Biologia molekularna

SPIS TREŚCI

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 1 ................................................................................................. 4

Znakowanie i izolacji kwasów nukleinowych ...................................................................................... 4

Adsorpcja ............................................................................................................................................. 4

Filtracja żelowa .................................................................................................................................... 4

Powinowactwo .................................................................................................................................... 5

Wytrząsanie za pomocą alkoholu ........................................................................................................ 6

Od czego zależy metoda izolacji DNA? ................................................................................................ 6

Enzymy restrykcyjne ............................................................................................................................ 6

Nomenklatura enzymów restrykcyjnych: ............................................................................................ 7

Elektorforeza ....................................................................................................................................... 7

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 2 ............................................................................................... 10

Elektroforeza pulsowa (pulsacyjna). ................................................................................................. 10

Hybrydyzacja. Techniki hybrydyzacyjne ............................................................................................ 11

Kategoryzacja technik hybrydyzacyjnych .......................................................................................... 11

Transfer ............................................................................................................................................. 12

Utrwalenie ......................................................................................................................................... 12

Co się dzieje w trakcie hybrydyzacji? ................................................................................................ 13

Detekcja ............................................................................................................................................. 13

PCR. Techniki PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy. ...................................................................... 14

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 3 ............................................................................................... 16

RT – PCR, In Situ –PCR ....................................................................................................................... 16

Zalety i wady RT-PCR ........................................................................................................................ 16

In Situ- PCR ........................................................................................................................................ 17

Sekwencjonowanie ............................................................................................................................ 17

Sekwencjonowanie automatyczne .................................................................................................... 18

Strategie sekewncjonowania............................................................................................................. 19

Rodzaje matryc .................................................................................................................................. 19

Techniki klonowania molekularnego (wytwarzania klonów). ........................................................... 19

Selekcja .............................................................................................................................................. 20

Klonowanie a wektory ....................................................................................................................... 20

Transformacja .................................................................................................................................... 21

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 4 ............................................................................................... 22

Wektory plazmidowe w klonowaniu (c.d.) ........................................................................................ 22

Fag Lambda i jego pochodne ............................................................................................................. 22

Cykl rozwojowy faga .......................................................................................................................... 22

Rodzaje wektorów fagowych ............................................................................................................ 23

Klonowanie w wektorze fagowym .................................................................................................... 24

Pakowanie In Vitro ............................................................................................................................ 24

Infekcja E. coli .................................................................................................................................... 25

Wektory kosmidowe ......................................................................................................................... 25

Wektory wielkopojemnościowe YAC................................................................................................. 26

Schemat klonowania ......................................................................................................................... 27

Biblioteki DNA ................................................................................................................................... 27

Dlaczego tworzymy biblioteki genomowe?....................................................................................... 28

Przeprowadzanie selekcji metodą immunologiczną i hybrydyzacyjną ............................................. 29

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 5 ................................................................................................ 30

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 6 ............................................................................................... 32

Mapy genetyczne ............................................................................................................................. 32

Markery molekularne ........................................................................................................................ 33

Analiza wycinka mapy zintegrowanej ............................................................................................... 33

Organizacja genomu .......................................................................................................................... 34

Chromosom bakteryjny – organizacja i budowa ............................................................................... 34

C-value paradox ................................................................................................................................. 35

Jak genomy są uorganizowane? ........................................................................................................ 36

Modyfikacje histonów ....................................................................................................................... 37

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 7 ............................................................................................... 38

Sekwencje repetytywne .................................................................................................................... 38

Replikacja........................................................................................................................................... 40

Kontrola replikacji ............................................................................................................................. 43

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 8 ............................................................................................... 45

Kontrola pozytywna i negatywna procesu replikacji. ........................................................................ 45

Przepływ informacji genetycznej w komórce: transkrypcja. ............................................................. 45

Transkrypcja u bakterii ...................................................................................................................... 45

Kontrola transkrypcji ......................................................................................................................... 47

Operon tryptofanowy ........................................................................................................................ 49

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 9 ............................................................................................... 52

Transkrypcja w komórce eukariotycznej. .......................................................................................... 52

Represja transkrypcji ......................................................................................................................... 54

Modyfikacje transkryptu ................................................................................................................... 54

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 10 .............................................................................................. 58

Translacja:.......................................................................................................................................... 58

Reguła tolerancji Cricka: .................................................................................................................... 58

Struktura drugorzędowa tRNA .......................................................................................................... 59

Rybosomy: ......................................................................................................................................... 60

Inicjacja: ............................................................................................................................................. 61

