16.02.2004

II. Morfologia jądra komórkowego

Jądro komórkowe oddzielone jest od cytosolu otoczką z dwóch błon. Istnienie takiej bariery pozwala na czasowe i przestrzenne oddzielenie transkrypcji i translacji. Ma to związek z obróbką genów podzielonych u Eucaryota (egzony i introny, czapeczka, poli-A, ligazy łączą sekwencje kodujące - pomiędzy powstawaniem pre-mRNA a translacją transkrypty muszą być chronione przed dostępem rybosomów). W jądrze do nici DNA nie przyłączają się rybosomy. U Procaryota nie ma potrzeby rozdziału tych procesów, translacja zachodzi często równocześnie z transkrypcją.

Oddzielenie jądra kom. od cytozolu

→ izolacja pierwotnych transkryptów od rybosomów

→ umożliwia dojrzewania posttranskrypcyjne

W kom. prokariotycznych:

1 transkrypt - jeden gen (rRNA)

do końca 5' dołączają się rybosomy - translacja

W kom. eukariotycznych:

egzony + introny

transkrypt pierwotny: pre-rRNA (bez możliwości przyłączania rybosomów) -> dojrzewanie -> wzorzec translacji

wycinanie intronów przez endonukleazy; introny ulegają degradacji lub nie

egzony powiązane ze sobą przez ... (enzymy) - splicing

Wniosek:

transkrypcja i translacja - oddzielone przestrzennie i czasowo

W komórkach merystematycznych i innych rosnących (dzielących się) jądro komórkowe jest duże. Istnieją komórki dwujądrzaste (bikariocyty, np. hepatocyty) i wielojądrzaste (np. w osteoklastach)

Skład jądra komórkowego:

• Otoczka jądrowa - Składa się z błony zewnętrznej, która ma łączność z aparatem Golgiego oraz z błony wewnętrznej. Pomiędzy nimi znajduje się przestrzeń perinuklearna. Na błonie zewnętrznej utwierdzone są rybosomy, znajdują się tam także białka enzymatyczne (występujące także w ERg): cytochromy P₄₅₀ i B₅. Błona wewnętrzna zawiera białka LAP (Lamin Associated Proteins): LAP 1A, 1B, 1C, 2, które wiążą błonę otoczki z laminą (blaszką podstawną) - elementem struktury matrix jądrowej. W trakcie profazy otoczka rozpada się na pęcherzyki.

W otoczce jądrowej znajdują się pory (jądrowe kompleksy porowe) odpowiedzialne za transport do i z jądra.

Ich liczba jest zmienna, zależy od intensywności metabolizmu, a zatem m. in. wieku komórki.

Do jądra transportowane są m. in. białka histonowe, czynniki transkrypcyjne, białka budujące rybosomy, natomiast na zewnątrz: mRNA, tRNA i podjednostki rybosomów. Energia do transportu pochodzi z hydrolizy ATP lub GTP.

Budowa i działanie poru:

Jądrowe kompleksy porowe zakotwiczone są w obydwu błonach otoczki za pośrednictwem integralnych białek błonowych: POM121 i GP210.

Pojedynczy por stanowi kompleks zbudowany z białek z grupy glikoprotein nazywanych - ze względu na lokalizację i funkcję - nukleoporynami. (Do tej pory u różnych ogranizmów odkryto ponad 100 różnych nukleoporyn.)

Pory posiadają oktamerową symetrię, składają się z trzech pierścieni: wewnętrznego (centralnego, jądrowego - osadzonego w wewnętrznej błonie otoczki), środkowego (pokrywającego się z przestrzenią perinuklearną) i zewnętrznego (cytoplazmatycznego - osadzonego w zewnętrznej błonie otoczki) zbudowanych z nukleoporyn.

Pierścień centralny (wewnętrzny) jest zdubowany z tetramerów, pomiedzy którymi znajdują się kanały o średnicy około 10 nm ułożone na kształt ośmiu szprych w kole rowerowym. Tam odbywa się transport bierny (dyfuzja jonów i małocząsteczkowych związków).

Natomiast w kanale centralnym o średnicy 20-25 μm ma miejsce transport aktywny, do którego niezbędne są białkowe przenośniki. Transportowane cząsteczki mają domeny sygnałowe, podczas transportu następuje rozkład związków wysokoenergetycznych.

Dodatkowo pory wzmacniają filamenty.

