Analiza konformacji i optymalizacja geometrii cząsteczek leków.
Wstęp do projektowania leków.
Wstęp:
Zagadnienie struktury  przestrzennej charakterystyki układu atomów budujących
cząsteczkę, jest bardzo istotne z punktu widzenia nauk przyrodniczych. Znajomość struktury
związku biologicznie aktywnego (np. leku) dostarcza wielu istotnych informacji dotyczących
możliwego sposobu oddziaływania z rzeczywistym lub potencjalnym receptorem, jak również
pozwala na ustalenie prawdopodobnych przemian biochemicznych, jakim związek taki może
ulegać w procesach metabolicznych organizmów żywych. Rodzaj ugrupowań cząsteczki
biologicznie aktywnej, które tworzą oddziaływania z receptorem (targetem), ich własności
steryczne i elektronowe oraz wzajemna relacja geometryczna nosi nazwę farmakofora
(gdzie receptorem nazywamy tutaj makromolekułę, głównie białkową, która wchodzi w
specyficzną interakcję z cząsteczką leku, wyzwalając pożądane działanie, np. inhibicję
enzymu).
Wiele metod projektowania związków biologicznie aktywnych opiera się na wnikliwej
analizie struktury (w tym konformacji) cząsteczek, których aktywność została potwierdzona.
Podstawą projektowania nowych farmaceutyków jest założenie, że związki podobne mogą
wykazywać podobne działanie (metoda SAR - Structure-Activity Relationship, QSAR -
Quantitative Structure-Activity Relationship). W wielu przypadkach taki tok rozumowania
może być błędny, aczkolwiek w większości przypadków ma on swoje zastosowanie.
Projektowanie leków w oparciu o strukturę znanego leku lub też naturalnego liganda
receptora polega więc na zastąpienie fragmentów farmakofora innymi grupami funkcyjnymi,
odznaczającymi się podobnymi właściwościami fizykochemicznymi. Możliwa jest również
modyfikacja cząsteczki, polegająca na zwiększeniu liczby ugrupowań mogących dodatkowo
oddziaływać z receptorem i w ten sposób stabilizować cząsteczkę potencjalnego leku w
kieszeni wiążącej receptora. Skuteczne wprowadzanie tego typu zmian w obrębie cząsteczki
leku wymaga znajomości struktury receptora. Ten typ projektowania leków, w oparciu o
znaną strukturę receptora i/lub jego kompleksu z ligandem, jest obecnie najczęściej
stosowany i odznacza się relatywnie lepszą skutecznością niż wspomniana wcześniej
metoda. Jednakże trudności związane z otrzymaniem modelu struktury wielu receptorów
białkowych sprawiają, że metody SAR i QSAR są nadal bardzo użyteczne w procesie
projektowania leków.
Istotnym momentem podczas projektowania nowych leków jest określenie targetu.
Targetem nazywamy biologiczny  element , z którym wiąże się cząsteczka leku pozwalając
na wyzwolenie lub zahamowanie odpowiednich procesów komórkowych. Najczęściej takimi
targetami są enzymy, białka receptorowe i/lub transportowe. Znane są również leki
działające na materiał genetyczny, lipidy czy cukry. W przypadku chorób wywołanych
atakiem pasożyta lub bakterii poszukujemy takiego targetu, który jest niezbędny do
przeprowadzania podstawowych procesów życiowych patogenu, a jego działanie może być
upośledzone lub zahamowane powodując śmierć mikroorganizmu. Projektując nowy lek (np.
inhibitor kompetycyjny bądz
niekompetycyjny istotnego enzymu) musimy jednak pamiętać,
aby nie był on toksyczny dla człowieka poddanego kuracji. Dlatego też, wybór
odpowiedniego targetu musi być nie tylko podyktowany możliwością upośledzenia funkcji
życiowych patogenu, ale również bezpieczeństwem pacjenta.
Do podstawowych oddziaływań, jakie można zaobserwować pomiędzy receptorem i
grupami funkcyjnymi liganda zaliczamy:
1
" wiązania wodorowe
O H N O H O
" oddziaływania jonowe ( w tym mostki solne)
H
O
O H N
+
-
H N
- +
3
O
O H N
" koordynacja jonów metalu
H
H
2+
Zn
O
" oddziaływania hydrofobowe (w tym Ą- Ą)
H C
CH3 3
" oddziaływania kation  Ą
+
N
Wśród wszystkich wymienionych tu oddziaływań, najistotniejsze są wiązania
wodorowe. W procesie projektowania leków, głównie kompetycyjnych inhibitorów,
oczekujemy, by zdolność wiązania do kieszeni wiążącej enzymu była większa dla
zaprojektowanej cząsteczki niż naturalnego liganda. W związku z tym analizując centrum
aktywne białka, poszukuje się łańcuchów bocznych aminokwasów, które nie są
zaangażowane w wiązanie naturalnego liganda, ale mogłyby oddziaływać dodatkowo z
zaprojektowanym lekiem. Zaskakującym jest jednak fakt, że wprowadzenie dodatkowych
donorów lub akceptorów wiązań wodorowych nie jest najlepszą metodą zwiększenia
powinowactwa leku do receptora. To większa liczba oddziaływań hydrofobowych często
odpowiada za podwyższenie aktywności oraz większą specyficzność leku.