Elongacja: .......................................................................................................................................... 61

Regulacja translacji: ........................................................................................................................... 62

Import białka: .................................................................................................................................... 62

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 11 .............................................................................................. 64

Import do macierzy mitochondriów: ................................................................................................ 64

Import jądrowy: ................................................................................................................................. 64

Zmienność genetyczna: ..................................................................................................................... 64

Rekombinacje .................................................................................................................................... 66

Rekombinacje homologiczne: ........................................................................................................... 67

Transpozony: ..................................................................................................................................... 67

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 12 .............................................................................................. 69

Kontrola genetyczna organogenezy kwiatu rzodkiewnika. ............................................................... 69

Cytoplazmatyczna męska sterylność: ................................................................................................ 72

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 13 .............................................................................................. 74

Sygnalizacja komórkowa: .................................................................................................................. 74

Receptory sprzężone z białkiem G: ................................................................................................... 75

Transpozony i ich znaczenie: ............................................................................................................. 76

Rekombinacja miejscowo-specyficzna: ............................................................................................. 77

Przeciwciała: ...................................................................................................................................... 77

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 14 .............................................................................................. 79

Przeciwciała – ciąg dalszy… ............................................................................................................... 79

Polimerazy DNA: ................................................................................................................................ 82

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 1

Znakowanie i izolacji kwasów nukleinowych

Aby rozpocząć izolację DNA lub RNA musimy najpierw wydobyć je z komórki. Można to

zrobić na wiele sposobów, jednak trzeba to robić wieloetapowo. Przede wszystkim musimy

doprowadzić do zniszczenia, czyli dezintegracji struktury tkankowej (mechanicznie- przez ucieranie w

ciekłym azocie, chemicznie- używając detergentów anionowych lub kationowych, bądź

enzymatycznie- lizozym). Nieocenionym pomocnikiem jest EDTA , który wyłapuje z roztworu kationy

dwuwartościowe, osłabiając działalność enzymów nukleolitycznych . Następnie należy przeprowadzić

ekstrakcję. Najpopularniejszymi sposobami są: rozpuszczanie w rozpuszczalnikach organicznych,

nasyconym buforze lub wodnej mieszaninie chloroformu z fenolem, ale także adsorpcja,

powinowactwo oraz filtracja żelowa.

Adsorpcja

Zaczniemy od adsorpcji. Przed przystąpieniem do adsorpcji próbkę należy zmieszać z

czynnikiem alotropowym, czyli taką substancją, która w roztworze konkuruje o wodę z cząsteczkami

kwasów nukleinowych, w ten sposób powoduje się wzrost powinowactwa próbki do

krzemionkowego złoża, które znajduje się na dnia kolumny, gdzie wprowadzamy próbkę. Następnie

przeprowadzamy wirowanie i poprzez wytworzenie podciśnienia następuje adsorpcja DNA i RNA na

złożu. Przez złoże przechodzą inne składniki, natomiast kwasy zostają na nim. Potem przemywamy

kolumnę buforem, który zawiera etanol- wypłukujemy w ten sposób resztę zbędnych składników

oraz zapobiegamy odklejeniu się kwasów od złoża. Następnie powtarzamy płukanie, lecz tym razem

już wodą lub buforem bezalkoholowym i otrzymujemy czysty kwas nukleinowy. To tyle na temat

izolacji metodą absorpcji.

Filtracja żelowa

Filtracja żelowa- tutaj również wykorzystuje się kolumny, tylko inne jest ich wypełnienie. O ile

sprasowane włókna szklane(krzemionkowe) były wypełnieniem kolumn adsorpcyjnych , to w

przypadku filtracyjnych są to wielocukry, które nie wchodzą w żaden sposób w reakcje z pożądanymi

przez nas składnikami. Są to najczęściej odpowiednio spreparowane wielocukry, sprzedawane pod

nazwami firmowymi Sephadex albo Sepharose . Oryginalnie sprzedawane są w postaci proszku, ale

można je też uwodnić i podgrzać i wtedy na bazie wielocukrów, formuje się nam struktura o

konsystencji żelu, którą wypełnia się następnie kolumnę. I żeby wyjaśnić filtrację żelową trzeba

wniknąć niejako w strukturę żelu.

