Genetyczne czynniki chorobotwórcze

Etiologia i patogeneza wybranych zaburzeń

genetycznych u zwierząt

Genetyczne czynniki chorobotwórcze

1.

Kariotypy zwierząt domowych.

2.

Metody badania i zasady opisu kariotypów.

3.

Kariotypy wzorcowe i identyfikacja chromosomów przy użyciu prążków G i C.

4.

Typy mutacji punktowych i chromosomalnych: strukturalnych i liczbowych.

5.

Zaburzenia genetyczne u zwierząt domowych spowodowane przez mutacje chromosomalne
strukturalne: translokacja robertsonowska u bydła, odwrócenie płci u koni, odwrócenie płci
u psów.

6.

Mutacje chromosomalne strukturalne jako przyczyny nowotworów – chromosom
Philadelphia (Ph1) u ludzi i psów.

7.

Zaburzenia genetyczne u zwierząt domowych spowodowane przez mutacje chromosomalne
liczbowe (monosomia chromosomu X u klaczy, trisomie chromosomów somatycznych u koni
i bydła, występowanie nadliczbowych chromosomów X lub Y u koni).

8.

Metody identyfikacji mutacji genowych:

9.

PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy

10. RFLP – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych.
11. Choroby genetyczne uwarunkowane mutacjami genowymi – etiologia i patogeneza (BLAD –

niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych u bydła, DUMPS – niedobór syntazy
monofosforanu urydyny u bydła, PSS – syndrom stresowy u świń)

12. Wykorzystanie metod PCR i RFLP w diagnostyce BLAD, DUMPS i PSS.
13. Reakcja PCR i RFLP – animacje komputerowe.

14. Ćwiczenie praktyczne

: izolacja chromosomów i analiza kariotypu w oocytach

prawidłowych oraz oocytach z zaburzeniami o charakterze euploidii i aneuploidii
pochodzących od świń.

Diploidalna liczba chromosomów niektórych gatunków zwierząt (wg Datta’y 1979, Kluga i cummingsa 1983,

Larousse’a 1990 oraz Świtońskiego 1982, 1987, 1988)

Nazwa zwyczajowa

Nazwa gatunkowa

2n

Człowiek
Szympans

Goryl

Rezus
Bydło domowe
Bydło zebu
Bawół azjatycki
Koza
Owca
Świnia domowa
Dzik
Koń domowy
Koń Przewalskiego
Osioł
Onager (półosioł)
Wielbłąd jednogarbny
Pies

Szakal

Lis pospolity

Homo sapiens

Pan troglodytes

Gorilla gorilla

Macaca mullata

Bos taurus

Bos indicus

Bubalus bubalis

Capra hirus

Ovis aries

Sus domestica

Sus scrofa

Equus caballus

Equus caballus przewalski

Equus asinus

Equus hemionus onager

Camelus dromedarius

Canis familiaris

Canis aureus

Vulpes vulpes

46

48

48

42

60

60

48

60

54

38

36

64

66

62

56

70

78

78

34

W niektórych narządach, np. wątrobie, występują komórki o zwielokrotnionej liczbie chromosomów, zwane poliploidalnymi

W zależności od umiejscowienia centromeru chromosomy dzielimy na:

1. Metacentryczne – centromer pośrodku długości chromosomu

2. Akrocentryczne – centromer blisko końca chromosomu

3. Submetacentryczne – pozycja pośrednia centromeru w odniesieniu do chromosomów

meta- i akrocentrycznych

4. Telocentryczne – centromer na końcu chromosomu

W chromosomie metacentrycznym ramiona p (krótkie) i q (długie) są równej długości

Typy mutacji chromosomowych strukturalnych

1.

Deficjencja

a) terminalna

b) interstycjalna

2.

Translokacje

a) fuzje centryczne

b) insercje

3.

Duplikacja

4.

