5192605640

34 A. KOZIK [2]

Badaniom mechanizmu wiązania różnych substancji przez białka przyznaje się przeto w wielu dziedzinach biochemii znaczenie podstawowe.

Pierwszym etapem takich badań jest termodynamiczna charakterystyka omawianego równowagowego procesu. Najważniejsze parametry termodynamiczne opisujące ilościowo kompleks białko-ligand, to maksymalna liczba cząsteczek ligandu przypadająca na jedną makrocząsteczkę białkową, precyzująca stechiometrię kompleksu, oraz stała równowagi jego tworzenia, która jest miarą mocy rozważanego oddziaływania. Opracowano wiele metod doświadczalnego wyznaczania tych parametrów.

Stosunkowo rzadko wykorzystywane były do tych celów techniki chromatograficzne i elektroforetyczne. W ostatnich latach zaproponowano wiele istotnych modyfikacji i udoskonaleń klasycznych metod tej grupy. Wykazano również możliwość zastosowania do badania oddziaływania białko-ligand burzliwie rozwijających się technik powinowactwa biologicznego.

Niniejszy artykuł stanowi przegląd różnych metoc^ chromatograficznych i elektroforetycznych pod kątem ich zastosowania do wyznaczania parametrów wiązania drobnocząsteczkowych ligandów przez białka. Uwypuklono niektóre szczególnie korzystne cechy tych metod w porównaniu z innymi technikami służącymi podobnym celom. Zasadniczy przegląd poprzedzony jest krótką informacją o teoretycznych sposobach analizy danych uzyskiwanych doświadczalnie.

II. Teoretyczny opis wiązania ligandu przez białko

Wielkościami, charakteryzującymi oddziaływanie białko-ligand a wy-znaczalnymi doświadczalnie są: stopień wiązania, wyrażany zwykle jako średnia liczba cząsteczek ligandu związanego przez jedną cząsteczkę białka (r), oraz równowagowe stężenie ligandu ([L]). Z wykresu ([L]), stanowiącego izotermę wiązania (1) można odczytać termodynamiczne parametry tylko po założeniu określonego modelu oddziaływania (2). Najczęściej stosowany ogólny model opiera się na prawie działania mas i zakłada istnienie wielostopniowej równowagi (3, 4):

Ki B + L^ BL	K, =	[BL] [B] [L]
BL + L ^ BL2	k2 =	[BL2]
		[BL] [L]
Kn 1 + L ^ BLn	K„ =	[BLn]
		[BL^HL]

B oznacza tutaj białko, L — monowalentny ligand, n — liczbę miejsc