Tom 53, 2004
Numer 3 4 (264 265)
Strony 263 270
ANDRZEJ EJCHART
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa
e-mail: [e-mail]
SPEKTROSKOPIA MAGNETYCZNEGO REZONANSU J
DROWEGO W WYZNACZANIU
BUDOWY BIAA
EK
WST
P
Pierwszy, pośredni pomiar momentu ma- tego typu badań, a z drugiej  stałym postępem
gnetycznego jÄ…der wodoru w fazie gazowej w technicznym, stwarzajÄ…cym coraz szersze mo-
doświadczeniu Sterna-Gerlacha miał miejsce w żliwości badawcze (BECKER i współaut. 1996).
1933 r. Jednak bezpośrednia rejestracja sy- Dzięki temu spektroskopia NMR stała się obec-
gnału magnetycznego rezonansu jądrowego w nie metodą, która umożliwia otrzymanie infor-
fazie skondensowanej została wykonana do- macji o strukturze cząsteczkowej na poziomie
piero w roku 1945 przez F. Blocha, W. W. Han- atomowym i może odgrywać ważną rolę w pro-
sena i M. Packarda oraz, niezależnie, przez E. R. teomice strukturalnej. Tym zagadnieniom zo-
Purcella, H. C. Torreyai R. V. Pounda. Doświad- stał poświęcony niniejszy artykuł.
czenie to było początkowo uważane za jedną z Docenienie ogromnego znaczenia prac
wielu pojawiających się wówczas ciekawostek opartych na spektroskopii NMR dla postępu
ze świata fizyki atomowej i zainteresowało je- wielu kierunków badań naukowych znalazło
dynie nielicznych fizyków. Dopiero odkrycie między innymi swój wyraz w przyznaniu szere-
przesunięć chemicznych w 1950 r. oraz sprzę- gu nagród Nobla badaczom, którzy najbardziej
żeń spinowo-spinowych rok póz
niej uświado- przyczynili się do jej rozwoju (Felix Bloch i
miło środowisku naukowemu olbrzymie po- Edward R. Purcell  fizyka 1952, Richard Ernst
tencjalne znaczenie spektroskopii magnetycz-  chemia 1991, Kurt Wüthrich  chemia 2002,
nego rezonansu jądrowego (NMR) dla badań Paul C. Lauterbur i Peter Mansfield  medycy-
struktury cząsteczek. W kolejnych dziesięciole- na 2003; patrz art. W. FRONCISZA wtymzeszy-
ciach nastąpił burzliwy jej rozwój, stymulowa- cie KOSMOSU).
ny z jednej strony różnorodnością zastosowań
SPEKTROSKOPIA NMR W BADANIU BIAA
EK  UWAGI WST
PNE
Jądra izotopów większości ważnych biolo- troskopia NMR stwarza możliwości otrzyma-
gicznie pierwiastków, jak węgiel, azot, wodór nia struktur o dużej dokładności w roztworach,
czy fosfor, charakteryzują się wąskimi sy- co pozwala na porównywanie struktur białek
gnałami w widmach NMR. Oddziaływania mię- otrzymanych w krysztale i roztworze lub na ba-
dzyjądrowe, które są czułe nawet na małe zmia- dania takich białek, które nie krystalizują.
ny struktury i konformacji cząsteczki, Te ogromne możliwości badawcze spektro-
wpływają na położenia, kształty i intensywno- skopii NMR na razie nie znajdują odbicia w licz-
ści sygnałów (FRIEBOLIN 1999). Ponadto spek- bie struktur dostępnych w bazach danych;
264 ANDRZEJ EJCHART
mniej niż 14% struktur białek zdeponowanych Bardzo silny sygnał rozpuszczalnika jakim
w Protein Data Bank (http://www.rscb.org/ jest dlabiałekwodautrudniaobserwacjęwidm
1
pdb) zostało wyznaczonych w oparciu o dane H NMR, zwłaszcza ważnego diagnostycznie
NMR. Szereg przyczyn spowodował taki stan obszaru sygnałów H .
