4640480892

50 M. SIKORSKI

—    różnica dróg optycznych dla badanej próby i związku wzorcowego powoduje względne przesunięcie wyznaczonych dla nich funkcji aparaturowych E{t).

—    funkcja aparaturowa E(t) zależy od częstości zliczania pojedynczych fotonów,

—    obecność światła rozproszonego modyfikuje kształt rejestrowanych krzywych zaniku fluorescencji,

—    niestabilności w pracy układu wzbudzającego i układu detekcji aparatury wpływają na zmianę kształtu rejestrowanych krzywych zaniku fluorescencji D(t) i D_m(t) (D_r(t)) lub ich względne przesunięcie.

Pomimo tego, że niektóre z wymienionych wcześniej efektów można korygować w trakcie obliczeń, procedura taka powinna być ograniczona do minimum, szczególnie wtedy, gdy nie znamy postaci funkcji I(t) [5, 22], Ze względu m.in. na trudną do wyeliminowania różnicę dróg optycznych w pomiarach D (f) i D_m(t) (D_r{t)) praktycznie zawsze w trakcie obliczeń musimy uwzględnić parametr S, zdefiniowany równaniami (5a) i (5b). Symbolicznie możemy to zapisać w postaci:

S, t)®I{t).    (14)

W metodach PST, EPSMT i DFCM poprzez wprowadzenie parametru S eliminuje się jedynie względne przesunięcie skali czasu występujące między D(t) a D_m(t). W metodzie CST wprowadzenie dodatkowej poprawki S wynika natomiast z faktu, że

F (ż_W2b, 2_cm, t) E (X_w

zb■»

Zaproponowano, m.in. w pracach [34, 35], rozwiązania techniczne mające na celu wyeliminowanie lub ograniczenie braku stabilności aparatury TCSPC w pomiarach krótkich czasów życia fluorescencji. Jednak, pomimo stosowania rozmaitych rozwiązań technicznych, istotny wpływ na dokładność, z jaką wykonywane są pomiary, a więc również na dokładność wyznaczanych w obliczeniach parametrów rzeczywistej funkcji zaniku fluorescencji, ma przyjęta procedura wykonywania pomiarów D(t) i D_m(t) (D_r(t)). Obecnie przedstawię stosowane w badaniach doświadczalnych procedury pomiarowe.

A.    Najczęściej stosowana procedura pomiarowa polega na wykonaniu pomiaru kolejno dla badanej próby i związku wzorcowego. Częstotliwość wykonywania pomiarów dla związku wzorcowego jest dowolna i w praktyce może to być nawet tylko jeden pomiar.

B.    W metodzie zaproponowanej przez Brittena i Lockwooda [36] pomiary wykonuje się dla badanej próby i dwóch związków wzorcowych różniących się czasami życia fluorescencji. Obliczenia początkowe wykonywane są tylko z wykorzystaniem związków wzorcowych w ten sposób, aby otrzymać dla obu