Otóż żele stosowane w filtracji, mają strukturę ziarnistą. Są to cząstki niewidoczne

makroskopowo. W takim złożu żelu w kolumnie, możemy wyróżnić dwie przestrzenie; ziarna i

przestrzeń między ziarnami. Całe ziarna mają strukturę „nielitą”, dlatego gdybyśmy narysowali jedno

ziarno w powiększeniu, to zawierałoby ono plątaninę łańcuchów wielocukrowych, pomiędzy którymi

znajduje się woda. Innymi słowy, w przypadku tej frakcji żelowej wyróżniamy przestrzeń ziarnistą i

międzyziarnistą. I co się dzieje, jeżeli wymusimy przez kolumnę przepływ? Można go wywołać

różnymi sposobami. Jeżeli nałożymy próbkę, należy zauważyć, że różnie zachowują się cząsteczki

duże i cząsteczki małe- jednak jest to względne, gdyż istnieją różne typy Sephadexów dostosowanych

do różnych wymiarów cząsteczek. Stosuje się je powszechnie w preparatyce białka. Gdy wymusimy

przepływ, cząsteczki duże nie będą miały zdolności wnikania do wnętrza ziaren i będą się poruszać

wyłącznie w przestrzeni między ziarnami. Cząsteczki te nie wchodzą do wnętrza, gdyż ich wymiary są

większe niż pory w ziarnach, zatem w trakcie przepływu będą poruszać się w przestrzeni między

ziarnami i będą to robić szybko. Co się będzie działo z małymi cząsteczkami-przede wszystkim jak

małymi?, takimi, które są mniejsze niż pory w ziarnach. Wnikają one do ziaren i tam przepadają – są

pułapkowane wewnątrz ziaren. Przepływ jest wymuszony, mimo to utykają one w strukturze ziaren.

Przy przepływie próbki przez złoże, migracja cząsteczek małych jest spowolniona. Jeżeli odzyskujemy

frakcje, to pierwsze frakcje będą zawierały cząsteczki duże, a dopiero potem można odzyskać

cząsteczki małe. Ta technika nie jest raczej stosowana przy izolacji DNA czy RNA z lizatu(„zupy”

komórkowej); stosowana jest najczęściej do izolacji DNA i RNA z mieszaniny reakcyjnej, w której

zazwyczaj mamy zdefiniowany skład- z jednej strony znajdują się tam pożądane przez nas

makrocząsteczki DNA i RNA oraz substancje drobnocząsteczkowe (np. EDTA, substraty, nukleotydy).

Po przeprowadzeniu takich reakcji bardzo często zależy nam na odzyskaniu makrocząsteczek i

pozbyciu się zanieczyszczeń- dlatego stosujemy filtrację żelową. W pierwszych objętościach

odzyskamy szukany materiał, a reszta przepadnie w ziarnach.

Powinowactwo

Powinowactwo – affinity. To jest technika, która również wywodzi się z chemii białek i

właściwie jest stosowana bardzo sporadycznie w preparatyce kwasów nukleinowych, ale jest bardzo

istotna w jednym, konkretnym przypadku, który pojawia się często w praktyce: gdy zachodzi

potrzeba uzyskania preparatu pod nazwą; „poliadenylowane RNA”. Gdy wyizolujemy RNA z komórki,

to ponad 90% tego RNA stanowi RNA rybosomalne, lecz nie jest to najważniejsze, co nas interesuje.

Istnieje zatem potrzeba wzbogacenia preparatu w poliadenylowane RNA, bo jest to frakcja, w której

występuje mRNA, czyli takie, które koduje białka.

Poliadenylacja polega na tym, że do końca 3’ tego mRNA są dołączane trakty nukleotydów

adeninowych (kilkaset) i ten fakt można wykorzystać do wzbogacenia naszego preparatu w cząsteczki

RNA. Powinowactwo wykorzystuje się pomiędzy ogonem poliA oraz sondą – jest to sonda zwana

oligoDT, która jest złożona z traktu nukleotydów tymidynowych , czyli takich, które pasują do ogona

poliA. Dlaczego jest to sonda?- dlatego, że oligoDT połączony jest z cząsteczką zwaną biotyną. Zatem

do preparatu z poliadenylowanym RNA dodajemy sondę biotynylowanego oligoDT, wtedy trakty

oligoDT i poliA oddziałują ze sobą na zasadzie komplementarności , tworzy się dublet poliA-oligoDT i

jeżeli taką mieszaninę wprowadzimy do probówki, która jest opłaszczona białkiem zwanym

streptawidyną , to cząsteczki biotyny zostaną związane przez cząsteczki białka. Biotyna to jest

substancja chemiczna, organiczna, która wykazuje ogromne powinowactwo do streptawidyny. Jeżeli

produkty połączenia tych substancji, zostaną wprowadzone do probówki opłaszczonej streptawidyną

to te kompleksy poliA-oligoDT zostaną poprzez cząsteczki biotyny osadzone na powierzchni naczynia.

