2906542559

232 K. WOROWSKI, W. ROSZKOWSKA [4]

molekularne na Sephadex G-75. Tą drogą uzyskano preparat około 40-krotnie oczyszczony z wydajnością 47%. Hamuje on również aktywność trypsyny. Wyizolowany inhibitor charakteryzuje się znaczną termosta-bilnością i nie traci aktywności w zakresie pH 2-10. Jego masa cząsteczkowa wynosi 39 000 daltonów. Jedna cząsteczka inhibitora wiąże cztery cząsteczki chymotrypsyny. Kompleks taki ma masę cząsteczkową około 140 000. W 4 M roztworze chlorowodorku guanidyny lub 8 M roztworze mocznika w środowisku kwaśnym inhibitor dysocjuje na cztery podjed-nostki, które oznaczono literami A, B, C i D. Podjednostki te rozdzielono na sulfoetylocelulozie w 8 M roztworze mocznika (pH 2,8). Ich masy cząsteczkowe wynoszą 9000—10 000 daltonów. Skład aminokwasowy i sekwencję aminokwasów w poszczególnych podjednostkach mało się różnią, wszystkie zaś mają kwas glutaminowy jako N-końcowy aminokwas

(Hyc. 1).

Z ziemniaka odmiany Danshaku-Imo wyizolowano trzy inhibitory enzymów proteolitycznych, które oznaczono symbolami I, Il-a i Il-b (32, 33). Metoda oczyszczania inhibitora I (32) polega na wytrąceniu białek balastowych przez ogrzewanie ekstraktu ziemniaczanego w temperaturze 80°C, wysoleniu inhibitora po 30% nasyceniu siarczanem amonu i zastosowaniu chromatografii kolumnowej. Masa cząsteczkowa inhibitora I wyliczona na podstawie składu aminokwasowego wynosi 9400 daltonów. Masa cząsteczkowa znaleziona za pomocą metody sączenia molekularnego na żelu Sephadex G-100 wynosiła jednak 19 300 daltonów, gdy elucję prowadzono 0,1 M kwasem octowym i 42 000 w przypadku elucji 0,9% chlorkiem sodu (34). Wyniki te wskazują na skłonność inhibitora I do polimeryzacji. W roztworze 0,1 M kwasu octowego występuje on w formie dimeru, a w 0,9% roztworze chlorku sodu w formie tetrameru. Ustalono skład aminokwasowy inhibitora I, jego aminokwasy N- i C-końcowe oraz strukturę antychymotrypsynowego miejsca reaktywnego, które tworzy Leu₅₆-Asx₅₇ (35).

Materiał wyjściowy do wyizolowania inhibitora Il-a i Il-b stanowił płyn pozostający po 30% nasyceniu ekstraktu ziemniaczanego siarczanem amonu, z którego wysalano następnie oba inhibitory siarczanem amonu

0    60% nasyceniu (33). Inhibitor Il-a oddzielano od inhibitora Il-b na kolumnach karboksymetylocelulozy i dalej oczyszczano na żelu Sephadex G-100. Jednorodność uzyskanych preparatów inhibitorów potwierdzono przy zastosowaniu techniki elektroforezy w żelu skrobiowym przy pH 4,0 i 8,6. Uzyskane inhibitory są odporne na podwyższoną temperaturę

1    wykazują znaczną stabilność w środowisku kwaśnym. Punkt izoelek-tryczny inhibitora Il-a wynosi 8,5 a inhibitora Il-b 9,1. Masy cząsteczkowe obu inhibitorów są identyczne. Wyliczone na podstawie składu aminokwasowego wynoszą 10 300 daltonów, a oznaczone metodą sączenia molekularnego na żelu Sephadex G-100 — 10 600, gdy do elucji używano 0,1 M kwasu octowego, lub 20 700 w przypadku gdy do elucji używano 0,9% roz-