rzeczy i warto wymienić podstawowe powody, W dużych białkach sygnały ulegają posze-
które hamowały dotychczas szerokie wykorzy- rzeniu tracąc strukturę subtelną ze względu na
stanie NMR w wyznaczaniu przestrzennych wolniejszÄ… reorientacjÄ™ dyfuzyjnÄ….
struktur białek (ZHUKOV i EJCHART 2003). Więzy strukturalne otrzymane z widm
Jedną z nich jest niska czułość spektrosko- NMR zazwyczaj są niejednoznaczne, co pozo-
pii NMR. Obecnie typowa ilość białka potrzeb- stawia pewną dowolność w ich interpretacji.
na do badań NMR wynosi około 0,5 Mczyli o Obecnie większość tych niekorzystnych
kilka rzędów wielkości więcej niż ilość po- właściwości widm NMR zostało przezwycię-
trzebna do pomiarów optycznych czy w spek- żonych dzięki ogromnemu postępowi jaki do-
trometrii masowej. Ponadto białko nie powin- konał się w budowie spektrometrów, zastoso-
no agregować przy stężeniach rzędu 1 mM/l. waniu nowych technik pomiarowych, znako-
Pomiary NMR są czasochłonne. Białko musi waniu izotopowym oraz procedurach kompu-
być więc stabilne w roztworze w temperaturze terowych służących do otrzymania więzów
pokojowej co najmniej przez kilkanaście dni. strukturalnych i wykorzystaniu ich w oblicze-
Sygnały w widmach białek poszczególnych niach strukturalnych. Dzięki temu liczba depo-
izotopów są silnie ponakładane. Na przykład w nowanych w PDB struktur białek otrzymanych
białku składającym się z 200 reszt aminokwaso- w oparciu o dane NMR w ostatnich latach ro-
wych należy oczekiwać około 1200 sygnałów śnie lawinowo.
1 13
izotopu H, 1000 sygnałów izotopu Ci ponad
15
200 sygnałów izotopu N występujących w
wąskich przedziałach częstości.
PODSTAWY SPEKTROSKOPII NMR
Izotopy posiadające jadra obdarzone spi- Wwyrażeniutym jest stosunkiem magne-
nami i zwiÄ…zanymi z nimi momentami magnet- togirycznym charakteryzujÄ…cym dany izotop,
ycznymi są magnetycznie czynne i mogą być zaś jest stałą ekranowania, silnie zależną od
obserwowane w spektroskopii NMR. Jądra, rozkładu gęstości elektronowej w pobliżu
których spiny są równe 1/2, mają jedynie mo- jądra, a więc zależą od lokalnej struktury
menty magnetyczne i ich sygnały są wąskie. Na- cząsteczki; zwykle jest ona rzędu 10-4 10-5. W
tomiast jądra, których spiny są większe od 1/2 praktyce zamiast stałych ekranowania używa
mają również momenty kwadrupolowe, które się łatwiejsze do wyznaczenia przesunięcia
oddziałując silnie z lokalnymi gradientami pola chemiczne , które są różnicami pomiędzy sy-
elektrycznego powodują silne poszerzenia sy- gnałami interesujących jąder a jądrami umow-
gnałów. Dlatego, o ile dany pierwiastek po- nego wzorca, wyrażonymi w postaci bezwy-
siada kilka magnetycznie czynnych izotopów, miarowych wielkości:
do badań NMR wybiera się izotop o spinie 1/2,
= 106(f  fref)/fref 106( ref  )
nawet jeśli jego zawartość w naturalnym
Czynnik 106 jest wprowadzony dla wygody
składzie izotopowym jest mała. Jako przykład
i dlatego przesunięcia chemiczne są wyrażone
może służyć azot. Pomimo tego, że w przyrod-
14
w częściach na milion  ppm. Częstości rezon-
zie dominuje izotop N o spinie 1 (ponad
ansowe jąder w NMR dla dostępnych obecnie
99%), to w spektroskopii NMR powszechnie
15
wartości pól magnetycznych (4,7 21,1 T) są
wykorzystuje się izotop N o spinie 1/2, któ-
rzędu MHz. Na przykład, dla pola B0 = 11,7 T
rego naturalna zawartość wznosi zaledwie
wartości te wynoszą: f(1H) 500 MHz,
0,37%. Częstość rezonansowa jąder umiesz-
f(13C) 125,7 MHz i f(15N) 50,7 MHz.
