TRANSFORMACJA ROŚLIN
1907, Science, Smith i Townesend
 przyczyną powstawania tumorowatych narośli na szyjce
korzeniowej (tumorogeneza, rak szyjki korzeniowej) niektórych
gatunków roślin jest Agrobacterium tumefaciens  wolno
żyjąca bakteria glebowa gram-ujemna lub Agrobacterium
rhizogenes, który wywołuje powstawanie obfitej masy korzeni
włosowatych.
Oba gatunki należą do rodziny Rhizobiaceae, do której należą
również rizobia mające zdolność wchodzenia w symbiozę
z roślinami motylkowatymi.
Kluczowym odkryciem dla zrozumienia mechanizmu
powstawania tumorów było stwierdzenie obecności dużego
pozachromosomalnego DNA w formie plazmidu w komórce
bakterii.
Plazmid Ti (tumor inducing plasmid)  180-220 tys. par zasad,
A. tumefaciens
Plazmid Ri (roots inducing plasmid)  A. rhizogenes
Skutkiem infekcji jest przeniesienie fragmentu plazmidu Ti
do komórki roślinnej, w wyniku podziałów tej komórki
powstaje tumorowata narośl.
Fragment przenoszony do komórki to T-DNA (transfered DNA)
 około 20 tys pz, jest włączany do genomu jądrowego
komórki roślinnej.
1
Konsekwencją włączenia T-DNA do genomu komórki roślinnej
jest przestawienie jej metabolizmu na potrzeby patogena.
Transformowane komórki roślinne:
1. rozpoczynają nieograniczoną biosyntezę znacznych ilości
auksyn i cytokinin, które stymulują niekontrolowaną
proliferację i powstanie tumoru.
2. dodatkowo wytwarzane są metabolity (pochodne
aminokwasów, głównie argininy) np. oktopina lub nopalina
(opiny), które wykorzystywane są przez bakterie jako z
ródło
węgla i azotu.
Unikalny w przyrodzie przykład naturalnego przenoszenia
genów pomiędzy światem bakterii i roślin.
Odkrycie zasady przenoszenia informacji genetycznej
z bakterii do komórek roślinnych spowodowało konsekwencje
dla dalszego rozwoju biotechnologii roślin.
2
MECHANIZMY MOLEKULARNE
Plazmidy stanowią bardzo ważny dla życia bakterii, dodatkowy
pozachromosomalny nośnik informacji genetycznej, który
decyduje o dużej ich zmienności i potencjale adaptacyjnym.
Plazmid Ti występuje w komórkach Agrobacterium w niewielkiej
liczbie kopii (1-2), może być przenoszony z jednej komórki
do drugiej na drodze koniugacji.
Plazmidy Ti zawierają geny biosyntezy i katabolizmu opin,
które stały się podstawa klasyfikacji szczepów bakterii.
Na ogół plazmidy Ti zawierają jeden region T-DNA, jedynie
szczepy oktopinowe A. tumefaciens posiadają 2 odrębne
odcinki: TL-DNA i TR-DNA.
U różnych szczepów A.t. występują identyczne onkogeny:
1. Gen syntezy cytokininy:
ipt  gen izopentynylotransferazy
2. Geny biosyntezy auksyn:
iaaM  gen monooksygenazy tryptofanu
iaaH  gen hydrolazy indoliloacetoamidu
3
Region T-DNA jest ograniczony sekwencjami granicznymi
(LB i RB), które tworzą odwrócone powtórzenia 25 pz
i są przenoszone do komórki roślinnej wraz z genami
w obszarze T-DNA.
Za proces przenoszenia T-DNA odpowiedzialne są:
1. geny zlokalizowane w REJONIE WIRULENCJI (vir) plazmidu,
2. geny chv na chromosomie bakteryjnym.
Geny z regionu vir są zgrupowane w operony oznaczone
literami od A do R, z których każdy koduje od jednego
do kilku genów.
Etapy transferu T-DNA z A. tumefaciens do komórki roślinnej:
1. Chemotaksja  uwolnienie podczas zranienia rośliny
pochodnych fenolowych i cukrów, a także zakwaszenie
środowiska, co prowadzi do indukcji genów regionu
wirulencji (vir) plazmidu Ti,
2. Adhezja - kontakt komórki bakteryjnej z komórką roślinną.
W procesie tym biorą udział adhezyny bakteryjne
(polisacharydy zewnątrzkomórkowe, fibrylle celulozowe
oraz białko zwane rhicadhezyną), a także adhezyny
roślinne
(np. zmodyfikowane pektyny, białka wiążące cukry -
lektyny).
