CAM00469 (2)

25?

stężeń mimo, że ich pojemność próbkowa mała. Wynika to z tego, że stężenia subst w objętości fazy ruchomej są większe niż w kolumnie o większej średnicy Objętości fazy ruchomej    odpowiadające

poszczególnym pikom są więc dużo mniejsze niż wielkości próbek, kolumny o małych średnicach ze względu    na    możliwość

chromatografowama niewielkich próbek nic są przydatne do rozdzielania substancji w celu ich dalszego wykorzystania. Wybór kolumny jest uwarunkowany 1 składem próbki,2 ilością próbki^cclcm rozdzielania. Wypełnienia kolumn ze względu na wysokie ciśnienia stosowane w HPLC i szybki przebieg procesów istotne znaczenie ma rozmiar i kształt ziaren wypełnienia ziarna o małej średnicy 3-lOum.Ziama mniejsze powodują zbyt duże opory przepływu fazy ruchomej Drobnoziarniste wypełnienie kolumny zapewnia krótką drogę dyfuzji cząsteczek subst chromatografowanej do wnętrza ziaren dzięki czemu przy względnie dużych prędkościach fazy ruchomej uzyskuje się wysoka sprawność kolumny Właściwości kinetyczne sorbentu są tym lepsze im cieńsza jest warstw a aktywna. Ziarna o wąskiej frakcji sitowej dają opory przepływu , które nie wymagają zbyt wysokiego ciśnienia tłoczenia fazy ruchomej. Stosowane są dwa typy wypełnień a) na bazie krzemionki, b)na bazie żywic porowatych Często stosuje się wypełnienia kolumn z grupami: 1 niepolamyrni - stosowane w chrom w odwróconym układzie faz (RP) Duże znaczenie mają fazy modyfikowane łańcuchami alkilowymi Modyfikację przeprowadza się organochlorosilanami Podstawienie grup alkilowych lub grupy fenylowej nadaje sorbentów i charakter hydrofobowy Najczęściej związane rodniki alkilowe posiadają 2 , 8 ,18 at C w cząsteczce Polamość faz związany ch maleje wraz ze wzrostem dl łańcucha alkilowego 2. Polarnymi stosowane w chrom w normalnym ukł faz Krzemionkę modyfikuję się w reakcji z organochlorosilanami

zawierającymi polarne grupy N02,

chrom jonowymiennej Wymieniacze jonowe czyli jonity są wiclocząst związkami o budowie jonowej

zdolnymi do wymiany własnych jonów na jony obecne w roztworze Jonity do| wymiany anionów to amonity a do wymiany kationów to kationity Anonity służą do rozdzielania zw o charakterze kwasowym a kationity o charakterze zasadowym 4 Optycznie

czynnym, <j₀ rozdzielania mieszanin

raccmicznych na enancjomcry **** optycznie czynną stanowią żele krzemionkowe modyfikowane grupami chiralnymi FAZY RUCHOME Fazę ruchoma stanowi jeden rozpuszcza m^ •ub mieszanina dwóch, tizccji rozpuszczalników Rozpuszczalniki stosowane w HPLC powinny dobrze

(HPLC) Detektor w HPLC powinien się charakteryzować dobrą czułością, niską granicą detekcji, szerokim zakresem liniowości wskazań, małą objętością, nicwraźliwością na zmiany tern i prędkości przepływu fazy ruchomej, niezawodnością działania. Detektory do HPLC można podzielić na dwie grupy I detektory w których następuje pomiar właściwości charakterystycznej dla próbki, 2dctektory w których następuje pomiar różnicowy właściwości wspólnej próbki i fazy ruchomej Detektory UV JLpracujący przy jednej długości fali I 254 nm - wiele substancji absorbuje I promieniowanie o tej dl fali,2 I pracujący w zakresie UV/Vis - z I płynna regulacją długości fali w 9 zakresie 190-600 nm, 3diodę array (z g matrycą diodową) - rejestrują ™ promieniowanie o długości fali w zakresie 190-600 nm co umożliwia ^ zdjęcie całego widma analizowanej * substancji    Detektor    Jyi

sncktrofluorvmetrvcznv Istota detekcji 0 polega na pomiarze intensywności g|| światła o określonej dl fali B emitowanego przez analizowany B związek w wyniku jego pobudzenia.

Jest to detektor selektywny względem substancji wskazujących fluorescencję Detektor refraktometryczny Jest to detektor najbardziej uniwersalny Mierzy on w sposób ciągły różnice we współczynnikach załamania czystego eluentu i eluatu wypływającego kolumny Jest czuły na zmiany tern i ciśnienia. Nic można go stosować w przypadku elucji gradientowej ponieważ jego wskazania zmieniają się wraz ze zmiana składu fazy ruchomej Stosuje sieje do wykrywania węglowodanów, alkoholi i kwasów alifatycznych.    Detektory

elektrochemiczne Najczęściej stosuje się detektory polarograficzne kulomctryczne do wykrywania substancji    organicznych

nieorganicznych. Charakteryzują się one dużą selektywnością i czułością względem niektórych związków' Są one stosowane gł do analizy związków biologicznie czynnych Ograniczeniem ich stosowania jest to, że faza ruchoma musi przewodzić prąd co wymusza stosowanie eluentów zawierających wodę ANALIZA JAKOŚCIOWA można jej dokonać dwoma sposobami Ina podstawie parametrów retencji,2na podstawie    identyfikacji

chromatografowanej substancji innymi metodami fizykochcm Wielkości retencyjne mogą służyć do identyfikacji substancji wchodzących w skład analitu gdyż są one dla nich charakterystyczne w danych warunkach analizy Porównuje się parametry retencyjne uzyskane w identycznych wnrunkach dla analitu i wzorca.    Retencja    pików

niesymetrycznych zmienia się wraz z wielkością zadozowancj próbki Im większa ilość tym czas retencji jest krótszy    Najpewniejszym

rozwiązaniem jest wyznaczanie.