czonych w stałym, silnym, jednorodnym polu
Czułość pomiaru NMR wyrażona jako sto-
magnetycznym B0 jest dana wyrażeniem (VAN
sunek sygnału do szumów S/N jest dana przez:
DE VEN 1995):
S/N = i d3/2B0N1/2/T
f = B0(1  )/2
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w wyznaczaniu budowy białek 265
gdzie i i d sÄ… odpowiednio stosunkami magne- spinowo-spinowe sÄ… wykorzystywane do prze-
togirycznymi jÄ…der pobudzonych poczÄ…tkowo niesienia polaryzacji  techniki pozwalajÄ…cej
i jąder podlegających detekcji, o ile są one róż- na zwiększenie czułości pomiaru NMR. Do
ne. Dlatego pomiary zaczynające się i kończące tego celu najbardziej przydatne są sprzężenia
na jądrach o największej wartości (zazwyczaj heterojądrowe charakteryzujące się dużymi
1 1
są to jądra H) charakteryzują się największą wartościami bezwzględnymi J(1H,13C) > 120
1
czułością. N jest liczbą spójnie dodanych iden- Hz i J(1H,15N) <  90 Hz.
tycznych rejestracji, z czego wynika, że n-kro- Oddziaływanie dwóch spinów jądrowych
tne zwiększenie S/N wymaga wydłużenia przez przestrzeń, to oddziaływanie dwóch di-
całkowitego czasu pomiaru n2 razy. Zwiększe- poli magnetycznych. Stała sprzężenia dipol-
nie pola magnetycznego i obniżenie tempera- owego, D, zależy od odległości pomiędzy od-
tury również poprawia czułość pomiaru (VAN działującymi jądrami oraz od ich stosunków
DE VEN 1995). magnetogirycznych: Dij i jrij-3. Typowewar-
Istnieją dwa typy oddziaływań pomiędzy tości stałych sprzężenia dipolowego, leżących
spinami jądrowymi: przez wiązania chemiczne blisko w przestrzeni jąder, mogą być o kilka
i przez przestrzeń. Oddziaływanie przenoszo- rzędów wielkości większe niż stałe sprzężenia
ne przez wiązania chemiczne, zwane od- spin-spin. Na przykład, w białkach
działywaniem lub sprzężeniem spinowo-spino- D(C ,H )  24 kHz lub D(N,HN) 11,5 kHz.
wym, przeważnie ma zasięg nie przekraczający Jednak w odróżnieniu od sprzężeń spi-
czterech wiązań. Prowadzi ono do pojawienia nowo-spinowych, sprzężenia dipolowe, który-
się rozszczepień sygnałów sprzężonych jąder. ch efektywne wartości zależą od orientacji
Jego wartość, zwana stałą sprzężenia J, zależy wektora rij względem kierunku pola B0, wizo-
od rodzaju pierwiastków i wiązań chemicz- tropowych roztworach zostają uśrednione do
nych znajdujących się na drodze sprzężenia zera i nie powodują rozszczepień sygnałów w
oraz ich wzajemnej orientacji co powoduje, że widmach NMR. Pomimo tego, oddziaływania
stałe sprzężenia zawierają informacje stereo- dipolowe w roztworach izotropowych są od-
chemiczne (EJCHART 1999). Wicynalne stałe powiedzialne za powstanie jądrowego efektu
3
sprzężenia przez trzy wiązania, J, są szczegól- Overhausera (NOE). NOE przejawia się w wid-
nie ważne, gdyż ich wartości zależą od kąta mie jako zmiana intensywności sygnału po-
dwuściennego jaki tworzą te wiązania (Ryc. 1). chodzącego od jądra sprzężonego dipolowo z
Poza informacjami strukturalnymi, sprzężenia jądrem, którego stan równowagi termodyna-
micznej został zakłócony; wielkość tego efektu
jest proporcjonalna do D2, czyli do r-6. Zatem
szybko malejÄ…cy, ze wzrostem r, NOE zawiera
informacje o odległościach międzyjądrowych
(NEUHAUS i WILLIAMSON 1989).