3. Rozpoznanie prawej sekwencji granicznej i przecięcie jednej
nici T-DNA ( dolnej ), przyłączenie białka virD2 do końca 5
nici T,
4. Opłaszczenie nici ssDNA przez białka virE2,
5. Transport przez błony komórek,
4
6. Transport do jądra komórkowego gospodarza.
białko vir charakterystyka
virA Ulega konstytutywnej ekspresji, tworzy kompleks
z virB, który uruchamia ekspresję pozostałych genów
wirulencji. Kompleks ten ulega indukcji pod wpływem
roślinnych substancji fenolowych (acetosyringon,
allkohol koniferolowy, kwas ferulowy, inne prekursory
lignin). Białko virA zlokalizowane jest w błonie bakterii
i działa jako receptor substancji fenolowych.
virB Ulega konstytutywnej ekspresji, jest uruchamiane przez
virA i działa jako aktywator transkrypcji.
virD1 Wycinanie z plazmidu Ti jednoniciowego odcinka DNA
(ssDNA), aktywność topoizomerazy (rozplecenie helisy
DNA).
virD2 Wycinanie z plazmidu Ti jednoniciowego odcinka DNA,
aktywność endonukleazy (przecięcie dolnej nici
obszaru T-DNA od strony 5 , bliżej RB), umożliwia
również transport nici T do jądra komórki roślinnej
dzięki posiadaniu tzw. sygnału lokalizacji jądrowej
(NLS).
virC1 Powinowactwo do specyficznej sekwencji
wzmacniającej E o nazwie overdrive, warunkującej
optymalne wytworzenie ssDNA i umożliwiającej
rozpoznanie przez virD2 prawej sekwencji granicznej.
virE2 Białka te opłaszczają ssDNA (funkcja ochronna
podczas transportu przed działaniem enzymów
nukleolitycznych), posiadają również domenę NLS.
virB virB4, virB8, virB9, virB10, virB11 są zlokalizowane
w błonie bakteryjnej i pośredniczą w transporcie nici T.
virF Działa w komórce roślinnej, bierze udział w aktywacji
systemu proteolitycznego komórki gospodarza
virH Detoksyfikacja: VirH1  oksydaza typu P450, VirH2
- demetylaza fenolowych induktorów np.
acetosyryngonu (AS)
virM, L, K, Inne białka vir o mniej istotnych funkcjach
J, F, P, R,
D3, D5, E3
5
Transformacja roślin
- poza odcinkiem T-DNA żadna inna część plazmidu Ti
nie jest przenoszona do komórki roślinnej,
- żaden z genów regionu T-DNA nie uczestniczy
w przenoszeniu tego fragmentu i nie jest niezbędny
do efektywnej transformacji.
Skonstruowano tzw. szczepy rozbrojone.
Bakterie te zawierają plazmidy z usuniętym oryginalnym T-DNA,
a zachowują wszystkie niezbędne funkcje do przeniesienia
 nowego T-DNA tzn. region vir i geny chv, dzięki czemu można
przenosić zamiast natywnego T-DNA dowolne geny,
bez wywoływania efektów ubocznych tzn. narośli lub korzeni
włosowatych.
Układ ten nazwano binarnym:
plazmid binarny - nie ma regionu vir,
a w T-DNA są nowe geny,
plazmid pomocniczy - rozbrojony plazmid Ti
(bez T-DNA, z regionem vir).
WEKTOR = przewoz
nik
Konstrukcja genowa  odpowiednio przygotowany odcinek
T-DNA metodami inżynierii genetycznej.
Wyprowadzenie roślin z komórek transformowanych nie różni
się zasadniczo od typowej procedury regeneracji, wyłączając
przypadki tzw. zmienności somaklonalnej.
Rośliny transgeniczne zregenerowane tą droga poza nową cechą
związaną z wprowadzonym nowym genem, niczym nie różnią się
od materiału matecznego.
6
Eksplantat: nasiona,
Wytworzenie kalusa
mikroskrawki liściowe,
liścieniowe
Dojrzała
roślina
kokultywacja
Selekcja transformantów
Regeneracja roślin
Selekcja
Selekcja tkanki transgenicznej polega na dodaniu do pożywki
odpowiedniego czynnika selekcyjnego (antybiotyk, herbicyd).