Skoro ulegają one retencji wnętrze probówki można przepłukać i to płukanie pozbawi nas wszystkich

cząsteczek RNA, które nie oddziałują z sondą: rRNA, tRNA… Ścianki tego naczynia są teraz miejscem

składowania poliadenylowanego RNA i możemy je wykorzystać w analizie. Jest to najpowszechniejszy

przykład powinowactwa.

Wytrząsanie za pomocą alkoholu

Bardzo często roztwór, który używamy jako próbki, jest zbyt rozcieńczony, co więcej pomimo

izolacji może on zawierać zanieczyszczenia, zatem istnieje kolejny etap ekstrakcji, który nie tylko

zatęża próbkę, ale wzbogaca ją w pożądane składniki. Jest to wytrząsanie za pomocą alkoholu. Jeżeli

do roztworu kwasu nukleinowego dodamy alkoholu(etanol lub izopropanol) w obecności soli, a tą

solą najczęściej jest chlorek sodu oraz octany, bądź octany sodu i potasu, czasem amonowe, to wtedy

DNA wypada z tego roztworu w postaci białego strątu i można go odzyskać przez wirowanie.

Od czego zależy metoda izolacji DNA?

Często zależy nam na poszczególnych rodzajach DNA; albo z jądra, z mitochondrium,

chloroplastu. Czasem chcemy wyizolować określoną frakcję np. mitochondrialne DNA, dlatego w

laboratoriach często izoluje się same mitochondria. Metoda zależeć będzie od tego, czy chcemy

całkowite DNA czy z określonej organelli, np. do bibliotek genowych potrzebne są DNA z jąder

komórkowych. Czasem pozyskuje się też DNA plazmidowy. Metodyka zależy od źródła, od gatunku i

od tkanki i celu.

Jeżeli izolowaliśmy preparat RNA, to występuje on w postaci niewielkich cząsteczek, włókien,

zbudowanych z kilkuset, kilku tysięcy (nie par zasad, bo RNA jest jednoniciowe!) nukleotydów,

natomiast po izolacji DNA , jeżeli przedmiotem izolacji jest głównie genomowy DNA, otrzymuje się

fragmenty DNA, powstałe poprzez fragmentacje chromosomów ; mają one wtedy rozmaitą wielkość

– kilkadziesiąt tysięcy par zasad zazwyczaj, jednak ogólnie jest to statycznie rzecz biorąc mieszanina

pofragmentowanych łańcuchów DNA. Te łańcuchy są zbyt duże, by można było prowadzić kolejne

manipulacje i trudno taki preparat rozdzielić na poszczególne frakcje. Dlatego bardzo często taki

preparat po etapie izolacji w przypadku DNA przechodzi etap trawienia restrykcyjnego.

Enzymy restrykcyjne

Enzym restrykcyjny to endonukelaza ,która rozpoznaje specyficzną sekwencję DNA i przecina

te fragmenty w danych punktach, dając zdefiniowane docelowe sekwencje albo będące w pobliżu

docelowych. Kategoryzacja endonukelaz: najpowszechniej stosuje się podział na tetra-, hexa- i

oktanukleazy, są to kategorie dzielące nukleazy pod względem możliwości cięcia DNA na fragmenty.

Istotny jest także podział ze względu na typ produktu: mogą być generowane produkty tępo

zakończone albo lepko zakończone, tzw sticky. Jeżeli miejsce trawienia obydwu nici znajduje się

dokładnie naprzeciwko siebie to produkty generowane będą zakończone tępo. Jeżeli zaś miejsce

trawienia górnej i dolnej nici jest przesunięte, to wtedy w produktach trawienia na końcach mamy

jednoniciowe wypustki zwane „sticky”- lepkie końce. Jeżeli chodzi o lepkie końce istnieje także ich

zróżnicowanie, mogą być 5’ lub 3’. Istotne jest także to, jakie ugrupowania znajdują się na końcach

poszczególnych nici. Na końcu 3’ jest grupa hydroksylowa, a na 5’ grupa fosforanowa. Efekt działania

enzymu restrykcyjnego można odwrócić poprzez zastosowanie odpowiedniego enzymu- ligazy DNA.