Sprzeżenia dipolowe można częściowo za-
chować w widmach NMR białek rozpuszczo-
nych w roztworach anizotropowych. Ich
obserwowane wartości (tak zwane resztkowe
sprzężenia dipolowe), które zależą od stopnia
orientacji cząsteczek białka przez czynnik ani-
zotropowy, mają wartości znacznie mniejsze
od maksymalnych. Wartości te, jak wspom-
niano wcześniej, zależą od orientacji wektora
Ryc. 1. Zależność wicynalnej stałej sprzężenia
rij względem kierunku pola B0 i stanowią
spinowo-spinowego pomiędzy protonami ami-
nowy, cenny rodzaj więzów strukturalnych
dowymi HN i protonami H w białkach od kąta
(EJCHART i GRYFF-KELLER 2000).
dwuściennego utworzonego przez wiązania
W standardowym impulsowym ekspery-
HN  N C  H po uwzględnieniu jego relacji w
mencie NMR, po wytworzeniu nierównowago-
stosunku do kąta ( =  60o)  jednegoz kątów
wego stanu układu spinowego (przygotowa-
określających konformację szkieletu polipepty-
nie) może następować przekazanie od-
dowego. Zależność ta jest opisana krzywą Kar-
3
działywania pomiędzy różnymi spinami (mie-
plusa: J(HN,H ) =Acos2 + Bcos + C, dla której
szanie), po którym ma miejsce rejestracja sy-
w tym przypadku A = +7,0 Hz, B =  1,4 Hz oraz
gnału stanowiącego odpowiedz
układu spino-
C = +1,7 Hz.
266 ANDRZEJ EJCHART
ściowo lub całkowicie usunięte przez zastoso-
wanie technik wielowymiarowych.
W widmach dwuwymiarowych (2D), po
okresie przygotowania, zakłócone spiny są po-
Ryc. 3. W pomiarze widma dwuwymiarowego
otrzymuje się zbiór sygnałów FID tworzących ma-
cierz danych w dziedzinie czasu (t1, t2).
Ewolucja powoduje modulację sygnału FID rejes-
trowanego w czasie t2 częstościami występującymi
podczas t1. Efektem jest zmienność intensywności i faz
sygnałów pojawiających się w widmach NMR po serii
transformacji fourierowskich względem t2. Daneznaj-
dują się teraz w mieszanej dziedzinie (t1, 2). Zbiór
i-tych punktów widm otrzymanych dla systematycznie
rosnących wartości t1 ( ) tworzy interferogram (anal-
ogiczny do sygnału FID) zawierający informacje o czę-
stościach ewoluujących podczas t1. Seria transformacji
fourierowskich względem t1 wykonanych kolejno dla
wszystkich punktów widma w dziedzinie 2 prowadzi
do powstania widma dwuwymiarowego w dziedzinie
Ryc. 2. Sygnał zaniku swobodnej precesji jąder
1
częstości ( 1, 2), w którym każdy sygnał jest scharakte-
H próbki zawierającej roztwór octanu etylu,
ryzowany przez dwie częstości.
CH3COOCH2CH3 (A) oraz otrzymane z niego
przez transformacjÄ™ fourierowskÄ… widmo NMR
(B).
zostawione na pewien czas, w którym ewoluują
Położenia, struktura subtelna (rozszczepienia) oraz
z charakterystycznymi dla siebie częstościami
względne intensywności sygnałów charakteryzują jed-
(ewolucja  t1). W czasie mieszania częstości te
noznacznie poszczególne grupy jąder. Sygnał octano-
mogą modulować oscylacje innych spinów re-
wej grupy metylowej jest singletem (brak sprzężeń z
1
innymi, odległymi jądrami H w cząsteczce) o względ- jestrowane podczas detekcji  t2. Równomierne
nej intensywności 3. Sygnały grup CH2 i CH3 etylu es-
zwiększanie czasu ewolucji prowadzi do zbioru
trowegoowzględnychintensywnościach2i 3są roz-
widm 1D o różnych fazach modulacji wystę-
szczepione przez wicynalne sprzężenie spinowo-spi-
pujących w nich oscylacji, w których pojawia
nowe.