Niestransformowane komórki nie rozwijają się lub zamierają.
Gen fosfotransferazy neomycynowej nptII  odporność
na antybiotyki aminoglikozydowe np. neomycyna,
kanamycyna, genetycyna. Fosfotransferaza inaktywuje
te antybiotyki na drodze fosforylacji.
Gen fosfotransferazy higromycyny  hpt
Gen acetylotransferaza fosfinotrycyny bar  odporność
na herbicyd Basta lub Bialofos (detoksyfikacja
fosfinotrycyny). Fosfinotrycyna (czynnik aktywny tych
herbicydów) hamuje syntazę glutaminową.
7
W wyniku przerwania łańcucha przyswajania azotu
nagromadza się w komórkach toksyczny amoniak.
Geny reporterowe
Są odpowiedzialne za kodowanie produktów, które łatwo
wykrywa się prostymi technikami enzymatycznymi lub
histochemicznymi.
Gen uidA - kodujący �-glukuronidazę (GUS).
Enzym ten ma zdolność rozkładu wiązania
glukuronidowego, które występuje
w syntetycznym substracie x-glukuronidzie.
W wyniku jego rozpadu powstaje glukuronid
i indoksyl, który pod wpływem tlenu dimeryzuje
do niebieskiego barwnika indygo.
Gen LUC - lucyferaza
Gen GFP
Gen YFP
GEN RFP
8
METODY WPROWADZANIA GENÓW
I. Transformacja pośrednia:
1. Transformacja z użyciem Agrobacterium tumefaciens
lub rhizogenes,
- z wykorzystaniem kultur in vitro,
- bez wykorzystania kultur in vitro.
II. Transformacja bezpośrednia:
1. Bezpośrednia transformacja protoplastów lub komórek
(rzadziej) za pomocą elektroporacji lub glikolu
polietylenowego (PEG),
2. Mikrowstrzeliwanie cząsteczek metali pokrytych DNA.
Transformacja bezpośrednia
�% Transformacja protoplastów  polega na umieszczeniu
protoplastów w roztworze plazmidowego DNA
i spowodowanie jego przeniknięcie do wnętrza komórki.
Dodanie PEGu powoduje zmianę właściwości fizyko-
chemicznych błony komórkowej  zostaje zwiększona
jej półprzepuszczalność.
Umieszczenie protoplastów w zmiennym polu
elektrycznym o określonej długości trwania i częstości
mikroimpulsów powoduje powstanie w błonie komórkowej
mikroporów.
Gatunki jednoliścienne: kukurydza, pszenica, jęczmień, ryż
�% Mikrowstrzeliwanie (particle bombardment)  polega
na wprowadzeniu cząsteczek metali pokrytych DNA,
z bardzo dużą prędkością (rzędu kilkuset metrów/s)
do komórek.
Prędkość tę uzyskuje się w specjalnie skonstruowanych
aparatach. Czynnikiem przyspieszającym jest proch
strzelniczy (rzadziej) lub hel. Po raz I wykorzystano
tę metodę w 1987 r do transformacji cebuli.
