7808335474

-    1,5 % r-r żelatyny w PBS do blokowania płytki

-    r-r handlowy substratu dla enzymu: TMB (3,3’,5,5’- tetrametylobenzydyna firmy Sigma do oznaczania aktywności peroksydazy chrzanowej lub pNPP (fosforan p-nitriofenolu) do oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej

-    IM H2SO4 lub 3M NaOH do zatrzymania reakcji enzymatycznej zachodzącej z udziałem peroksydazy chrzanowej lub fosfatazy alkalicznej, odpowiednio

>    Sprzęt:

-    mikropłytki polistyrenowe 96-studzienkowe

-    inkubator do mikropłytek Solo firmy ThermoLabsystem

-    płuczka automatyczna BIO-TEK EL 40108 Wellwash firmy ThermoLabsystem

-    mikropłytkowy czytnik do testów Multiskan RC z oprogramowaniem komputerowym (program Genesis) firmy ThermoLabsystem

-    pipety automatyczne nastawne na 100 pl, 200 pl, jedno- i wielokanałowe

-    probówki polipropylenowe z korkiem

-    probówki typu ependorf

>    Materiał do badań:

-    próbka badana (mleko, produkty fermentowane)

-    monoklonalne przeciwciała ludzkie - IgE - skierowane przeciwko P - laktoglobulinie

-    monoklonalne przeciwciała mysie skierowane przeciwko ludzkiej immunoglobulinie IgE skoniugowane z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną firmy Sigma

II. Metodyka

Metoda Pierce’a - oznaczanie białka przebiega w dwóch etapach, w pierwszym następuje chelatowanie (redukcja) jonów miedzi Cu²⁺ do Cu⁺ przez białko (zasadowe środowisko), w wyniku reakcji tworzy się barwny (jasnoniebieski) kompleks białkowo - miedziowy (reakcja biuretowa), w drugim etapie z powstałym wcześniej jonem miedziawym (Cu⁺) reaguje kwas bicinchoninowy (BCA), w wyniku chelatowania 2 molekuł BCA z 1 jonem Cu⁺ tworzy się barwny (fioletowy) produkt, którego absorbancja jest proporcjonalna do stężenia białka w próbce.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) jest testem immunoenzymatycznym wykorzystującym reakcję barwną enzymu sprzężonego z przeciwciałem do jakościowego i ilościowego oznaczania antygenów. Reakcja z enzymem tworzy barwny produkt, którego stężenie może być oznaczone spektrofotometrycznie. Ilość powstałego produktu odpowiadająca stężeniu kompleksu przeciwciało-antygen jest proporcjonalna (ELISA pośredni, bezpośredni,