się druga zależność od czasu  czasu ewolucji
(oprócz występującej także zależności od czasu
wego na zakłócenie (detekcja). Tak otrzymany detekcji). Dwie kolejne transformacje Fouriera
sygnał nosi nazwę sygnału zaniku swobodnej prowadzą w takim przypadku do widma, w któ-
precesji (FID) i jest funkcją czasu. Operacja rym każdy punkt jest scharakteryzowany przez
transformacji Fouriera zamienia ten sygnał na dwie częstości (Ryc. 3). Jeżeli spiny podlegające
równoważną mu funkcję częstości, czyli wid- ewolucji i detekcji należą do tego samego izo-
mo NMR, które w takim przypadku jest nazy- topu, to widmo nosi nazwę widma homojądro-
wane widmem jednowymiarowym  1D wego i zawiera dwa rodzaje sygnałów: znaj-
(Ryc. 2). W widmach 1D każde jądro jest scha- dujące się na przekątnej sygnały diagonalne
rakteryzowane przez położenie sygnału dane (f1 = f2), odpowiadające sygnałom pojawiającym
jego częstością lub przesunięciem chemicz- się w widmie 1D, oraz pojawiające się poza
nym. W przypadku identycznych wartości przekątną sygnały korelacyjne, których
przesunięć chemicznych kilku sygnałów, co współrzędne f1 f2 odpowiadają częstościom
często ma miejsce w widmach liczących setki oddziałujących spinów jądrowych. Charakter
sygnałów, ich jednoznaczne przypisanie po- oddziaływania (spinowo-spinowe lub dipo-
szczególnym jądrom zazwyczaj nie jest możli- lowe) jest wybierany przez odpowiednią kon-
we. Takie niejednoznaczności mogą być czę- strukcję okresu mieszania. Jeżeli spiny podle-
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w wyznaczaniu budowy białek 267
gające ewolucji i detekcji należą do różnych izo- jednak uświadomić sobie poważny mankament
topów, to widmo nosi nazwę widma hetero- widm wielowymiarowych. Aby zapewnić do-
jądrowego i zawiera jedynie sygnały korelacyj- statecznie dobrą rozdzielczość w każdym z wy-
ne. Takie postępowanie można uogólnić na miarów, odpowiadające im czasy ewolucji
trzeci i dalsze wymiary przez dodanie do se- muszą być dostatecznie długie. Ponieważ całko-
kwencji pomiarowej dodatkowych czasów wita liczba pojedynczych pomiarów jest równa
ewolucji i mieszania. W widmach wielowymia- iloczynowi liczb inkrementów podczas każ-
rowych każdy sygnał korelacyjny jest scharakt- dego czasu ewolucji, więc całkowity czas po-
eryzowany przez dwie lub więcej częstości, co miaru rośnie potęgowo z liczbą wymiarów wid-
najczęściej pozwala usunąć niejednoznaczności ma, często przekraczając granice stabilności
występujące w odpowiednich widmach jed- czasowej spektrometru.
nowymiarowych (VAN DE VEN 1995). Należy
METODY WYZNACZANIA BUDOWY PRZESTRZENNEJ BIAA
EK OPARTE NA SPEKTROSKOPII
NMR
Wyznaczenie struktury przestrzennej w pierwszych dwóch etapach są determinowa-
cząsteczki białka z wykorzystaniem spektro- ne wielkością badanej cząsteczki, podczas gdy
skopii NMR składa się z trzech etapów. W obliczenia struktury zależą od rodzaju, liczby i
pierwszym etapie dokonuje się przypisań mo- dokładności więzów strukturalnych.