Nomenklatura enzymów restrykcyjnych:

Skąd się w ogóle wzięły enzymy restrykcyjne? Ogromna większość enzymów restrykcyjnych

pochodzi z bakterii. U tych bakterii są one elementem systemu tzw. restrykcji -modyfikacji. Co to za

systemy? Są to systemy złożone z dwóch aktywności enzymatycznych. Pierwsza, to aktywność

restrykcyjna, czyli jest enzym, który ma docelową sekwencję i tą sekwencję sobie pomnaża, ale tej

aktywności, która u bakterii jest źródłem enzymów, towarzyszy także aktywność modyfikacyjna-

metylaza. Otóż te sekwencje, które są docelowymi dla restryktazy, są przez metylazę metylowane.

Jeżeli więc do wnętrza bakterii dostanie się DNA wirusa, to on nie będąc zmetylowany, będzie

podatny na atak restrykcyjny, czyli, można powiedzieć, że enzymy restrykcyjne są „przeciwciałami”.

Bakteryjne pochodzenie enzymów restrykcyjnych ma odzwierciedlenie w nazewnictwie. Jak

się tworzy takie nazwy? Pierwsza, wielka litera pochodzi od nazwy rodzajowej bakterii, czyli E

(Echerichia), kolejne dwie literki pochodzą od nazwy gatunkowej , czyli co (coli), co daje Eco, jeżeli

występuje kolejna litera, odnosi się do szczepu, z którego wyizolowano enzym, bo bakterie będące

podstawą do izolowania enzymu mogą mieć różne szczepy (Eco RI)

Elektorforeza

Jeżeli dysponujemy wyizolowanymi cząsteczkami DNA i zostały one przecięte do

„wygodnych” rozmiarów, to można przejść do frakcjonowania tych cząsteczek, zaś to frakcjonowanie

przeprowadza się poprzez elektroforezę. Techniki elektroforetyczne jest to chleb powszedni

laboratoriów biologicznych wszelkiej maści.

Elektroforeza to proces migracji cząstek obdarzonych ładunkiem w roztworze pod wpływem

przyłożonego pola elektrycznego( nie muszą to być cząsteczki, mogą to być całe agregaty cząstek,

bądź nawet całe komórki). Proces zachodzi w małym naczynku, a w nim tkwią druty zwane

elektrodami i te elektrody połączone są z biegunami zasilacza prądu stałego. Z biegunem dodatnim

łączy się anoda, z ujemnym –katoda. Dysponujemy także roztworem, który zawiera nasze cząsteczki. I

co dzieje się pod wpływem przyłożonego napięcia? Jeżeli cząsteczki posiadają jakikolwiek ładunek, to

poruszają się odpowiednio do elektrody ujemnej, bądź dodatniej. DNA posiada ładunek ujemny i

będzie migrował do anody. Występuje elektroforeza swobodna, czyli cząsteczki roztworze migrują

swobodnie, jednak tego typu elektroforezy, zazwyczaj nie stosujemy. Istotna dla nas jest natomiast

elektroforezę w mediach. To znaczy, że aparat jest dodatkowo wypełniony żelem, co powoduje

częściowe unieruchomienie cząstek.

Co to jest żel? Wyróżniamy dwa rodzaje żeli, których używamy do frakcjonowania DNA, jedne

z nich to żele agarozowe(agaroza to frakcja otrzymana z agaru) i żele poliakrylamidowe. Agaroza to

wielocukier, będący frakcją agaru, która po uwodnieniu tworzy galaretowaną masę, która

mikroskopowo jest siecią przestrzenna. Natomiast żel poliakrylamidowy powstaje inaczej- poprzez

polimeryzację dwóch typów cząsteczek: jedna stanowi akrylamid , druga to bisakrylamid. Jeżeli do

mieszaniny polimeryzującej nie dodalibyśmy bisakrylamidu, wtedy polimeryzacja zakończyłaby się

utworzeniem bardzo długich łańcuchów. Natomiast dodanie bisakrylamidu powoduje powstanie

„poprzeczek” między łańcuchami. W rezultacie tej polimeryzacji tworzy się sieć przestrzenna,

wewnątrz której znajdują się cząsteczki kwasu nukleinowego, który poddajemy elektroforezie.

