CIMG4088

Liczbę nowo wyprodukowanych wirionów można określić w stosunku do jednostki objętości płynu, do którego wirus został uwolniony. Określamy wówczas tzw. wirusy pozakomórkowe. Natomiast te cząstki wirusa, które zostały zatrzymane w komórce, określamy jako wirusy wewnątrzkomórkowe. Zarówno zawartość wirusa w płynie, jak i w komórkach można określić różnymi metodami, a postępowanie to określa się terminem mianowanie wirusów.

Określenie miana wirusa ma więc wielorakie znaczenie metodyczne, naukowe i praktyczne, oparte na biologicznej aktywności wirusa. Pozwala na oznaczenie stopnia replikacji wirusa w różnych komórkach, na oznaczenie zawartości wirusa w materiale zakaźnym oraz na ilościowe oznaczenie aktywności w metodach serologicznych, w których określona dawka surowicy (lub innego płynu) zobojętnia określoną dawkę wirusa. Mianowanie wirusa ma bardzo ważne znaczenie w określaniu aktywności szczepionek wirusowych (dawki immuno-gennej).

Mianowanie wirusa można przeprowadzić na każdym modelu biologicznym, w którym dochodzi do odtwarzania wirusa. Można więc wykonać mianowanie na wrażliwych zwierzętach, zarodkach kurzych i w hodowlach komórkowych.

Zasada mianowania jest od wielu lat (niezależnie od usprawnień technologicznych) następująca.

Jeżeli chcemy np. określić miano (zawartość) wirusa w 1 g materiału, to przygotowuje się zawiesinę tego materiału o określonym stężeniu (najczęściej 10%), którą następnie rozcieńczamy w postępie 10-krotnym (10^-1, 10^-2, 10"³ itd.) do prawdopodobnej granicy zawartości wirusa i jedno lub dwa rozcieńczenia powyżej tej granicy. Takie próbki w określonej objętości (np. 0,1 ml) wprowadzamy do wrażliwego układu detektorowego (organizm zwierzęcy, hodowla komórkowa), w którym dany wirus może się replikować. Jeżeli wykażemy np., że wprowadzona 10% zawiesina materiału w objętości 0,1 ml przy rozcieńczeniu 10"⁶ zawiera jeszcze aktywny wirus, to oznacza, że miano jego wynosi 10® cząstek zakaźnych w 1 g badanego materiału (w płynie = 10®/ml).

Posługując się analogicznym postępowaniem, można również wykazać obecność wirusa i jego miano w hodowlach tkankowych, komórkowych i narządowych, w zarodkach, w materiale diagnostycznym itd.

Najszersze zastosowanie przy mianowaniu wirusów znalazły głównie dwie metody. Jedna polega na oznaczeniu dawki zakaźnej dla połowy hodowli komórkowych przy górnym granicznym rozcieńczeniu zakaźnym (tzw. TCID*,), druga - to metoda oznaczania liczby łysinek (plaąues) tworzonych przez wirusa w jednowarstwowej hodowli komórek (PFU - plaąue forming unit). Metody te w postaci licznych technicznych modyfikacji zostały opracowane dla różnych wirusów. Ryciny 11 i 12 ilustrują te zjawiska.

Określenie wartości TCID^ jest oparte na wystąpieniu efektu cytopatycznego w hodowli komórkowej. Analogiem tego jest określenie ID_so (dawka śmiertelna dla 50% wrażliwych zwierząt). Ta ostatnia metoda jest nieco trudniejsza dla oznaczenia i wymaga użycia odpowiedniej liczby wrażliwych zwierząt dla uzyskania wyniku wiarygodnego; najczęściej stosuje się co najmniej 6-10 zwierząt dla każdego rozcieńczenia wirusa. Również w przypadku TCID_S0 jest niezbędne użycie takiej liczby hodowli na każde rozcieńczenie wirusa, która umożliwia poprawne, matematyczne ustalenie rzeczywistej zawartości zakaźnego wirusa.

Ryć. 11. Hodowla makrofagów otrzewnowych myszy linii wsobnej PRI zakażonej wirusem mysiego hepalilis.

Ryc. 12. Łysinki wirusa poliomyelitis na hodowli jednowarstwowej.

Użycie odpowiedniej liczby zwierząt, zarodków, czy też probówek (dołków w mikrotechnice) hodowli komórkowej jest niezbędne do eliminowania odchyleń w pomiarach, jakie mogą wynikać z biologicznej niejednorodności komórek zarówno zwierząt (we wrażliwości indywidualnej), jak i wirusa (niejednakowa zakaźność populacji wirusowych).

Uzyskany wynik każdego mianowania należy ocenić statystycznie. Metoda Reeda i Muencha należy do najczęściej stosowanych. Zasada jej jest następująca.

49