Gatunki jednoliścienne: wszystkie gatunki zbóż, trzcina
9
cukrowa i tulipan
Gatunki roślin o nowych cechach u odmian transgenicznych
dopuszczonych do uprawy komercyjnej przez przynajmniej
jedną agendę (OECD Product Database)
Gatunek Nowa cecha
Burak
odporność na herbicydy abc
cukrowy
odporność na herbicydy abc, męska sterylyność,
Rzepak
zmieniony profil kwasów tłuszczowych
Rzepik odporność na herbicyda
Papaja odporność na wirus
Cykoria męska sterylność, odporność na herbicydb
Cukinia odporność na wirus
Goz
dzik kolor kwiatów, przedłużona trwałość
Soja odporność na herbicydya,b
Bawełna odporność na motyle, odporność na herbicyda,c,d,
Len odporność na herbicydyd
Pomidor zmienione dojrzewanie, odporność na motyle
Tytoń odporność na herbicydyb,c
odporność na stonkę ziemniaczaną, odporność na wirus,
Ziemniak
odporność na herbicydb
odporność na herbicydya,b,c,d, odporność na omacnicę
Kukurydza
prosowiankę, męska sterylność
Ryż odporność na herbicydb
Pszenica tolerancja na imidazolinon
a
- glifosat
b
- fosfinotrycynę
c
- herbicydy oxynilowe
d
- herbicydy sulfonomocznikowe
OECD - Organisation for Economic Co-operation and Development
10
Liczba odmian transgenicznych wprowadzonych do uprawy
u poszczególnych gatunków roślin
goz
dzik
cykoria
18
bawełna
len
1
18
kukurydza
4
rzepak
papaja
ziemniak
1
ryż
5
1
soja
5
2
cukinia
2
1
3
7
burak cukrowy
wg. OECD Biotech. Product Database
pomidor
Najważniejsze problemy merytoryczne, ważne dla rozwoju
transgenicznej hodowli roślin:
1. Warsztatowe
poznanie zasad gwarantujących optymalną ekspresję transgenów
dla poszczególnych cech (miejsce insercji, jakość elementów
konstrukcji, stabilność ekspresji, warunki wzrostu pokolenia T0,
wyciszanie ...),
rozwój metodyki transformacji (miejscowo-specyficzna rekombinacja,
usuwanie genów markerowych, znaczący wzrost wydajności
i prostoty transformacji),
czy niezależne wprowadzenie kilku różnych transgenów do tego
samego biorcy rodzi nowe uwarunkowania w ich ekspresji,
opracowanie wydajnych metod transformacji organelli komórkowych.
2. Ogólne
jak wpłynie na wartość diety powszechna obecność określonego
białka nieżywieniowego w jej składzie.
11
Odpowiedzi na pytanie:
Czy to prawda czy nie, że zwykłe pomidory nie zawierają genów
podczas gdy genetycznie zmodyfikowane (GM) tak?
wyniki ankiety prawda nieprawda nie wiem
"Eurobarometr" [%] [%] [%]
Irlandia 1996 28,5 20,2 51,3
Irlandia 1999 36,8 22,2 41,0
Przeciętnie
30,6 35,8 33,6
w Europie 1996
Przeciętnie
34,8 35,1 30,1
w Europie 1999
Odpowiedzi na pytanie:
Czy to prawda czy nie, że osoba spożywająca genetycznie
zmodyfikowane owoce może stać się również genetycznie
zmodyfikowanym organizmem?
Nie
Wyniki ankiety Prawda Nieprawda
wiem
"Eurobarometr" [%] [%]
[%]
Irlandia 1996 22,5 33,8 43,7
Irlandia 1999 25,1 29,5 45,4
Przeciętnie
23,2 48,6 28,3
Europa 1996
Przeciętnie
23,7 42,3 34,0
Europa 1999
12
Regulacja Parlamentu Europejskiego EC Nr 258/97 z dnia
27.01.1997 r włącza żywność transgeniczną do kategorii
tzw. nowej żywności (novel food).
Pojęcie to obejmuje następujące grupy żywności
modyfikowanej genetycznie
(WHO 1996):
żywność i jej składniki zawierające lub będące organizmami
modyfikowanymi genetycznie (GMO),
żywność i jej składniki produkowane z GMO, lecz nie zawierające
GMO,
żywność i jej składniki zawierające nowe lub celowo
zmodyfikowane pierwotne struktury molekularne,
żywność i jej składniki składające się lub izolowane z roślin
i zwierząt hodowlanych i rozmnażanych nietradycyjnymi
metodami, a jednocześnie nie posiadające własnej historii ich
bezpiecznego stosowania do celów spożywczych.
Pod pojęciem  novel food kryją się także inne
kategorie żywności, nie mające związku z GMO.
13
Wartość pokarmowa pasz pochodzących
z genetycznie zmodyfikowanych organizmów
Doświadczenia strawnościowe i żywieniowe przeprowadzono z:
� brojlery (kukurydza Bt),
� nioski (kukurydza Bt, kukurydza Pat),
� trzoda chlewna (kukurydza Bt, kukurydza Pat,
burak cukrowy Pat, soja),
� owce (kiszonki z kukurydzy Bt i kukurydzy Pat),
� bukaty (kiszonka z kukurydzy Bt),
� krowy z przetoką (kiszonka z kukurydzy Bt).
