84754

L

Wektory zastępcze

•    dwa miejsca restrykcyjne |

•    w miejsca Stuffer’a wchodzi nowe DNA

Cosmid

Typowy cownid    Barn HI

Klonowanie i wektorem zastępczy m X

Stuffer

fragment

Restrykcji, lipcp

(00 Rl. Barn HI, Sal I lub kombinacja

Nowe OKA

X£MBL4

T

RBS

S8R

Nowe ONA, do 23 kb

•    plazmid, klóiy zawiera sekwencję faga X i miejsce cos

•    względnie duży

•    pozwala na klonowanie fragmentów ponad 40 kb

R> EcoRI B* Barn HI S-S alI

Dlaczego nie można skorzystać z pierwszej metody?

Po usunięciu miejsc Stuffer’a i samoligacji otrzymamy fragmenty krótsze niż 3 kb. Dlatego w miejsce Stuffera musi wejść nowe DNA.

XEMBL4

•    może przyjmować bardzo duże nowe fragmenty DNA (23 kb)

•    selekcja pizez wielkość lub fenotyp SPI Po co jest potrzebny Stuffer?

Do otizymania wektora w dostatecznej ilości do klonowania (bez Stuffera nie mógłby się namnaźać, bo byłby za krótki)

Wjaki sposób klomijemy przy ićyciu wektorów faga X

Klonowanie u pomoc* pJB8

Barn HI

ONA

I Paczka in vitro

I    Kolonie uwierające kofete

rekombmowane cząsteczki pJB8

Rekombinowane ONA cosmidu

Infekcja ( coli

cząstki X    Noinik arrpicyllnowy

• Klonowanie przy użyciu kolistego X DNA (rzadko)

Klonowanie przy utyciu kolistego ONA X

- forma cy kie zna

•    otrzymujemy duże fragmenty DNA zmodyfikowanego fagaX, ale z niego jest jedynie fragment cos oraz białka osłonkowe, cała reszta jest rekoinbinowana

•    co jest jeszcze ważne: komórka nie ulega lizie! Podsumowanie: najkrótsze są wektory Ml3, potem

wektory plazmidowe (8 kb), wektory faga X (20 kb), wektory cosmidowc (40 kb)

Można oszacować ilość klonów, aby gen wystąpił z dobrej strony z prawdopodobieństwem.

• Klonowanie przy użyciu liniowego DNA X

Klonowanie przy utyciu liniowego ONA X

Infekowanie F. coli

1

długość jest określona przez miejsca cos (zatem określają one upakowanie).

N =

— i

N - liczba klonów

P - prawdopodobieństwo wystąpienia każdego genu a - średnia wielkość fragmentu b - całkowita wielkość genomu

Wjaki sposób znaleźć konkretny klon bibliotece genów?

Potrzeba znalezienia wektorów, które przenoszą większe fragmenty (o tym będzie mowa później) Problem selekcji: jeśli chcemy otrzymać bibliotekę, to DNA przed otrzymaniem biblioteki zwykle ulega fragrncntacji. Marny w bibliotece kolekcję fragmentów DNA w poszczególnych klonach. W jednym z klonów jest poszukiwana informacja.