żliwie największej liczby sygnałów w widmie Do badania małych białek, o masach
lub widmach magnetycznie czynnych izoto- czÄ…steczkowych nie przekraczajÄ…cych 10 kDa,
pów. Oznacza to, że sygnały są jednoznacznie najczęściej wystarczające jest wykorzystanie
identyfikowane z jądrami atomów o znanej lo- informacji zawartych w dwuwymiarowych
1
kalizacji w strukturze pierwszorzÄ™dowej. Na- widmach HNMR(WÜTHRICH 1986). W iden-
stępnie wykonuje się pomiary dostarczające in- tyfikacji sygnałów należących do protonów
formacje o więzach strukturalnych: od- znajdujących się w resztach aminokwasowych,
ległościach międzyjądrowych (NOE) i kątach posiadających układy spinowe o określonej to-
dwuściennych (sprzężenia spinowo-spinowe). pologii, wykorzystuje się sprzężenia spi-
Ostatnim etapem jest obliczenie takiej struktu- nowo-spinowe (Ryc. 4). Natomiast sekwen-
ry przestrzennej cząsteczki, w której spełnione cyjne przypisanie układów spinowych 
są otrzymane doświadczalnie więzy struktural- oparte na występowaniu NOE pomiędzy pa-
ne (DYSON i WRIGHT 1994). Metody stosowane rami protonów znajdujących się w sąsia-
1
Ryc. 4. Fragment dwuwymiarowego widma H
NMR wykonanego dla wodnego roztworu heksa-
dekapeptydu, w którym sygnały korelacyjne poja-
wiają się przy przesunięciach chemicznych
wszystkich jąder tworzących układ spinowy; wid-
mo takie nosi nazwÄ™ TOCSY (ang. total correla-
tion spectroscopy).
Jest to technika najczęściej stosowana do identyfikacji
i grupowania sygnałów należących do poszczególnych
reszt aminokwasowych. Na osi odciętych odczytywa-
ne są przesunięcia chemiczne protonów HN, a na osi
rzędnych  przesunięcia chemiczne pozostałych pro-
tonów w danej reszcie aminokwasowej. Liniami prze-
rywanymi zaznaczono korelacje dla kilku przykłado-
wych reszt. Liczba i położenia sygnałów korelacyjnych
charakteryzujÄ… budowÄ™ danej reszty aminokwasowej.
Np. dla alaniny (Ala) przy przesunięciu chemicznym
(HN) = 7,58 widać kolejno korelacje z H ( = 4,28)
oraz H ( = 1,49).
268 ANDRZEJ EJCHART
Ryc. 6. Sieć heterojądrowych sprzężeń spino-
wo-spinowych, które są wykorzystywane w po-
miarach widm 2D i 3D do pełnego przypisania sy-
1 15 13
gnałów H, N i C w białkach znakowanych
15 13
jednorodnie izotopami Ni C.
Na schemacie podano wartości bezwzględne stałych
sprzężenia w hertzach.
1
wych, heterojądrowych sprzężeń spinowo-spi-
Ryc. 5. Fragment dwuwymiarowego widma H
nowych przez jedno lub dwa wiÄ…zania do
NMR, w którym sygnały korelacyjne pojawiają
identyfikacji i przypisań sekwencyjnych sy-
się przy przesunięciach chemicznych par jąder
1 15 13
gnałów H, Ni C jąder atomów tworzących
oddziałujących dipolowo; widmo takie nosi na-
szkielet białkowy (Ryc. 6). Przykład jednego z
zwÄ™ NOESY (ang. nuclear overhauser effect
najczęściej stosowanych heterojądrowych
spectroscopy).
widm 2D korelujących przesunięcia che-
Widmo wykonano dla heksadekapeptydu, którego
1 15
miczne Hi N w grupach amidowych białek
widmo TOCSY przedstawiono na ryc. 4. Oprócz sy-
jest przedstawiony na Ryc. 7 (ZHUKOV 2001).
gnałów diagonalnych leżących na przekątnej widma,
widoczne są sygnały korelacyjne HN(i)/HN(i+1) po-
zwalające określić położenie danej reszty aminokwa-
sowej w sekwencji. Liniami przerywanymi zaznaczo-
no dwa fragmenty przypisań sekwencyjnych.
dujących resztach aminokwasowych, najczęś-
ciej HN(i)/ HN(i+1) i H (i)/HN(i+1)  kończy
1
przypisania sygnałów H (Ryc. 5). Do-
świadczalne więzy strukturalne otrzymuje się z
obserwacji NOE pomiędzy protonami znaj-
dującymi się w bardziej odległych resztach
aminokwasowych oraz wicynalnych sprzężeń
3
spinowo-spinowych J(HN,H ). Intensywności
sygnałów korelacyjnych NOE są przeliczane na
odległości międzyjądrowe, zaś wartości stałych
Ryc. 7. Widmo 2D korelujące przesunięcia che-
sprzężenia spinowo-spinowego  na kąty dwu-
1 15
miczne jąder H (oś odciętych) i N (oś rzęd-
ścienne .