Optymalizacja geometrii jest jednym z ważnych elementów w procesie projektowania
nowego leku. Wiele związków chemicznych charakteryzuje się znaczną swobodą
konformacyjną. Z analizy struktury wielu leków statystycznie można stwierdzić, że leki
posiadające "sztywniejsze" układy odznaczają się większą specyficznością działania niż
cząsteczki wykazujące dużą labilność konformacyjną.
W celu znalezienia możliwych konformacji cząsteczki stosuje się najczęściej
obliczeniowe metody teoretyczne. Kryterium do wyznaczenia jedynie najbardziej
prawdopodobnych konformerów danego związku jest osiągnięcie minimum energii
swobodnej układu (wliczamy tu również możliwe minima lokalne). Do obliczeń chemii
kwantowej można używać metody ab initio (np. metoda Hartree-Focka), które sprowadzają
2
się do przybliżonego rozwiązania równania Schroedingera jedynie w oparciu o dane
teoretyczne. Wyróżnia się także metody półempiryczne, bazujące na formalizmie HF, w
których wykorzystuje się pewne uproszczenia i przybliżenia, jakie można wysunąć na
podstawie danych eksperymentalnych. Dodatkowo, wykonuje się również symulacje
dynamiki molekularnej (z odpowiednio zdefiniowanym polem siłowym), zarówno dla modelu
cząsteczki leku, białka jak i kompleksu białko-lek.
Obiekt ćwiczenia:
Interesującym targetem w procesie projektowania leków okazał się być enzym DHFR
(reduktaza dihydrofolianowa), katalizujący w obecności NADPH, reakcję redukcji kwasu
dihydrofoliowego do tetrahydrofoliowego. Zarówno organizmy prokariotyczne jak i
eukariotyczne potrzebują zredukowanej formy kwasu foliowego do biosyntezy wielu
biocząsteczek niezbędnych do życia. Człowiek zdobywa kwas foliowy z dietą, podczas gdy
niższe organizmy prokariotyczne, jak np. bakterie czy pierwotniaki, wytwarzają ten związek
de novo. Jednym z enzymów tego szlaku jest wspomniany DHFR. Z tego też powodu białko
to wydaje się dobrym targetem do projektowania nowych antybiotyków. Dodatkowo
wieloletnie badania struktur tego enzymu wykazały, że różnice w budowie kieszeni wiążącej
ludzkiej i pasożytniczej (bakteryjnej) odmiany tego białka są na tyle znaczne, że enzym ten
jest dobrym targetem.
Znanym ligandem (inhibitorem) tego enzymu jest antybiotyk Trimetoprim.
W tym ćwiczeniu będziemy :
1. ustalać sposób wiązania kwasu foliowego i trimetoprimu do DHFR - definicja
farmakofora
2. porównywać kieszeń wiążącą ludzkiej odmiany DHFR z odmianą S. aureus
3. optymalizować konformację cząsteczki trimetoprimu wykorzystując:
a. wybraną metodę ab initio (jedynie w celu przybliżenia metody, gdyż
obliczenia trwają bardzo długo)
b. wybraną metodę półempiryczną
c. metodami mechaniki molekularnej
4. porównać geometrię cząsteczki uzyskanej z optymalizacji metodami
mechaniki molekularnej z:
a. konformacją trimetoprimu w strukturze monokryształu w różnych
otoczeniach chemicznych (wybrane struktury z Cambridge Structural
Database)
b. konformacją trimetoprimu  wyekstrahowaną ze struktury jego
kompleksy z białkiem
3
Wykonanie ćwiczenia:
1) Określenie sposobu oddziaływania DHFR z S. aureus z:
a) Naturalnym ligandem (kwas foliowy)  zdefiniuj farmakofor (PDB ID 3FRD)
b) Znanym inhibitorem (trimetoprim)  zdefiniuj farmakofor (PDB ID 3FRE)
(Pliki zawierające współrzędne struktur białek można znalez
ć na stronie Protein
Data Bank - www.rcsb.org)
Otworzyć program PYMOL
Otworzyć wybrane pliki pdb o podanych wyżej kodach (można stworzyć duplikaty
struktur na wypadek pomyłki - duplicate object)
W graficznym oknie programu cząsteczka jest widoczna, jeżeli naciśniemy kod PDB na
panelu po prawej stronie, dana cząsteczka zostanie ukryta.
Przedstawić białko w postaci cartoon (A - preset - ligand site- cartoon).