Inwersja

a) paracentryczna

b) pericentryczna

5. Izochromosomy

6. Chromosomy pierścieniowe

7. Chromosomy dicentryczne

Trisomie chromosomów bydła

Kariotyp

Rasa

Płeć

Fenotyp

60,XX + 22

Simental

F

Normalny

60,XX t(12;12)+12

Simental

F

Defekt budowy, martwe urodzenia

60,XX t(20;20)+20

Simental

F

Defekt budowy, martwe urodzenia

61,XX + 19

Simental

F

Normalny

61, XY + 20

Romanga la

M

Deformacja kończyn, ślepota , brak zewnętrznych narządów płciowych

61, XY + 27

Hereford

M

Ogólny niedorozwój narządów wewnętrznych, hipoplazja płuc

60,XX/60, XY/61, XXY

Simental

M

Hipoplazja jąder, degeneracja nasieniowodów

61, XXY

Simental

M

Hipoplazja jąder, oligospermia

60,XY/61, XXY

Hereford

M

Niska jakość nasienia

61,XXY

Hereford

M

Żeńskie cechy budowy, hipoplazja jąder, azoospermia

61,XXX

Charolaise

F

Normalny

Translokacja robertsonowska

–

fuzja centryczna pojawiająca się najczęściej u bydła.

Polega na połączeniu się centromerami dwóch akrocentrycznych autosomów
i wytworzeniu formy meta- lub submetacentrycznej. Wystąpienie takich struktur
w komórkach prowadzi do zmniejszenia ogólnej liczby chromosomów z utrzymywaniem
się dotychczasowej liczby ramion chromatyd i nie zmienionej ilości DNA. Najczęściej
spotykana jest fuzja największego (1) i najmniejszego (29) autosomu, znana jako
translokacja 1:29. Ta forma aberracji występuje u ponad 60 ras bydła domowego, m.in. u
szwedzkiego czerwono-białego, rasy południowosyberyjskiej i u rasy polskiej czerwonej.
Nosiciele translokacji – zarówno buhaje, jak i krowy odznaczają się prawidłową budową i
parametrami fizjologicznymi.
Negatywnym efektem tej aberracji jest obniżenie płodności nosicieli powodowane
wzrostem wczesnej śmiertelności zarodkowej.
Translokacje robertsonowskie stwierdza się także u owiec, kóz, świń i lisów polarnych (u
tych ostatnich obserwuje się korzystne efekty mutacji).

Translokacja albo fuzja robertsonowska chromosomu 1/29 u krowy

PCR – Polymerase Chain Reaction

(łańcuchowa reakcja syntezy fragmentów DNA

RFLP- Restriction Fragment Lenght Polymorphism

(polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych)

BLAD- Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency

(wrodzony niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych

u bydła)

LAD- Leukocyte Adhesion Deficiency

(wrodzony niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych)

DUMPS-Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase

(wrodzony deficyt syntazy monofosforanu urydyny)

PSS- Porcine Stress Syndrome

(zespół stresowy świń)

Zastosowanie techniki PCR

1) Identyfikacja kwasów nukleinowych genów, bakterii, wirusów

2) Wykrywanie czynników zakaźnych, zwłaszcza latentnych wirusów

3) Prenatalna diagnostyka genetyczna

4) Wykrywanie polimorfizmu alleli

5) Precyzyjne ustalanie typu tkanek do transplantacji

6) Badania nad ewolucją przy wykorzystaniu próbek kopalnych

7) Diagnostyka chorób genetycznych – etap wstępny

Materiałem do izolacji kwasu nukleinowego mogą być:

hodowla komórkowa, bakterie, krew, wyciągi tkankowe, mleko, sperma, cebulki włosowe

Aby zamplifikować poszukiwany fragment DNA potrzebne są:

1) Wyizolowany z materiału biologicznego i oczyszczony DNA (matryca)

2) Mieszanka nukleotydów zawierająca A, C, G, T –składniki potrzebne do zbudowania nowej nici

interesującego nas fragmentu DNA

3) Polimeraza DNA

4) Czynniki inicjujące syntezę – startery - syntetyczne oligonukleotydy o sekwencji odpowiadającej ściśle

obu końcom powielanego odcinka

Postępowanie przy wykrywaniu chorób genetycznych

1)