Żele formowane są różnie, w zależności od typu: agarozowe w formacie poziomym,

poliakrylamidowe w formacie pionowym. Istnieje jeszcze nieco starszy sposób , mianowicie żel

umieszcza się w rureczkach szklanych. Obecnie najczęściej stosuje się tzw slavy – jest to cieniutka

warstwa żelu znajdująca się pomiędzy płytami szklanymi. O ile w formacie poziomym ten żel

agarozowy jest swobodnie opływany przez bufor, to w przypadku żeli poliakrylamidowych , kontakt

między komorami jest tylko przez żel. Jest to przy okazji wymuszone faktem, że polimeryzację

akrylamidu inhibituje tlen, dlatego proces przeprowadza się miedzy płytami szklanymi, ograniczając

dostęp tlenu. Próbka poddawana elektroforezie mieszana jest z barwnikiem, gdyż normalnie kwasów

nukleinowych nie widać. Barwnik również ulega migracji w elektroforezie(loading buffer, zawiera

także domieszkę cukru, która zwiększa gęstość). Żel mikroskopowo tworzy splątana sieć łańcuchów,

które tworzą przeszkodę w migracji cząsteczkę, przy czym im cząsteczka jest większa, tym przeszkoda

jest też większa, zatem żele wpływają spowalniająco na migrację cząsteczek i to tym wydajniej, im

cząsteczki są większe. Dlatego żele różnicują szybkość zachodzenia migracji- cząsteczki mniejsze

migrują szybciej, większe wolniej i dzięki temu możemy rozdzielać cząsteczki. Jednak migracji

cząsteczek samych w sobie nie widać, obserwujemy jedynie migrację barwnika. Ona informuje nas o

postępie elektroforezy. Jeżeli podświetlimy żel promieniowaniem UV, będziemy mogli zobaczyć

strefy migrujących cząsteczek i im cząsteczka będzie większa, tym bliżej będzie od studzienki, w której

rozpoczynamy elektroforezę. Na próbce umieszcza się także tzw. marker, czyli preparat DNA, który

zawiera fragmenty DNA o danej wielkości. Dzięki temu można skalibrować żel i określić wielkość

poszczególnych fragmentów. Wróćmy jeszcze do sprawy wizualizacji: dlaczego widzimy cząsteczki,

których w rzeczywistości nie widać? Po zakończeniu eksperymentu można je podświetlić

promieniowaniem UV, dlatego, że do żelu dodaje się barwnik fluorescencyjny zwany bromoetydyną,

który bardzo intensywne wiąże się z DNA oraz RNA. Te strefy żelu, które zawierają kwas nukleinowy

będą też akumulować wybiórczo cząsteczki fluoroforu ( który stosuje się w małych stężeniach).

Techniki elektroforetyczne pozwalają nam zatem na rozdzielenie cząsteczek kwasu

nukleinowego, które różnią się wielkością, a to osiągamy dzięki temu, że elektroforeza zachodzi w

żelu. Inne pozytywne działanie żelu, to fakt, że w żelu można formować studzienki i przez to

dokładnie określić miejsce startu procesu elektroforezy. W roztworze próbka rozeszłaby się w całej

objętości, zaś żel zapobiega ruchom dyfuzyjnym oraz konwekcyjnym, które powstają w rezultacie

nagrzewania się pewnych segmentów.

Od czego zależy tempo migracji?

Przede wszystkim jest to wielkość cząsteczki. Mówi nam o tym następująca zależność:

odległość jaką przemigruje fragment kwasu nukleinowego w żelu, jest odwrotnie proporcjonalna do

logarytmu z jego masy cząsteczkowej. Tempo zależy też od konformacji. Jeżeli rozdzielamy cząsteczki

DNA, to wpływ konformacji jest praktycznie żaden, gdyż są to cząsteczki liniowe, które nie tworzą

struktur wyższego rzędu. Są jednak typy cząsteczek, w których wpływ konformacji się zaznacza- są to

cząsteczki jednoniciowe, np. RNA, produkty reakcji sekwencjonowania. Jest to istotne, gdyż

cząsteczki mające jednakową długość, mogą tworzyć różne struktury wyższego rzędu i na przykład

jeżeli mamy cząsteczkę RNA i możemy ją dla przykładu przedstawić jako linię. Może ona trafić na

komplementarną cząsteczkę RNA i w związku z tym utworzy się struktura heliakalna, którą w tym

przypadku nazywamy „strukturą łodygi”, a segmenty cząsteczki tworzące łodygę, będą tworzyć

pentlę. Istnieje także możliwość, utworzenia innego kształtu. Mimo że cząsteczki będą się składały z

takich samych elementów w żelu będą migrowały w różnym tempie. Jest to jednak niekorzystne,

dlatego przed rozpoczęciem elektroforezy jednoniciowych kwasów nukleinowych musimy zadbać o

to, by struktury drugorzędowe zostały zniwelowane(denaturacja) i żeby stan denaturacji był

utrzymany w czasie elektroforezy. Jak się tego dokonuje? Należy pogrzać próbkę w obecności