Nie stwierdzono dotychczas różnic istotnych w wartości
odżywczej między paszą z roślin nietransgenicznych
i transgenicznych,
Wykazano tzw. równoważność mieszańców transgenicznych,
W próbkach tkanek zwierząt nie wykryto zrekombinowanego
DNA roślin.
G. Flachowsky & K. Aulrich; J. Annimal Feed Sci 2001; 181-193
Koncepcja równoważności składnikowej
" Porównanie pomiędzy organizmem genetycznie
modyfikowanym i jego najbliższym tradycyjnym
odpowiednikiem
" Identyfikacja zamierzonych i niezamierzonych różnic
na których powinno się skupić ustalanie
bezpieczeństwa
Kuiper H.A. 2001 The Plant Journal 27
Enzym PAT (acetylotransferaza fosfinotrycyny) acetyluje
cząsteczki glufosynatu tak, że nie zakłócają one metabolizmu
komórki i roślina staje się tolerancyjna na herbicyd.
14
Pierwsza generacja transgenicznych odmian roślin uprawnych
(1995-2005)
Podstawowymi zaletami tych odmian są:
- zwiększone plonowanie
- zmniejszone zużycie środków chemicznych
- zmniejszone zanieczyszczenie gleby i środowiska
- oddziaływanie prozdrowotne w wyniku zmniejszonej
zawartości pestycydów i/lub toksyn
Cechy: odporność na herbicydy, owady i wirusy
Druga generacja transgenicznych odmian roślin uprawnych
(2005-2015)
W wytwarzaniu tych odmian dokonał się duży postęp.
Wiele z nich jest obecnie sprawdzanych w doświadczeniach
polowych i badaniach klinicznych.
Odmiany te dadzą konsumentom dużo korzyści
bezpośrednich.
Cechy:
odporność na herbicydy, szkodniki i patogeny;
tolerancja na suszę, zasolenie, metale ciężkie i temperaturę;
poprawiona wartość odżywcza (białka, tłuszcze, witaminy,
składniki mineralne);
poprawiona zdolność przechowalnicza owoców i warzyw;
poprawiony smak i zapach;
eliminacja alergenów;
szczepionki, białka dla medycyny ludzkiej;
farmaceutyki;
fitoremediacja
15
[Vasil J., Plant Biotechnology 2002 and beyond; Kluwer Publ.]
Trzecia generacja transgenicznych roślin uprawnych
(2015 i póz
niej).
Zakończenie sekwencjonowania genomów Arabidopsis i ryżu;
sekwencjonowanie innych (Brassica, Lotus, kukurydza,
Medicago, topola, jęczmień, pszenica, pomidor, ziemniak, soja,
sosna) jest zaawansowane.
Syntenia odkryta w genomach zbóż ułatwi znalezienie ważnych
genów.
Odkrycie i charakterystyka genów Karłowatości/Zielonej
Rewolucji (jak Rht u pszenicy, sd u ryżu i niewrażliwości na GA)
umożliwi wysokie plonowanie przez manipulowanie relacjami
owoc/nasiona/wielkość/liczebność.
Ostatnio wykazano, że wprowadzenie kilku genów głównych
biorących udział w fotosyntezie typu C4 z kukurydzy do ryżu
znacząco zwiększyło wydajność fotosyntezy i liczbę nasion
oraz zwiększyło tolerancję na stres.
Sekwencjonowanie genomu/hodowla molekularna.
Cechy:
" zmiana architektury rośliny;
" kształtowanie czasu kwitnienia, jakości, wielkości,
oraz liczby owoców i nasion;
" poprawa wydajności fotosyntetycznej i przyswajania
składników pokarmowych;
" wykorzystanie heterozji i apomiksji.
[Vasil J., Plant Biotechnology 2002 and beyond; Kluwer Publ.]