• Szkielet czyli martix jądrowa - Zapewnia odpowiednie ułożenie chromatyny. Skład matrix:

• Lamina (blaszka podstawowa połączona z martix) - białkowa warstwa pod błoną jądrową, połączona z nią za pośrednictwem białek LAP (znajdujących się w otoczce).

Jej podstawowym składnikiem są białka laminy, które - za względu na różne zachowanie w stosunku do chromatyny - dzieli się na kilka klas: A, B1, B2, C. Laminy B1 i B2 wchodzą w reakcje z chromatyną, `dość stałe' połączenie. Laminy A i C łączą się z białkami LAP.

Laminy zorganizowane są w filamenty pośrednie (u roślin jest to jedyny typ filamentów pośrednich). Mają dwa końce: C-terminalny i NH2-terminalny .

Pojedynczy filament ma postać dimeru, którego elementy są helikarnie oplecione wokół siebie. Na krańcach znajdują się bardzo istotne sekwencje aminokwasów: sekwencja sygnałowa oraz sekwencje łączące z białkami LAP.

Fosforylacja lamin przez MPF powoduje rozpad laminy (blaszki podstawowej), a co za tym idzie - również otoczki.

• Siateczka wewnątrzjądrowa - Jest najmniej stabilna i znana, bardzo trudna do wyizolowania. Istnieją formy: włókienkowa i włókienkowo-granularna. Część włókienkowa prawdopodobnie tworzy szkielet dla tych odcinków chromatyny, w których ulega ona transkrypcji. Uwaga! Niejasność! W części włókienkowej wykryto enzymy: topoizomerazy i polimerazy 2 (związane z rozluźnioną chromatyną), co może oznaczać, że tu odbywa się replikacja. W części włókienkowo-granularnej znajdują się pierwotne transkrypty pre mRNA (odpowiedzialna za posttranskrypcyjne dojrzewanie mRNA)

• Matrix jąderkowa (białkowy szkielet jąderka) - do tej pory odkryto 3 rodzaje białek tu występujących:

• B26 - odpowiedzialne za końcowe procesy składania podjednostek rybosomowych

• fibrylamina - białko zasadowe, pojawia się tam, gdzie dojrzewają pre mRNA

• nukleolina - ufosforylowana - osłabia powinowactwo histonu H1 do DNA, występuje w tych rejonach, gdzie zachodzi transkrypcja; nieufosforylowana - jest jedym z białek inicjujacych rozcinanie pierwotnych transkryptów rRNA

Funkcje macierzy jądrowej (informacje zbiorcze):

-udział w organizacji strukturalnej jądra i tworzeniu konfiguracji przestrzennej chromatyny

- rola w procesie replikacji DNA (wieloenzymatyczne kompleksy replikacyjne)

- regulacja ekspresji genów

- udział w transkrypcji i dojrzewaniu pre rRNA oraz snRNA, a także transporcie prekursorów rybosomów do cytoplazmy

- wiązanie hormonów steroidowych

- fosforylacja białek wirusowych

• wiązanie karcynogenów

• Chromatyna - Składa się z DNA, histonów (DNA + histony = zrąb jądrowy) oraz ruchliwych elektroforetycznie białek niehistonowych, występuje tu także snDNA (small nuclear DNA, małe jądrowe DNA).

• DNA - Łańcuchy polinukleotydowe skręcone są w prawoskrętną, dwuniciową helisę o średnicy 2nm. Jeden skręt helisy o długości 3,4 nm zawiera 10 par nukleotydów - DNA B. DNA Z - lewoskrętna helisa. DNA A - o największej średnicy.

Ze względu na ich liczebność sekwencje DNA dzielą się na:

• Unikalne

• występują w liczbie 2 na genom

• geny dla białek niehistonowych i białek zapasowych u roślin

• Powtarzalne

• do 10⁵-10⁶

- w DNA bardzo mocno upakowanym (heterochromatyna)

• Umiarkowanie powtarzalne

• 10³-10⁵

• geny kodujące rRNA, tRNA, histony, ...

• Wysoce powtarzalne - satelitarne, które nie zawierają genów, wchodzą w skład heterochromatyny konstytucyjnej (nie są transkrybowane)

Rozproszone i tandemowe (sekwencje powtarzalne występują najczęściej w formie tych ostatnich - tandemowych) - bogate w tyminę i adeninę

SAR/MAR - za ich pośrednictwem DNA łączy się z białkami histonowymi matrix jądrowej lub siateczki wewnątrzjądrowej;

• Histony - białka zasadowe bogate w Liz (H1, H2A, H2B) i Arg (H3, H4). Ich wypadkowy ładunek jest dodatni (przyciąganie elektrostatyczne z ujemnie naładowanym DNA). Histony są syntetyzowane w fazie S, są konserwatywne ewolucyjnie, najbardziej zmienny jest histon H1.

