POLITECHNIKA KOSZALIŃSKA

WYDZIAŁ MECHANICZNY

KATEDRA BIOCHEMII I BIOTECHNOLOGII

Instrukcje do ćwiczeń laboratoryjnych dla kierunku TŻiŻCz

TECHNOLOGIE ENZYMATYCZNE

Ćwiczenie 3

HYDROLIZA SACHAROZY –

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA

DLA INWERTAZY DROŻDŻOWEJ

Prowadząca:

mgr inż. Małgorzata Smuga

ĆWICZENIE 3

HYDROLIZA SACHAROZY - WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA

DLA INWERTAZY DROŻDŻOWEJ

Wprowadzenie:

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy

do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć

sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza,

podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito

cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z nektaru

kwiatowego do cukrów prostych.

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek

nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci stałej (głównym

składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w ciągu kilkutygodniowego

„dojrzewania" czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej w procesie produkcji, sacharoza

rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć ze środowiska powodują w efekcie

upłynnienie nadzienia.

Celem ćwiczenia jest poznanie właściwości hydrolitycznych inwertazy z drożdży.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży

2 g drożdży rozetrzeć w moździerzu z piaskiem, dodać ok. 10 cm wody i ponownie dokładnie

rozetrzeć i odwirować. Supernatant wlać do 5-krotnej objętości acetonu. Wytrącony osad rozpuścić

w 10 cm wody i przesączyć. Przesącz zawierający enzym można przechowywać w lodówce kilka

tygodni.

Zadanie 2. Oznaczanie aktywności inwertazy

1 g drożdży rozprowadzić w 6 ml ciepłej wody (do 40°C). Przygotować 2% roztwór sacharozy

(stężenie substratu ustalić z prowadzącym). Do probówki wprowadzić 2 ml roztworu substratu,

a następnie dodać

1

ml

roztworu

enzymu.

Pobierać

próbkę co

1 - 5

min

(w zależności

od otrzymywanych wyników - czas ustalać z prowadzącym) i sprawdzać stężenie glukozy przy

pomocy paska diagnostycznego, nanosząc na niego bagietką kroplę badanego roztworu i po 30 s

porównując barwę ze wzorcem. Reakcję prowadzić, w zależności od wyników, przez 5 - 1 5 min.

Badanie powtórzyć dla innego stężenia substratu.

Narysować wykres oraz wyznaczyć rząd reakcji, stałą szybkości reakcji k i szybkość początkową dla

każdego stężenia substratu. W przypadku oznaczeń dla kilku stężeń substratu wyznaczyć Km oraz

V

max

Zadanie 3. Do probówki wprowadzić inny substrat (np. rozcieńczone mleko) oraz enzym w ilościach

j.w. i zbadać stężenie glukozy po czasie odpowiadającym maksymalnemu stężeniu glukozy

w poprzedniej części ćwiczenia.

Zadanie 4. Powtórzyć doświadczenie 2, dodając do enzymu NaCl w takiej ilości, by otrzymać

ostateczne stężenie w próbie 5%.

Zadanie 5. Wyniki zestawić w tabeli/tabelach oraz przedstawić na wykresie/wykresach (zależność

stężenia produktu od czasu, stężenia substratu od czasu, wykres Michaełisa- Menten i Lineweavera-

Burka). Określić działanie NaCl na przebieg reakcji enzymatycznej.

Zadanie 6. Oznaczyć stężenie enzymu w roztworze metodą biuretową. Oznaczanie stężenia białka

metodą biuretową: Do kolbek odmierzyć po 1 cm kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody

destylowanej), dodać po 4 cm

J

odczynnika miedziowego, do drugiego zestawu dodać po 4 cm

3

odczynnika zmętnieniowego. Wszystkie próby wykonywać w 3 powtórzeniach. Po 30 min odczytać

absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej

(po uwzględnieniu zmętnienia), zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie.

Zagadnienia do przygotowania:

1. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

2. Inwertaza i oksydaza glukozowa.

3. Izolacja i oczyszczanie enzymów.

Literatura:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii", PWN Warszawa - Poznań

1982.

2. Stryer L.: „Biochemia", PWN Warszawa 1986.

3. Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)", Wydawnictwo

UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

4. Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników

żywności", Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005