16
Biofarmaceutyki uzyskiwane z transgenicznych roślin
ROŚLINNY SYSTEM
BIOFARMACEUTYK POTENCJALNE ZASTOSOWANIE
EKSPRESYJNY
Białko C Tytoń Leczenie zaburzeń
krzepnięcia
Hirudyna Tytoń, gorczyca Leczenie antytrombolityczne
GM-CSF Tytoń Neutropenia
Erytropoetyna Tytoń Anemia
Enkefaliny Rzeżucha Leczenie przeciwbólowe
Czynnik wzrostu Tytoń Leczenie oparzeń
naskórka (EGF)
IFN-ą Ryż, rzepa Leczenie antywirusowe
Albumina ludzka Ziemniak, tytoń Leczenie stanów niedoboru
Hemoglobina Tytoń Leczenie stanów niedoboru
Kolagen Tytoń Przemysł farmaceutyczny,
chirurgia plastyczna
ą1-antytrypsyna Ryż Choroby wątroby
Aprotinina Kukurydza Inhibitor trypsyny stosowany
w transplantologii
Konwertaza Tytoń, ziemniak Leczenie nadciśnienia
angiotensyny I
ą-trichosantyna Nicotiana Leczenie zakażenia wirusem
bethamiana HIV
Glukocerebrozy Tytoń Leczenie choroby Gauchera
-daza
Somatotropina Tytoń Leczenie stanów niedoboru
Deaminaza Kukurydza Leczenie niedoborów
adenozyny odporności
Nature Biotechnol 2000,18,1151; Curr Op Biotechnol 2001,12, 411
17
Przeciwciała uzyskiwane z transgenicznych roślin
ROŚLINNY SYSTEM
PRZECIWCIAA
O
EKSPRESYJNY
Hybryda immunglobulin klasy IgA i IgG
skierowanych przeciwko antygenowi II Tytoń
Streptococcus (sIgA/IgG)
IgG1 skierowana przeciwko
Tytoń
powierzchniowemu białku S.mutans
IgG przeciwko ludzkiej kinazie kreatyniny Tytoń
Jednołańcuchowy fragment Fv IgG z komórek
Tytoń
mysiej białaczki
IgG przeciw wirusowi opryszczki narządów
Soja, ryż
płciowych (HSV-2)
Ludzka IgG Lucerna
Jednołańcuchowy fragment Fv przeciwko Tytoń, ryż, pomidor,
antygenowi rakowo-płodowemu (CEA) groch
IgG przeciwko RSV Kukurydza
IgG przeciwko Clostridium difficile Kukurydza
IgG przeciwko antygenowi raka okrężnicy Tytoń
Nature Biotechnol 2000,18,1151; Curr Op Biotechnol 2002,13, 151
18
ROŚLINY TRANSGENICZNE Z Bt
Roślinożerne owady są jedną z głównych przyczyn
obniżania plonów roślin uprawnych.
Stosowanie środków owadobójczych, wiąże się
z wysokimi kosztami ekonomicznymi
oraz zanieczyszczeniem środowiska.
Jednymi z pierwszych roślin transgenicznych,
które pojawiły się na rynku, były rośliny zawierające geny
kodujące owadobójcze toksyny izolowane z powszechnie
występującej bakterii Bacillus thuringiensis (Bt):
- w latach 1995 - 1996 - kukurydza, bawełna oraz ziemniak
- w 1999 r. blisko 24% światowej uprawy kukurydzy
oraz 5% światowej uprawy bawełny zawierało transgen
toksyny Bt (GOULD 2000).
Zyski finansowe wynikające z uprawy odmian roślin
transgenicznych są znaczące.
Prognozy ISAAA (ang. International Service for the Aquisition
for Agri-Biotech Applications), wskazują na wzrost zysków
wynikających z uprawy roślin transgenicznych z 3 mld
dolarów w 2000 r. do 8 mld i 25 mld dolarów odpowiednio
w latach 2005 i 2010.
Ryzyko ekologiczne.
Jednym z potencjalnych zagrożeń wynikających z uprawy
roślin Bt jest nieznany efekt działania toksyny na owady
nie będące bezpośrednimi szkodnikami roślin uprawnych,
zwłaszcza, jeżeli organizmy te żywią się szkodnikami
i są pożyteczne z rolniczego punktu widzenia.
Ogólnie, transgeniczne rośliny Bt wydają się być bardziej
specyficzne niż insektycydy, gdyż wytwarzają jedną, ściśle
określoną toksynę, podczas gdy szczepy Bt wykorzystane
do oprysku zwykle produkują kilka różnych toksyn
w tym relatywnie niespecyficzne �-endotoksyny.
Do tej pory, przeprowadzono niewiele badań mających
19
na celu ustalenie wpływu transgenicznych roślin Bt
na przyjazne środowisku owady.
Bacillus thuringiensis:
gram-dodatnia bakteria zdolna do wytwarzania spor,
bytuje w wielu środowiskach, takich jak np. gleba
czy rośliny i w odróżnieniu od innych gatunków Bacillus,
podczas sporulacji wytwarza parasporalne kryształy.
