71199

to z ich właściwości do hydrolizy w określonej pozycji wynikającej ze ściśle określonej sekwencji nukleotydów i tworzenia kompatybilnych końców. Ponadto produktem ich działania na substraty DNA jest fragment o zidentyfikowanej długości, łatwy do rozdzielenia i identyfikacji.

Ogólnie ujmując różne enzymy restrykcyjne rozpoznają róże sekwencje DNA. jakkolwiek enzymy z różnych źródeł mogą rozpoznawać taka samą sekwencje (izoschizomery). Izoschizomery chociaż rozpoznają te samą sekwencje to mogą różnić się między sobą miejscem trawieni, wrażliwością na metylację oraz wydajnością trawienia.

Dodatkowe możliwości stwmzyło również odkry cie takich endonukleaz, które choć rozpoznają różne sekwencje tworzą fr agmenty o takich samych lepkich końcach (np. BamHl i SauAI).

Enzymy restrykcyjne są białkami dość stabilnymi i jak każdy enzym wymagają ściśle kreślonych warunków do osiągnięcia maksymalnej aktywności Większość jest aktywna w zakresie pH 7.2-7,6. Większość enzymów rutynowo działa w temp. 37’C, niektóre jednak wymagają wyższej lub niższej temperatury. Główne różnice obejmują optymalną silę jonową bufora (stężenie soli) W celu ułatwienia pracy podzielono enzymy w zależności od rodzaju bufora w' którym osiągają najwyższą aktywność na trzy zasadnicze grapy: te które wymagają wysokiej, średniej i niskiej siły jonowej. Stężenie soli w buforze reakcyjnym odgrywa bardzo ważną rolę w zapewnieniu aktywności i specyficzności danego enzymu.

Średnia liczba miejsc cięcia dla danego enzymu w obrębie badanego DNA zależy od typu rozpoznawanej sekwencji, a ściśle od liczby rozpoznawanych zasad Analiza może być prowadzona w różny sposób: poprzez działanie jednym enzymem, w wyniku czego powstają fragmenty o identycznych końcach lub też całkowita hydroliza w obecności dwóch lub więcej enzymów' rezultatem czego są fragmenty o różnych końcach.

Większość fragmentów generowanych przez poszczególne restryktazy określana jest na drodze rozdziałów elektroforetycznych w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych i na tej podstawie przygotowywane są mapy restrykcyjne badanego DNA.

Za 1 jednostkę aktywności enzymu przyjęto taką ilość enzymu, która jest niezbędna do pełnej hydrolizy lug DNA bakteriofaga lambda w ciągu 111.

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych, stało się głównym i chyba najważniejszym narzędziem pracy w biologii molekularnej Komercyjnie dostępnych jest ok 200 różnych restryktaz Poprzez trawienie DNA z użyciem różnych kombinacji enzymów możliwe jest określenie położenia miejsc restrykcyjnych w obrębie badanego DNA Informacja ta jest niezbędna w opracowywaniu strategii klonowania oraz eksperymentów gdzie specyficzne regiony cząsteczki DNA mogą być modyfikowane.