71207

jego dawek, w tym dawek przypominających, aż do momentu uzyskania optymalnego miana immunoglobulin we krwi zwierzęcia.

2.    Ocenę w warunkach in vitro swoistości i aktywności wytworzonych przez zwierzę

przeciwciał.

3.    Pobranie od zwierzęcia puli komórek aktywnie produkujących przeciwciała. Można

izolować limfocyty B z krwi obwodowej, jednak pula uzyskanych komórek może nie

być liczebnie satysfakcjonująca, dlatego głównie pobiera się cały narząd: śledzionę,

homogenizuje ją, izoluje limfocyty, a te następnie poddaje się fuzji z odpowiednio

przygotowanymi (warunki podano poniżej) komórkami nowotworowymi -komórkami szpiczaka; o ile pobranie krwi zwierzęcia może zachować je przy życiu, o tyle izolowanie śledziony jest równoznaczne z uśmierceniem immunizowanego zwierzęcia - dawcy.

4.    Hodowlę komórek szpiczaka charakteryzujących się obecnością odpowiedniego bloku enzymatycznego: np. braku fosforybozylotransferazy hipoksantyowej - HGPRT-, bloku wynikającego z mutacji genu kodującego enzym: HGPRT. Hodowlę takich komórek prowadzi się przez okres około tygodnia przed przewidywaną fuzją z prawidłowymi limfocytami i utrzymuje w obecności w podłożu hodowlanym czynnika wzrostowego: 8-azaguaniny. Istniejący blok enzymatyczny umożliwia uzależnienie wzrostu komórek od obecności czynnika wzrostowego, czyli substancji, której komórka, wskutek zaistniałego bloku szlaku metabolicznego, nie potrafi zsyntetyzować. Dodatek lub wycofanie z podłoża czynnika wzrostowego pozwala wpływać na wzrost i przeżycie takich komórek.

5.    Fuzję (najczęściej prowadzoną w obecności glikolu polietylenowego) wyizolowanych ze śledziony zwierzęcia produkujących pożądane immunoglobuliny limfocytów B z komórkami nowotworowymi (komórkami szpiczaka posiadającymi cechę nieśmiertelności oraz równoczesny, wspomniany wcześniej blok enzymatyczny).

6.    Selekcję klonów na tak zwanym podłożu wzrostowym selekcyjnym oraz namnażanie uzyskanych hybrydom techniką granicznych rozcieńczeń klonów. W przypadku bloku enzymatycznego HGPRT-, długoterminową hodowlę na podłożu selekcyjnym przeżyją jedynie te hybrydomy, które powstały w wyniku fuzji komórki szpiczaka (nadanie cechy nieśmiertelności) i limfocytu B (dostarczenia hybrydomie komórkowej prawidłowej formy enzymu HGPRT); niepożądane hybrydomy typu: limfocyt B-limfocyt B obumrą po kilkakrotnym pasażowaniu, natomiast te, które powstały na skutek fuzji samych