enzymu i wydajności. Miarą efektywności etapu jest wskaźnik oczyszczenia informujący ile razy wzrosła podczas tego etapu aktywność właściwa oczyszczonego enzymu. Na I-szych etapach wskaźnik oczyszczenia nie powinien być niższy od wartości 3. Straty enzymu mogą być spowodowane jego inaktywacją. Jeżeli jej skutki są niewielkie mówimy o dobrej zachowawczości etapu. Kolejną przyczyną strat może być utrata części enzymu we frakcjach odrzuconych na danym etapie. Większa część enzymu we frakcji zebranej = dobra selektywność etapu. Wydajność etapu mierzona w % zachowanej aktywności enzymatycznej zależy od jego selektywności i zachowawczości. Gdy jest niska (<80%) należy ustalić, który z tych czynników jest przyczyną.

W ocenie przydatności etapów oczyszczania bierzemy też pod uwagę:

• Pracochłonność

• Koszt

• Możliwość powiększania skali procesu

• Postać i trwałość pozyskiwanych procesów [tu o możliwości uniknięcia kłopotliwych operacji międzyetapowych lub stabilność w przypadku gdy na określonym etapie przerywamy preparatykę np. w celu akumulacji materiału]

34. Ekstrakcja

Jest to przeprowadzenie enzymu w formę rozpuszczalną. Kryterium to obecność enzymu w suprenatacie po wirowaniu przy 105000 g przez 1,5 - 2 h.

Enzymy występujące w cytoplazmie i przestrzeni komórkowej. Wiele z nich łatwo przechodzi do rozcieńczonych roztworów elektrolitu o pH 4-8. Stosując odpowiednie pH i stężenie elektrolitu można stosować proste wirowanie homogenatu.

Gdy enzymy są we frakcji subkomórkowej lub są związane z błonami komórkowymi skuteczność ekstrakcji podnosi uprzednie przeprowadzenie materiału w proszek acetonowy.

Do ekstrakcji stosuje się też: odczynniki osłabiające interakcje enzymu z błonami poprzez oddziaływanie hydrofobowe elektrostatyczne oraz mostki utworzone przy udziale metali.

Najczęściej wykorzystuje się w tym celu:

• Alkalizację roztworów (pH 9-11)

• Elektrolity o dużym stężeniu

• Związki cheltujące

• Rozpuszczalniki organiczne

• Detergenty tj. butanol, etanol, sole kw. Żółciowych; triton -X-100, SDS

Np. *Mitochondrialna dehydrogenaza bursztynianiowa najłatwiej ulega ekstrakcji przy pH 10-12

*Elastaza z granulocytów w buforze zawierającym KCl lub w roztworze mocznika zbuforowanego przy pH 8,7 i zawierającego 0,5%Tweenu 80

E + S

ES

E + P

+

I

ES

brak reakcji

K_I

E

ES

E + P

+ I

EI

K_I

+ S

+ I

+ S

K_I

E + P

ESI

E

ES

E + P

+ S

+ I

K_I

E + P

ESI

V

[°C]

stężenie substratu [S]

szybkość reakcji [V]

---