64778 skanuj0009

/la da nie aktywności dehydrogenaz osadu czynnego

(Przygotowanie próbki do badań. Odwirować 50-ml (do dwóch probówek wirówkowych po 25 ml) próbkę f ścieków z osadem czynnym przy 1000-2000 obr/tnin przez 5 min. i zdekantować ciecz nadosadową Do każdej probówki wirówkowej dodać 25 ml wody buforowej i odwirować. Czynność tę powtórzyć. Po odwirowaniu próbki zdekantować ciecz nadosadową, a do osadu dodać 25 ml wody buforowej i wymieszać. Następnie zawartość probówek wirówkowych przelać do kolbki i użyć do oznaczenia aktywności dehydrogenaz. Przygotowanie roztworu siarczynu sodowego 0.36%. W kolbie miarowej o pojemności 50 ml rozpuścić 0,13 g siarczynu sodowego wodą bidestylowaną i wymieszać. Roztwór przygotowywać każdorazowo bezpośrednio przed oznaczaniem.

Oznaczanie aktywności dehydrogenaz.

•    do siedmiu probówek z doszlifowanymi korkami wlać po 5 ml buforu Tris-HCI oraz po 5 ml przygotowanej próbki osadu czynnego.

•    do sześciu probówek dodać po 2 ml TTC, a do siódmej probówki 2 ml wody buforowej (kontrola).

•    do dwóch probówek dodać po 2 ml roztworu glukozy (substrat I), do kolejnych dwóch 2 ml roztworu fenolu (substrat II), a kolejnych dwóch po 2 ml wody buforowej (oddychanie endogenne). PROBÓWKI PODPISAĆ !!!

•    do wszystkich siedmiu probówek dodać 1 ml roztworu siarczynu sodowego i próbki lekko wymieszać.

•    inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut. Reakcję przerwać przez dodanie do każdej probówki po jednej kropli kwasu siarkowego.

•    do wszystkich siedmiu probówek dodać po 10 ml alkoholu n-butylowego, dokładnie wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 minut.

•    pobrać po 5 ml ekstraktu butanolowego i wirować w wirówce przy 6000 obr/min przez 5 minut. Po odwirowaniu zdekantować kolejno ciecz nadosadową do czystych probówek.

•    oznaczyć absorbancję z 6 pierwszych probówek przy długości fali 490 nm, stosując jako kontrolę próbkę z siódmej probówki (bez dodatku TTĆ). W przypadku zmętnienia próbki po zdekantowaniu próbkę lekko ogrzać w łaźni wodnej do uzyskania klarownej cieczy.

Obliczanie wyników oznaczania. Aktywność dehydrogenaz dla próbek z glukozą, fenolem i bez substratu (X) obliczyć w pmolach na 1 mg białka wg wzoru:

ax 200

X =-------------

5 x Bb

gdzie:

a = średnia zawartość TF w dwóch równoległych próbkach osadu o objętości po 5 ml, odpowiednio z glukozą,

fenolem lub bez dodatku substratu, pmole

Bb = zawartość białka bakteryjnego, w mg/ml

200 = współczynnik przeliczeniowy z objętości 5 ml na łOOOml,

5    = współczynnik przeliczeniowy z objętości 10 ml na 50 ml alkoholu n - butylowego

za aktywność jednostkową należy przyjąć powstanie w warunkach testu 1 umole TF/mg białka)