substancji ,które będą utrzymywać odpowiednią strukturę. Potem próbkę nakłada się na żel i

rozdziela. Jeżeli chodzi próbkę RNA, w celu zapobieżenia powtórnego formowania struktur

drugorzędowych dodaje się …., w przypadku DNA stan denaturacji w żelu utrzymuje się poprzez

dodatek mocznika. Wpływ konformacji zaznacza się także jeżeli chodzi o plazmidy- są to koliste

pozachromosomowe formy występujące głównie u bakterii. Jeżeli izolujemy plazmid, to składa się on

z różnego typu cząsteczek, które sekwencyjnie są identyczne, lecz gdybyśmy się im przyjrzeli, są one

rozmaite. Cząsteczka kolista (OC) migruje wolniej, skręcona natomiast (CCC) szybciej i dalej.

Tempo zależy także od stężenia żelu. Stężenie agarozy w żelu może się wahać i dobieramy je

w zależności od tego, jakie cząsteczki będą rozdzielane. Jeżeli będą one duże (rzędu od kilku do

kilkudziesięciu tysięcy par zasad) to stosujemy żele miękkie( stężenie agarozy <1%), natomiast jeśli

rozdzielamy cząsteczki niewielkie (do kilkuset par zasad) to stosujemy żele twarde, o dużej

koncentracji agarozy (podobna zasada obowiązuje dla żeli poliakrylamidowych, przy czym żele

agarozowe stosuje się do większych cząsteczek ,a poliakrylamidowe do mniejszych).

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 2

Elektroforeza pulsowa (pulsacyjna).

Na czym polega specyfika tej techniki? Otóż w zwykłej elektroforezie kierunek pola

elektrycznego jest stały, niezmienny. W elektroforezie pulsowej ulega on zmianie. Żel umieszczany

jest w aparacie, który ma nietypowy kształt- heksagonalny i każda ściana tego wieloboku jest

zaopatrzona w elektrody. W czasie elektroforezy parametry można zmieniać. Pole elektryczne

zmienia kierunek o 120 stopni co 90 sekund, przez czas, który zadamy np. kilka, kilkanaście godzin.

Ktoś może zapytać, czy to nie ma dystorsyjnego wypływu na rozdział. Odpowiedź brzmi: nie, dlatego

że przy takim układzie kierunków pola, wypadkowa migracja odbywa się prostopadle do studzienek,

gdzie załadowane są próbki. Jesteśmy więc w stanie rozdzielać bardzo duże cząsteczki: od 230 do

ponad 1,5 mln par zasad.

Jako marker wielkości w tej technice można stosować chromosomy drożdżowe. Co takiego

dzieje się w żelu, że jesteśmy w stanie osiągnąć rozdział w takim szerokim zakresie wielkości? Po

pierwsze musimy wziąć pod uwagę, jak zachowują się cząsteczki w polu elektrycznym. Pomimo tego,

że studzienka ma orientację prostopadłą do kierunku rozdziału, cząsteczki ustawiają się równolegle

do kierunku pola i przemieszczają się w oczkach sieci przestrzennej żelu, realizując migrację. Przy

użyciu klasycznej elektroforezy, takie cząsteczki rzędu kilkuset tysięcy par zasad nie rozdzieliły by się,

tzn. nie rozeszłyby się w taki sposób, aby możliwa była obserwacja stref odpowiadających

poszczególnym wielkościom cząsteczek. W elektroforezie pulsacyjnej kierunek pola po jakimś czasie

ulega zmianie i w związku z tym, cząsteczki muszą wykonać reorientację. Taką reorientację realizują

szybciej małe cząsteczki- procent długości cząsteczki, który uległ przeorientowaniu jest większy w

przypadku cząsteczek mniejszych niż większych, dlatego szybciej ulegają one migracji. Następnie po

upływnie określonego czasu, u nas 90 sekund, pole elektryczne wraca do podstawowego kierunku i

cząsteczki przechodzą kolejną reorientację.

Elektroforeza pulsowa ma także dodatkową specyfikę wynikającą z tego, że rozdzielamy

cząsteczki duże- preparatyka cząsteczek DNA przed rozdziałem musi być bardzo delikatna.