Izolacja DNA z wybranego materiału biologicznego

2) Amplifikacja metodą PCR analizowanego fragmentu DNA

3) Analiza restrykcyjna zamplifikowanego genu (RFLP)

4) Uwidocznienie fragmentów restrykcyjnych za pomocą elektroforezy

(charakterystyczny dla danego genu i mutacji zestaw fragmentów restrykcyjnych
o określonej długości pozwalający stwierdzić, czy badany materiał pochodził
od osobnika zdrowego, chorego, czy też od nosiciela)

Niedobór leukocytarnych cząsteczek adhezyjnych u bydłą (BLAD)

383 nukleotyd

GEN PRAWIDŁOWY

….CATCGACCTGT…

MUTACJA BLAD …..

CATCGGCCTGT ….

Taq I

1

2 3 1 genotyp normalny

2 homozygota mutacji BLAD

3 nosiciel mutacji BLAD

Wykrywanie mutacji punktowej będącej przyczyną BLAD u cieląt metodami PCR/RFLP.

Courtesy the Hospital Practice web site ...

Wykrywanie mutacji
punktowej będącej przyczyną
DUMPS u bydła metodami
PCR/RFLP.

Przykłady enzymów
restrykcyjnych
wykorzystywanych
w technice RFLP
oraz rozpoznawanych
przez nie sekwencji
palindromowych

Wykrywanie mutacji
punktowej będącej przyczyną
PSS u świń u osobników
chorych i nosicieli metodami
PCR/RFLP.

Nondysjunkcja mejotyczna jako przyczyna aberracji liczbowych o charakterze aneuploidii

Kariotyp (chromosomy
w płytce metafazowej)
pochodzące od:
a. klaczy (64,XX)
b. ogiera (64,XY)
c. klaczy z monosomią

chromosomu X (63,X0)

d. klaczy z trisomią

chromosomu X
(65,XXX)

1. Jajniki pobrać podczas uboju i w ciągu godziny przetransportować do laboratorium

w płynie fizjologicznym (temp. 30-37

o

C).

2. Wyznaczyć na szkiełku podstawowym pole o pow. ok. 1 cm

2

.

3. Umieścić kroplę podłoża hodowlanego w wyznaczonym polu.
4. Po oczyszczeniu jajnika z okolicznych tkanek, przepłukaniu w płynie fizjologicznym

oraz umieszczeniu w jałowej płytce Petriego, wykonać nakłucie pęcherzyków i aspirację
płynu zawierającego oocyty.

5. Pobrany płyn przenieść do kropli podłoża umieszczonej na szkiełku podstawowym

i pod kontrolą mikroskopu sprawdzić miejsce położenia oocytów.

6. Oocyty poddać działaniu I-go roztworu utrwalającego (metanol/kwas octowy – 1:1) –

nanosząc pod kontrolą mikroskopu 1-2 krople – pozostawić na 5 min.

7. Następnie nanieść na preparat oocytów 1-2 krople II-go roztworu utrwalającego

(metanol/kwas octowy – 3:1) – pozostawić na 60 min., uzupełniając roztwór
w przypadku wysychania.

8. Usunąć nadmiar II-go roztworu utrwalającego i zabarwić preparaty 5% roztworem

barwnika Giemzy (5-10 min).

9. Dokonać pod mikroskopem analizy pod kątem oceny stadium dojrzewania

i występowania ewentualnych aberracji.

Ćwiczenie praktyczne: izolacja chromosomów i analiza kariotypu w oocytach

prawidłowych oraz oocytach z zaburzeniami o charakterze euploidii i aneuploidii

pochodzących od świń.

Chromosomy wyizolowane z oocytów świń -

obraz spod mikroskopu odwróconego pola

Oocyt - klasa I

Oocyt - klasa III

Oocyt - klasa IV

Analiza chromosomów (Giemsa, FISH)
w ooocytach świń dojrzewającyhch in vitro .
Giemsa: (A)oocyt haploidalny(n = 19);
(Boocyt diploidalny (2n = 38).
FISH: ©oocyt haploidalny; (D) aneuploidia
disomia chromosomu 1; (E) aneuploidia
disomia chromosomu 10; (F)oocyt
diploidalny.