Modyfikacje w strukturze chromatyny (Remodeling chromatyny - zmiany w interakcjach białka - DNA wpływające na konformację chromatyny tak, aby umożliwić lub zahamować ekspresję określonych genów.

2 mechanizmy:

1. oparty na acetylacji/deacetylacji (np. metylacja) w rdzeniu nukleosomowym

2. zależny od działania ATP oraz kompleksów białek SWI/SNF

Modyfikacje histonów:

• Metylacja - przyłączanie grupy metylowej po syntezie histonu. Najczęściej zachodzi metylacja lizyny, rzadziej argininy i histydyny

• wpływa na interakcje z DNA

• zachodzi podczas replikacji

• reakcja nieodwracalna

• H3 i H4, które stanowią rusztowanie nukleosomu

• Fosforylacja - Najważniejszą rolę odgrywa fosforylacja seroniny i kreoniny w H1. Ma ona związek z kondensacją chromatyny

• związek z kondensacją

• proces odwracalny

• H1, H2A, H3

• H1 w interfazie jest ufosforylowane w niewielkim stopniu

• Acetylacja - Przyłączenie reszty kwasu octowego, co powoduje ujemne naładowanie histonów i rozluźnienie struktury nukleosomalnej DNA. Proces ten jest odwracalny i prowadzony przed replikacją i transkrypcją przez acetylotransferazy (acetylotransferazy sprawiają, że proces acetylacji jest odwracalny).

• w rdzeniu nukleosomów

• odwracalny

• związek z replikacja i transkrypcją

• superacetylowane histony H3 i H4 w komórkach o wysokiej aktywności transkrypcyjnej

• dotyczy reszt Ser i Liz w N-terminalnych końcach histonów

• osłabia kontakt histonów z DNA

Upakowanie chromatyny:

- nukleosom - histonowy rdzeń z nawiniętym lewoskrętnie DNA (ok. 140 par zasad). Trzonem jest tetramer złożony z H3 i H4. Na obrzeżach znajdują się 2 dimery: H2A i H2B.

- włókno nukleosomowe (średnica 11nm) - nukleosomy połączone odcinkami łącznikowymi w szereg, DNA łącznikowe wchodzi w interakcję z H1 (H1 nie występuje w nukleosomie)

- włókna chromatynowe (średnica 30nm) - odcinki nieczynne, odpowiedzialne są za nie H1

- Solenoid, supersolenoid (średnica 300nm) - tu już rolę odgrywają białka matrix i oddziaływanie SAR z białkami histonowymi, - na jeden skręt przypada 1-6 nukleosomów

- chromosomy metafazowe (średnica 1400nm) - najbardziej skondensowane

Podział chromatyny:

• Heterochromatyna konstytucyjna

• Skondensowana (istnieją różne stopnie kondensacji), nieczynna.

• Jej ilość jest genetycznie zdeterminowana.

• Zawiera wysoce powtarzalne sekwencje satDNA (satelitarny DNA).

• Nie zawiera sekwencji transkrybowanych.

• Histony H3, H4 i H2B nie ulegają acetylacji.

• Metylacja Lis (lizyny) 9 w histonie H3 blokuje dostęp czynników transkrypcyjnych.

• Rekombinacje mejotyczne sporadyczne (rzadko crossing-over).

• Ten typ chromatyny dekondensuje tylko podczas replikacji (pod koniec fazy S).

• Niedostępna dla nukleaz i czynników mutagennych.

• Barwi się intensywnie.

• Euchromatyna

• Występuje w różnych stanach kondensacji, głównie solenoidu 30 nm.

• Zawiera sekwencje transkrybowane, unikalne.

• Replikowana jest podczas całej fazy S.

• Dochodzi tu do częstych rekombinacji mejotycznych.

• Wzrost acetylacji histonów tam, gdzie aktywna chromatyna.

• Obniżona metylacja Lis 9 w histonie H3.

• Dostępna dla nukleaz i związków mutagennych.

• Jąderko

• Nie jest oddzielone od reszty jądra żadna błoną!

• Zawiera odcinki DNA kodujące rRNA.

• Znajdują się tu białka enzymatyczne, białka budujące przyszłe rybosomy.

• Zachodzą tu następujące procesy:

• Transkrypcja genów dla rRNA, dojrzewanie

• Synteza 3 klas rRNA, różniącego się...

