CCF13042012001

Podstawy Biotechnologii Ćwiczenie 2

Opracował Piotr Szweda

Do katalizowania hydrolizy białek często używa się alkalazę, której substancją aktywną jest subtylizyna A (endopeptydaza serynowa), wytwarzana przez bakterie Bacillus licheniformis. Enzym ten hydrolizuje wiązania peptydowe wewnątrz cząsteczki białka i nie przejawia aktywności względem wiązań na N- i C-końcu łańcucha peptydowego. Alkalaza jest enzymem o małej specyficzności, rozszczepiającym wiązania peptydowe pomiędzy resztami różnych aminokwasów. Preparat ten wykazuje największą aktywność w temperaturze 55-60 °C przy pH 8.5. Oporność cieplna wymienionego enzymu maleje w kwaśnym środowisku i przy pH < 4 ulega on inaktywacji już po 30 min ogrzewania w 50 °C, natomiast przy pH < 3 utrata aktywności następuje nawet bez ogrzewania.

W przypadku alkalazy szybką kontrolę stopnia hydrolizy można przeprowadzić rejestrując zmiany kwasowości wywołane (opis do metody pH -stat) rozszczepieniem wiązań peptydowych. Po ich rozpadzie zachodzi wymiana protonu:

- CHR-COOH + H₂N-CHR <-> CHR-COO' + ⁺H₃N-CHR

Stopień hydrolizy oblicza się za pomocą wzoru Olsena (1985), na podstawie ilości roztworu NaOH zużywanego do zobojętniania grup -NH₃⁺ podczas utrzymywania stałego pH procesu.

RCH-NH₃⁺ + OH' -> RCH-NH₂ + H₂0

Stosowanie tego sposobu kontroli stopnia hydrolizy nie jest możliwe w przypadku enzymów działających w kwaśnym środowisku w którym niewiele grup aminowych ma ładunek elektryczny (mała wartość a).

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie zmian stopnia hydrolizy białek w czasie reakcji katalizowanej alkalaza. Każda z grup bada działanie enzymu na białka obecne w innym surowcu lub produkcie żywnościowym.

Dośw, I, Enzymatyczna hydroliza białek mięsa i oznaczanie DH metoda nH-stat

• Do 150 g zmielonego mięsa wołowego, drobiu lub ryby dodać 300 ml wody destylowanej. (Mięso wcześniej zmielić).

• Wprowadzić do zlewki elektrodę pH-metru. ogrzać mieszaninę do 55 °C w łaźni wodnej (wcześniej wlewacie do łaźni przegotowaną ostudzoną wodę destylowaną.) i doprowadzić pH do 8.5, stosując 4 M roztwór NaOH i mieszając zawartość zlewki mieszadłem mechanicznym. Objętość roztworu NaOH zużytego do wstępnej regulacji pH należy zanotować.

• Do prób dodać 1 ml lub 4 ml alkalazy o aktywności 2.4L i natychmiast rozpocząć pomiary pH wykonywane co 5 min (zegary).

• Po każdym pomiarze należy dodać z biurety taką objętość 4 M roztworu NaOH, która spowoduje przywrócenie pierwotnej wartości pH, wynoszącej 8,5. Zanotować objętość zasady dodanej po każdym pomiarze. Podczas pomiarów należy zwrócić uwagę czy zawiesina mięsa nie zakleiła elektrody i w razie potrzeby oczyścić elektrodę.