Kryształy składają się z jednej lub kilku �-endotoksyn
lub białek kryształowych (CRY) o masie około 130 kDa.
Toksyny te należą do dużej i wciąż nie w pełni poznanej
rodziny białek homologicznych - dotychczas
zidentyfikowano ponad 130 genów kodujących te białka.
Toksyny Bt zabijają dorosłe owady i ich gąsienice należące
do rzędów:
motyle (Lepidoptera),
dwuskrzydłe (Diptera),
chrząszcze (Coleoptera).
Owady wrażliwe mają receptor w błonach komórkowych,
pośredniczący w transporcie toksyny do wnętrza komórek.
W alkalicznym środowisku ich przewodu pokarmowego,
wytwarzana przez bakterie protoksyna (130 kDa) ulega
proteolizie, z wytworzeniem produktu (70 kDa) paraliżującego
owada.
Różne szczepy Bt wytwarzają odmienne toksyny owadobójcze
o zróżnicowanym zakresie gospodarzy.
Do roślin wprowadzono co najmniej 10 genów kodujących
różne toksyny Bt: cry1A(a), cry1A(b), cry1A(c), cry1B(a),
cry1C(a), cry1H, cry2A(a), cry3A, cry6A, Cry9C.
Większość białek CRY, nawet w obrębie podrodziny CRY1A
wykazuje różne, unikalne spektrum owadobójcze.
Geny cry1A i cry1C kodują białka odpowiednio CRY1A iCRY1C,
wykazujące specyficzność w stosunku do larw owadów
z rodziny Lepidoptera takich jak np. owocówka jabłkóweczka
(Cydia pomonella). Dla kontrastu, białko CRY3A jest toksyczne
20
dla szkodliwych owadów z rodziny Coleoptera włączając
stonkę ziemniaczaną (Leptinotarsa decemlineata).
TOKSYNY OWADOBÓJCZE Bt W GLEBIE
Tematem badań jest również toksyczność wydzielin korzeni
transgenicznej kukurydzy.
Uzyskane wyniki wskazują na aktywność toksyn Bt
znajdujących się w glebie, gdzie szybko wiążą się one
do cząstek gliniastych. Dzięki związaniu z cząstkami gleby
toksyna utrzymuje swoje właściwości owadobójcze i jest
chroniona przed degradacją mikrobiologiczną przez
co najmniej 234 dni.
Obiektami badań była gleba, na której uprawiano
transgeniczną kukurydzę oraz gleba uzyskana z pól,
gdzie uprawiano odmiany nietransgeniczne.
Analiza gleby po 7 oraz 15 dniach uprawy wykazała
obecność toksyny CRY1A(b). Pozytywny wynik biotestu,
z wykorzystaniem larw motyla Manduca sexta, wskazał na
aktywność toksyny.
Larwy, umieszczone na podłożu zawierającym wydzieliny
z korzeni transgenicznej kukurydzy, ginęły po 2 3 dniach,
zaś po 5 dniach śmiertelność sięgała 90 95%. W przypadku
wydzielin z korzeni roślin nie transformowanych nie
obserwowano śmierci larw.
Po 25 dniach wyniki były negatywne zarówno w przypadku
gleby roślin transgenicznych, jak i nietransgenicznych,
co może wskazywać na hydrolizę i dezaktywację toksyny
przez enzymy roślinne lub pochodzące z mikroorganizmów.
Do tej pory nie ma dostępnych danych literaturowych
wskazujących, że obecność toksyn owadobójczych wpływa
negatywnie na organizmy glebowe. Mogą one kontrolować
liczbę szkodliwych owadów lub selekcjonować owady
szkodliwe wykazujące odporność na te toksyny.
Receptory toksyn występują u owadów szkodliwych jak
i pożytecznych, tak więc istnieje ryzyko negatywnego
wpływu toksyn na owady pożyteczne oraz organizmy
wyższych poziomów troficznych.
Dalsze badania pozwolą wyjaśnić realność zagrożeń
21
i wątpliwości.
22
Florigene (Calgene Pacific)
Transgeniczne rośliny róży herbacianej Blue Rose.
Powstały poprzez wprowadzenie genu  hydroksylazy
flawonoidowej biorącej udział w syntezie delfinidyny.
23