DSC
65 (16)

00    2. Kalcyferole - witaminy D

2.6.1.    Metody biologiczne

Jeszcze czterdzieści iat temu jedyną oficjalnie przyjętą metodą oznaczaj zawartości witaminy D w preparatach farmaceutycznych i produktach spożyć czych była metoda biologiczna z wykorzystaniem szczurów jako zwiera, doświadczalnych. Była to metoda bardzo czuła, umożliwiająca oznaczę^ witaminy D już w ilościach nanogramowych i zapewniała bardzo dóbr* powtarzalność oraz dokładność. Jest szeroko stosowana po dziś dzień do oznaczania zawartości kalcyferoli np. w mleku.

Oznaczanie polega na podawaniu karmy szczurom z wyraźnymi objawami krzywicy, przy czym jednej grupie zwierząt aplikuje się karmę wzbogaconą stopniowo wzrastającymi, znanymi ilościami cholekalcyferolu, a drugiej - kar. mę z dodanym badanym preparatem lub próbką o nieznanym stężeniu witaminy D₃. Ta pierwsza grupa służy jako wzorzec — standard. Po tygodniowej kuracji określone kości (promieniowe i łokciowe) zwierząt są wypreparowywa-ne i poddawane działaniu roztworu azotanu srebra. Srebro gromadzi się w miejscach ze świeżo zdeponowanym wapniem. Miejsca te po ich naświetleniu ciemnieją. W ten sposób, porównując działanie badanego preparatu na odkładanie wapnia w kościach ze standardami, można określić zawartość witaminy D w badanej próbce.

Ze względu na zróżnicowaną aktywność biologiczną witamin D₂ i D₃ w odniesieniu do kurcząt (cholekalcyferol jest co najmniej dziesięciokrotnie aktywniejszy od ergokalcyferolu) stosuje się nieco inną technikę, a mianowicie oznacza się zawartość popiołu (tj. substancji mineralnych) w kości piszczelowej kurcząt rachitycznych i porównuje z takową u kurcząt karmionych dietą wzbogaconą w badany preparat witaminy D. Jest to metoda kosztowna i czasochłonna i z tego powodu rzadko wykorzystywana. Można również stosować testy wzrostowe na zwierzętach.

2.6.2.    Metody fizykochemiczne

Do oznaczania witamin D_z i D₃ można stosować spektrofotometrię w ultrafiolecie (np. przy 264 nm), a także w podczerwieni oraz spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego. Dobre wyniki daje też gazowa i wysoko sprawna chromatografia cieczowa.

Znane są również metody kolorymetryczne, np. w reakcji z trichlorkiem antymonu SbCl₃ witamina D tworzy żółte zabarwienie. Jednakże przeprowadzenie barwnej rekcji z SbCl₃ musi być poprzedzone hydrolizą tłuszczów za pomocą wodno-alkoholowego roztworu KOH, ekstrakcją witamin D z frakcji nie ulegającej zmydlaniu, odparowaniem nadmiaru rozpuszczalnika i selektywnym rozdziałem przy użyciu metod chromatograficznych od ubocznych substancji towarzyszących.

Możliwe jest również pominięcie procedury zmydlania, jeśli próbkę potraktować bezwodnikiem maleinowym w celu wyeliminowania (runa-izomerów, ale w razie obecności w próbce np. izotachisteolu wyniki mogą być mocno zawyżone.

Izomeryzację witaminy D do izotachisterolu można wykorzystać do kolorymetrycznego oznaczania tej witaminy w preparatach farmaceutycznych, a więc w materiałach o dużym stężeniu aktywnej substancji.

Warto też wspomnieć o możliwości fluory metrycznego oznaczania witaminy D. Metoda ta polega na przeprowadzeniu reakcji tej witaminy z fluoryzującą substancją i pomiarze intensywności fluorescencji powstałego produktu. Wiadomo np., że mieszanina bezwodnika octowego i kwasu siarkowego w obecności witaminy D w roztworze powoduje fluorescencję tego roztworu po odpowiedniej aktywacji światłem o ściśle określonej długości fali. Czułość tej metody jest porównywalna z czułością metody kolorymetrycznej z SbCl₃. Uboczne substancje towarzyszące przeszkadzają we właściwym oznaczeniu i powinny być przed pomiarem usunięte. Metoda fluorymetryczna nie zyskała szerszej akceptacji.

2.7. Występowanie w przyrodzie

i zawartość w produktach spożywczych

Wiadomo, że naturalne źródła witamin D są bardzo ograniczone i w większości przypadków raczej ubogie, a ponadto charakteryzują się dużymi wahaniami zawartości tych witamin, np. w zależności od sezonu (Lato, zima). Ryby morskie — śledzie, łososie, dorsze i sardyny — a zwłaszcza trany (tłuszcze wątrobowe tych ryb) są bardzo dobrymi czy wręcz bogatymi źródłami cholekalcyferolu, natomiast inne produkty spożywcze pochodzenia zwierzęcego — jaja (szczególnie żółtka), mięso cielęce i wołowe, mleko i masło zawierają niewielkie ilości witaminy D₃, przy czym w okresie letnim jej stężenie może być kilkakrotnie większe niż jesienią i zimą. Rośliny albo nie zawierają wcale witamin D, albo zawierają je w znikomych ilościach. Owoce i orzechy są całkowicie pozbawione witamin D, a oleje roślinne charakteryzują się niską zawartością prowitamin D. Jak z tego widać, zaspokojenie potrzeb ludzi — określane na 10-12 /tg dziennie — nie jest wcale łatwe, mimo wielkiej aktywności biologicznej witamin D. W tej sytuacji wzbogacanie produktów spożywczych, a zwłaszcza mleka, margaryny i masła, jest jedyną racjonalną metodą pełnego pokrycia zapotrzebowania ludzi na witaminę D.