1
nych) grup amidowych przez stałą sprzężenia
W widmach H NMR białek o masach
1
spinowo-spinowego J(N,H), które wykonano
cząsteczkowych większych niż 10 kDa nasilają
dla podwójnie znakowanego homodimeryczne-
się dwa efekty; liczba sygnałów zwiększa się, a
go białka S100A1 zawierającego 93 reszty amino-
ich szerokości rosną na skutek coraz wolniej-
kwasowe w podjednostce. Każda grupa amidowa
szej dyfuzji rotacyjnej czÄ…steczek. W rezultacie
1 jest na widmie reprezentowana przez jeden sy-
sygnały w dwuwymiarowych widmach H
gnał korelacyjny.
NMR są zbyt silnie ponakładane, by można je
było zidentyfikować i przypisać. W przypadku
białek o masach cząsteczkowych do 30 kDa Ponadto znakowanie sygnałów korelacyjnych
rozwiązaniem jest jednorodne, podwójne zna- pochodzących od oddziaływań dipolowych
15 1
kowanie izotopowe N/13C. Pozwalatonawy- H/1H częstościami sprzężonych z nimi hetero-
15 13
korzystanie w widmach dwu i trójwymiaro- jąder Nlub C w widmach 3D i 4D, zwane re-
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w wyznaczaniu budowy białek 269
dagowaniem izotopowym, pozwala na usuniÄ™- tywne lub segmentowe znakowanie izotopo-
1
cie licznych degeneracji sygnałów H wy- we i częściowe lub całkowite deuterowanie
stępujących w widmach 2D (BAX i GRZESIEK białka (LIAN i MIDDLETON 2001). Częściowe
1993, CLORE i GRONENBORN 1998). znakowanie izotopowe zmniejsza liczbÄ™ sy-
15
Jednorodne znakowanie N/13C przestaje gnałów danego izotopu a deuterowanie
być wystarczające w białkach o masach osłabia wewnątrzcząsteczkowe oddziaływania
cząsteczkowych przekraczających 30 kDa dipolowe powodując zwężenie sygnałów.
(KAY 2001). Wtedy pomocne staje siÄ™ selek-
PERSPEKTYWY
Ciągłe doskonalenie spektrometrów NMR, mach NMR oraz coraz doskonalsze algorytmy
wynikające z postępu technologicznego w wie- komputerowe stosowane zarówno do automa-
lu dziedzinach, zwłaszcza zwiększenie stoso- tycznego lub półautomatycznego przypisywa-
wanych pól magnetycznych dzięki stosowaniu nia sygnałów i identyfikacji więzów struktural-
nowych materiałów nadprzewodnikowych nych, jak i obliczeń strukturalnych. Nie można
oraz polepszenie czułości i stabilności pomia- tu pominąć coraz wydajniejszych metod pod-
rów, będące konsekwencją nowych rozwiązań stawienia izotopowego, bez którego badanie
aparaturowych (np. chłodzenie cewki odbior- białek o dużych masach byłoby niemożliwe.
czej do temperatury kilkunastu K), stanowi je- Ponieważ na wszystkich wymienionych po-
den z ważnych powodów, dla których spektro- lach obserwuje się stały postęp, należy zatem
skopia NMR pozwala na wyznaczanie struktur oczekiwać, że w najbliższych latach zarówno
coraz większych białek i kompleksów białko- wielkość jak i liczba struktur białek wyznacza-
wych. Inne, równie ważne powody, to nowo- nych w oparciu o spektroskopię NMR będą
powstające techniki pomiarowe, pozwalające szybko rosły.
