g (162)

20.    Biblioteki llnklng (sprzęgające):

Nie reprezentują całości genomu, aie pewną frakcję, którą stanowią sekwencje otaczające miejsce trawienia enzymu rzadkotnącego: Procedura przygotowania biblioteki: wychodzimy od DNA genomowego, które na początku trawimy częściowo enzymem gęsto tnącym. W wyniku trawienia powstaje wiele małych kawałków. Produkty trawienia cyrkularyzuje się w obecności odcinka DNA, który zawiera marker selekcyjny. Produkty llgaęjł są cząsteczkami kolistymi ze spułapkowanym odcinkiem DNA zawierającym marker selekcyjny. Produkty ligacji poddaje się trawieniu enzymem rzadkotnącym, w efekcie czego otrzymuje się małą frakcję cząsteczek zlinearyzowanych. Fragmenty zlinearyzowane będą klonowane w wektorze fagowym lub kosmidowym który zawiera komplementarny marker selekcyjny do wcześniej stosowanego. Po wysianiu biblioteki otrzymamy klony zawierające marker selekcyjny (zligowany) otoczony przez sekwencje flankujące miejsce trawienia. Użycie w technice chrom osom e jumping bibliotek typu jumping i linking pozwala wyeliminować trudności związane z sekwencjami nlekłonowalnyml i powtórzonymi. Posiadanie zidentyfikowanych ciągów klonów skaczących i sprzęgających pozwala za Ich pomocą wrócić do biblioteki standardowej I wyizolować kompletne sekwencje.

21.    Drożdżowe systemy dwu hybrydowe:

a)    na podstawie tej techniki możemy mieć informację o sekwencji DNA (O) (mamy tylko informację o genach kodujących białka)

b)    czy DBD wiąże się z przynętą (1) (ekspresja wektora prowadzi do powstania białka fuzyjnego -jedna jego część odpowiada przynęcie, a druga - domenie DBD)

c)    czy AD wiąże się z zdobyczą (1) (PRAY-AD)

d)    czy między przynętą a zdobyczą wiązanie jest kowalencyjne (O) (oddziaływanie nłekowal.)

e)    wykorzystanie białka zawierającego domenę AD (domenę aktywującą) I wiążącego się z przynętą (O) (AD wiąże się z Prey czyli częścią rekombinantową)

f)    wykorzystanie białka zawierającego domenę DBD (wiążącą DNA) i będącego przynętą (O) (to białko nie jest przynętą tylko się z nią wiąże)

Oddziaływanie między DNA a DBD ma charakter oddziaływania niekowaiencyjnego natomiast oddziaływanie między DBD a wabikiem oraz oddziaływanie zdobycz-domena aktywująca (PREY - AD) maja charakter kowalencyjny.

23.    W metodzie real time PCR współczynnik C_Tto:

a)    współczynnik C_T określa cykl (nr cyklu) w którym wartość fluorescencjl przekracza wartość progową (O) (określa cykl w którym wartość fluorescencjl osiąga a nie przekracza wartość progową)

b)    wartość ta daje informacje o tym ile kopii docelowej sekwencji dostarczono z matrycą do reakcji (1)

W metodzie tej wykorzystujemy zależność, jaka istnieje między liczbą kopii docelowej sekwencji w wyjściowym preparacie matrycy a Ilością amplifikowanego produktu w danym cyklu - im więcej docelowej sekwencji tym silniejszy produkt na danym etapie PCR. Technika ta bazuje na obserwacji poziomu amplifikaęji poprzez śledzenie natężenia fluorescencjl odpowiadającej amplifikowanemu produktowi (które jest pochodną stężenia produktu). Stosuje się różne badania dla powiązania Ilości produktu z fluorescencją np. zastosowanie barwnika CYBERGreen łub sondy TaąMan.

24.    Pirosekwencjonowanie: opiera się na wykorzystaniu 3 reakcji: syntezy DNA - primer pod wpływem polimerazy będzie miał przyłączony nukleotyd w związku z tym będzie wydłużał się on o ten nukleotyd a jako produkt uboczny powstanie płrofosforan który jest wykorzystywany do detekcji zdarzenia Inkorporacji (włączenia nowego nukleotydu). W kolejnej reakcji którą katalizuje enzym sulfunylaza, płrofosforan ulega konwersji w ATP. ATP jest konsumowane przez lucyferazę w reakcji utleniania lucyferyny, a produktem ubocznym tej reakcji jest błysk światła, który może być zarejestrowany przez odpowiedni detektor ( mamy do czynienia z chemiczną luminescencją). Jeżeli podczas przebiegu procesu podany jest właściwy nukleotyd - zgodny z matrycą, to jest on włączany, ale istnieje konieczność usunięcia nadmiaru substratu - nukłeotydów niewbudowanych oraz tych nukleotydów, które były niezgodne z matrycą w danym momencie.

25.    W toku tostu opóźnienia w żelu (band shłft assay):

a)    białko oddziałujące z DNA zabezpiecza przed trawieniem przez DNazę Z (1)

b)    dodanie DNA nłewyznakowanego ma konkurować z DNA wyznakowanym o wiązanie z białkiem i powoduję że sygnał jest słabszy (1)

c)    pytanie o tożsamość oddziałującego z DNA białka

d)    superopóźnienie migrującego kompleksu osiągamy poprzez dodatek współpracującego z sondą ollgonukleotydu (O)