• 18S rRNA -> mniejsze podjednostki

• 25S -> większe

• 5S -> większe

ssRNA syntezowane poza jąderkiem (???)

Zawiera białkową matrix, geny dla rRNA, nie posiada błony. Tu znajduje się cały aparat służący do produkowania rRNA. W chromosomach jąderkotwórczych (najczęściej jest ich 2) we wtórnych przewężeniach znajduje się DNA kodujące rRNA. Czasem dochodzi do implifikacji (powielenia) genów kodujących rRNA (w komórkach o wzmożonym metabolizmie). W DNA - specyficzne sekwencje SAR/MAR - wchodzą w bezpośrednie i b. trwałe połączenia z laminami β.

Elementy strukturalne jąderka (widoczne w mikroskopie elektronowym):

- centrum fibrylarne - tu znajdują się te odcinki rDNA, które nie są aktualnie transkrybowane

• gęsty składnik fibrylarny (elektronogęsty) - tu działają enzymy, aktywna transkrypcja;

znajdują się tu:

• rDNA, na których przebiega transkrypcja

• transkrypty dla rRNA, które podlegaja dojrzewaniu itd.

• Enzymy z tym związane

• składnik granularny - zewnętrze jąderka;

• jego ilość jest zmienna, zależy od aktywności metabolicznej jąderka

• zawiera podjednostki rybosomów

Nie całe RNA powstaje w jąderku: tylko RNA 18s (mała podjednostka), 5,8s i 28s (duże podjednostki). Poza jąderkiem powstaje RNA 5s (należy również do dużej podjednostki)

Typ polimerazy	Miejsce działania	Transkrybowane geny
I	jąderko	18s rRNA 5,8s rRNA 28s rRNA
II	chromatyna	Geny kodujące białka Geny snRNA (small nuclear RNA) występują w spliceosomach, są malutkie, nie wychodzą z jądra
III	chromatyna	tRNA 5s rRNA Geny małych strukturalnych RNA

U roślin zaobserwowano 3 typy jąder (ze względu na wyraźną różnicę między hetero- i euchromatyną):

• Retikularne - dobrze odróżnialna chromatyna, tu zalicza się jądra „okapowe” - zawierają chromosomy w konfiguracji Rabbla

• Retikularne z chromocentrami - chromocentry tam gdzie niewiele DNA; 2cDNA :20-40pg), mają bardzo rozproszoną heterochromatynę

• Chromocentryczne - w jądrach z bardzo małą ilością DNA, euchromatyna jest tu bardzo rozproszona i słabo rozróżnialna

Ilość DNA nie ma wpływu na rozwój organizmu i jego stanowiska systematycznego. Płeć zależna od chromosomów X (żeński) i Y (męski). Wyjątkiem są m.in. świerszcze (XX-samiec, X-samiczka). Ciałka Barra (zheterochromatynizowany (zkondensowany) drugi homosom X) - odpowiedzialne są za prawidłowy rozwój samiczki (bardzo wyraźnie się barwią).

Co badaliśmy na ćwiczeniach:

Do obserwacji morfologii jądra komórkowego wykorzystywaliśmy materiał roślinny z kilku powodów:

• max. st. kondensacji

• wyraźna różnica między hetero- i euchromatyną

Typy morfologiczne jądra komórkowego:

• Jądro retikularne (siateczkowe). Przekrój przez zalążek krasnokwiatu (Haemanthus sp.). Preparat barwiony hematoksyliną żelazistą.

• Jądro „okapowe”. Przekrój przez merystem wierzchołkowy korzenia jęczmienia (Hordeum vulgare).

• Jądro euchromocentryczne. Przekrój prze merystem wierzchołkowy korzenia rzepaku (Brassica napus).

• Jądro retikularne z chromocentrami. Przekrój przez merystem wierzchołkowy korzenia cebuli.

• Jąderka w komórkach merystemu wierzchołkowego korzenia cebuli (Allium cepa). W jąderkach widoczne „wakuole jąderkowe”.

• Makro i mikronukleus orzęska (Tetrahymena thermophila). Barwnik Giemzy.

• Jąderka w komórkach merystemu wierzchołkowego korzenia rzepaku (Brassica napus). Widoczna nuleonema. Safranina z zielenią.

• Heteropyknoza chromosomu X. Przekrój przez cewkę w jądrze owada z rzędu Orthoptera. Widoczne jądra komórkowe w stadium pachytenu podczas spermatogenezy.

1

---