na coraz lepszą identyfikację sygnałów w wid-
NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY IN THE DETERMINATION OF PROTEIN
STRUCTURES
S u mma r y
Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) troscopy as a tool for the protein structure determina-
is a method well suited to play an important part in tion are discussed. Recently, the advance in the NMR
proteomics programs. It provides structural informa- equipment, spectral techniques and isotope labelling
tion at the atomic resolution. Isotopes of biologically resulted in an enormous growth of the number of
1 13 15 31
important elements, H, C, N, and P, display nar- NMR-determined protein structures. Modern
row resonance lines while the most abundant nitro- NMR-based procedure of structure determination
14 12
gen ( N) and carbon ( C) isotopes are uselessness in comprises three stages: assignment of as many signals
the NMR studies of macromolecules. Internuclear in- as possible in the spectra of NMR-active isotopes, iden-
teractions, modulated by even small structural and tification of structural constraints, and calculation of a
conformational changes, influence line shape and in- family of three-dimensional structures fulfilling exper-
tensity of signals in NMR spectra. Last but not least, imental constraints. Approaches used at the first two
NMR provides high resolution structures in solution stages depend on the size of the protein studied
allowing to study those proteins that fail to crystallize whereas the approach applied at the third stage de-
or to compare differences between their crystal and pends on the type and number of identified con-
solution structures. The pros and cons of NMR spec- straints.
LITERATURA
BAX A., GRZESIEK S., 1993. Methodological Advances in CLORE G. C., GRONENBORN A. M., 1998. Determining
Protein NMR. Acc. Chem. Res. 26, 131 138. Structures of Large Proteins and Protein Com-
BECKER E. D., FISK C., KHETRAPAL C. L., 1996. The Deve- plexes by NMR. [W:]Biological Magnetic Resonan-
lopment of NMR. [W:] Encyclopedia of Nuclear ce. KRISHNA N. R., BERLINER L. J. (red.). Kluwer Aca-
Magnetic Resonance. GRANT D. M., HARRIS R. K. demic/Plenum Publishers, New York 16, 3 26.
(red.). John Wiley, Chichester 1, 1 158. DYSON H. J., WRIGHT P. E., 1994. Protein Structure Cal-
culation Using NMR Restraints. [W:] Two-Dimen-
270 ANDRZEJ EJCHART
sional NMR Spectroscopy. Application for Che- LIAN L.-Y., MIDDLETON D. A., 2001. Labelling appro-
mists and Biochemists. Second Edition. CROASMUN aches for protein structured studies by solu-
W. R., CARLSON R. M. K. (red.). VCH Publishers Inc., tion-state and solid-state NMR. Prog. Nucl. Magn.
New York. Reson. Spectrosc. 39, 171 190.
EJCHART A., 1999. Scalar Couplings in Structure Deter- NEUHAUS D., WILLIAMSON M. P., 1989. The Nuclear Over-
mination of Proteins. Bull. Pol. Ac.: Chem. 47, hauser Effect in Structural and Conformational
1 19. Analysis. VCH Publishers Inc., New York.
EJCHART A., GRYFF-KELLER A., 2000. Wpływ częściowego VAN DE VEN F. J. M., 1995. Multidimensional NMR in
uporzÄ…dkowania orientacji czÄ…steczek na ich Liquids. VCH Publishers Inc., New York.
widma NMR dużej zdolnoÅ›ci rozdzielczej. Wiad. WÜTHRICH K., 1986. NMR of Proteins and Nucleic
Chem. 54. 949 969. Acids. Wiley, NewYork.
FRIEBOLIN H., 1999. Basic One- and Two-Dimensional ZHUKOV I., 2001. Solution structure and backbone dy-
NMR Spectroscopy. Wyd. 3 poprawione. VCH Pu- namics of CMTI-I (Met8: Leu) and bovine
blishers Inc., Weinheim. apo-S100A1( ) proteins as studiedbyNMRspec-
KAY L. E., 2001. Nuclear Magnetic Resonance Methods troscopy. Praca doktorska, IBB PAN, Warszawa.
for High Molecular Weight Proteins: A Study ZHUKOV I., EJCHART A., 2003. NMR spectroscopy in struc-
Involving a Complex of Maltose Binding Protein tural proteomics. NMR-based protein structure de-
and -Cyclodextrin. [W:] Methods in Enzymology. termination. Polimery 48, 28 34.
JAMES T. L., DÖTSCH V., SCHMITZ U. (red.). Academic
Press, San Diego 339, 174 203.