Uzyskanie nazwy aminokwasu: najechać kursorem myszki na aminokwas i wcisnąć
prawy przycisk myszy, wybrać z panela: residue - label - residue
Zagadnienia do opracowania:
Znalez
ć i zdefiniować sposób wiązania liganda z białkiem - podać które aminokwasy je
wiążą. Zdefiniuj typy rozpoznanych oddziaływań ligand białko (w sprawozdaniu
zaprezentuj w postaci graficznej sposób wiązania białko ligand). Czy możesz
zdefiniować farmakofor po analizie oddziaływań? Po nałożeniu na siebie struktur
DHFR ze związanym naturalnym ligandem i z trimetoprimem zaznacz jakie fragmenty
liganda uważasz za konieczne aby cząsteczka aktywnie wiązała się do DHFR. Czy
możesz zastąpić dane układy jakąś inną znaną Ci grupą funkcyjną - zaproponuj nowy
potencjalny inhibitor.
2) Porównane kieszeni wiążącej ludzkiej odmiany enzymu z odmianą pasożytniczą
(PDB ID 2W3A)
Otworzyć pliki PDB: 3FRE i 2W3A w programie Wincoot.
Nałożyć cząsteczki na siebie : łańcuch X pierwszej na łańcuch A drugiej : Calculate-
SSM Superpose - w oknie wybrać podane łańcuchy.
Z listy aminokwasów stanowiących łańcuch S. aureus DHFR wybrać te, które zostały
wyznaczone w poprzedniej części ćwiczenia jako fragmenty białka zaangażowane w
wiązanie ligand-białko.
Zagadnienia do opracowania:
W formie tabeli zbierz zestawienie podobieństw i różnic pomiędzy wybranymi
aminokwasami, jak również najbliższymi sąsiadami wybranych reszt.
Korzystając z powyższych programów popatrz czy w kieszeni wiążącej tych dwóch
struktur są reszty które nie biorą udziału w wiązaniu trimetoprimu, ale mogłyby być
wykorzystane dla projektowanego leku. (porównaj nie tylko reszty aminokwasów
określonych w pierwszej części zadania, ale również ich najbliższe otoczenie - po
dwóch sąsiadów z lewej i prawej strony łańcucha białkowego)
4
Porównaj konformację liganda dla obu struktur. Jakie są różnice? Czy pomimo
podobieństwa reszt aminokwasów wiążących ligand możesz wytłumaczyć dlaczego
konformacja cząsteczek jest tak różna? Która część cząsteczki trimetoprimu jest
ułożona w kieszeni wiążącej obu białek w sposób podobny?
3) Otworzyć program HyperChem
W programie narysować cząsteczkę trimetoprimu.
Dodaj atomy wodoru (build - add hydrogens) i zbuduj model (build - add hydrogens)
Zapisz cząsteczkę jako format .mol2 (ml2)
optymalizacja geometrii:
" ab initio: wybierz Steup - ab initio - minimal (STO-3G) wybieramy bazę orbitali
a póz
niej Compute - geometry optimisation - zapisz wartość energii E
(wylicznie nie będą dokończone; zachowaj cząsteczkę w formacie .ml2)
" półempiryczne: wybierz Steup - semiempirical - CNDO - zapisz wartość
energii (zachowaj cząsteczkę w formacie .ml2) (Napisz jakie są założenia tej
metody na podstawie dostępnych podręcznikow do chemii kwantowej)
" mechanika molekularna: Setup - molecular mechanics - AMBER zapisz
wartość energii (zachowaj cząsteczkę w formacie .ml2) (Na podstawie
dostępnych z
ródeł napisz co to jest pole siłowe)
" przeprowadzić symulację dynamiki cząsteczki w czasie 5 ps
UWAGA TECHNICZNA: Przed każdym etapem w programie zawsze otwieraj
zapisaną, ale nieoptymalizowaną cząsteczkę.
4) Otworzyć program Mercury
W programie Mercury otwórz zapisane, zoptymalizowane cząsteczki, te z
oryginalnych plików (AMXBPM10A (trimetoprim w postaci monokrystalicznej),
CESRUN, HAMYIE (trimetoprim w postaci krystalicznej z dodatkową cząsteczką w
strukturze  nazwij tą dodatkową cząsteczkę) oraz te  wyekstrahowane z plików pdb
(3FRE_ligand, 2W3A_ligand). Porównaj kąty torsyjne na łączniku alkilowym dla
wszystkich cząsteczek. Dane zestaw w tabeli, wraz ze schematem oznaczającym
wybrany kąt torsyjny.
Zagadnienia do opracowania:
Co powiesz o możliwości protonacji pierścienia heteroatomowego? Jak dodatkowa
cząsteczka w strukturze (struktury CESRUN i HAMYIE) może wpłynąć na własności
elektrostatyczne cząsteczki leku.
Używane oprogramowanie:
Pymol, Wincoot, Hyperchem, Mercury
Literatura:
G. Patrick "Chemia leków. Krótkie wykłady." PWN, 2004
R.F. Nalewajski "Podstway i metody chemii kwantowej" PWN, 2001
J. Sadlej "Półempiryczne metody chemii kwantowej: CNDO, INDO, NDDO" PWN, 1977
5