Standardowe preparatyki są forsowne- mechanicznie trawią cząsteczki DNA. Wyjściowo są to liniowe,

bądź koliste chromosomy, które w trakcie preparatyki zostają pofragmentowane na segmenty

wielkości kilkudziesięciu tysięcy par zasad. Podczas kiedy w trakcie elektroforezy pulsowej zależy nam

na rozdziale cząsteczek o wiele większych, dlatego preparatykę prowadzi się łagodnie. W praktyce

realizuje się to w ten sposób, że obiekty z których izoluje się DNA, zatapia się w bloczkach

agarozowych, np. komórki Drożdży, zwierząt, jądra komórkowe zatapia się w bloczkach i całą

preparatykę przeprowadzamy również w bloczkach, czyli wszystkie składniki które wchodzą w skład

roztworów do izolacji DNA dyfundują do ich wnętrza. Bloczek daje mechaniczną podporę dla

fragmentów DNA, dzięki temu nie są narażone w takim stopniu na działanie mechaniczne, jak w

trakcie standardowej elektroforezy i zachowują znacznie lepiej swoja integralność. Jeżeli taki

preparat trawimy restrykcyjnie, to przeprowadzamy to także w bloczkach. Do studzienek wprowadza

się nie płynną próbkę, lecz właśnie w postaci bloczka.

Jaka by nie była technologia rozdziału, efektem elektroforezy jest żel, w którym

obserwujemy fragmenty DNA różnej wielkości.

Hybrydyzacja. Techniki hybrydyzacyjne

Elektroforeza nie pozwala nam wniknąć w naturę sekwencyjna poszczególnych fragmentów

DNA, które są w żelu rozdzielone. Widzimy tylko, że dany fragment jest, ile go jest i potrafimy określić

jego wielkość. W wielu przypadkach to wystarcza, istnieje jednak potrzeba określenia charakteru

sekwencji, która zawiera dany fragment. Można to czynić na wiele sposób, m.in. dzięki hybrydyzacji.

Powiedzmy najpierw ogólnie o hybrydyzacji. W doświadczeniu hybyrdyzacyjnym występują

dwa rodzaje kwasów nukleinowych. Jeden z nich to ten, który badamy- na przykład cząsteczki DNA

lub RNA rozdzielone wcześniej w żelu, czyli tzw. obiekt badań- kwas nukleinowym, w którym

poszukujemy określonej sekwencji. Drugi kwas nukleinowy to tak zwana sonda- może ona mieć

również charakter cząsteczki DNA lub RNA, ale musi spełniać określone warunki:

- po pierwsze to znana tożsamość. Musimy wiedzieć jakiego typu sekwencje obecne są w tym

kwasie nukleinowym. W szczególnym przypadku możemy znać sekwencję nukleotydową nukleotyd

po nukleotydzie, ale wystarczającym jest czasem posiadanie mniej precyzyjnej znajomości zapisu

nukleotydowego. Czasem nie znamy dokładnie sekwencji sondy, znamy natomiast jej pochodzenie-

wiemy, że jest to cały wyznakowany chromosom jakiegoś organizmu albo określony wyznakowany

produkt PCR. Sonda jest pewnego rodzaju „narzędziem”, dlatego powinniśmy znać jej pochodzenie.

Może ona być krótka- odcinek rzędu kilkudziesięciu nukleotydów, ale może być też bardzo długa- np.

cały

genom

jakiegoś

organizmu

wyznakowany

zastosowany

jako

sonda.

-drugim elementem, jaki musi spełniać sonda, aby była sondą to wyznakowanie, tzn. w swojej

strukturze powinna mieć wkomponowane cząsteczki lub atomy, które pozwalają na jej detekcję, czyli

wykrycie. Sposób wykrywania zależy od czego, czym sonda jest wyznakowana. Sondy mogą być

zaopatrzone w rozmaite znaczniki. Tradycyjnie znakowało się je radioizotopowo, czyli izotopami

promieniotwórczymi, najczęściej fosforu, siarki, bądź wodoru. Sondy mogą być znakowane również

fluorescencyjnie, czyli cząsteczkami, które pod wpływem światła wzbudzenia emitują światło

widzialne. Mogą być znakowane biotyną, do detekcji której stosuje się streptawidynę , enzymami,

białkami nieenzymatycznymi oraz haptenami. Hapteny to drobnocząsteczkowe substancje,

przeciwko którym można wzbudzić specyficzne przeciwciała i te przeciwciała wykorzystywać do

detekcji haptenu. Haptenem jest na przykład oligoxygenina. Jest to cząsteczka o dość bogatej

architekturze, która sprzężona z makrocząsteczkami nośnikowymi pozwala na otrzymanie

specyficznych przeciwciał antyhaptenowych wykorzystywanych do detekcji.

Kategoryzacja technik hybrydyzacyjnych

Podsumowując, wiemy co to jest hybrydyzacja, że potrzebujemy dwa kwasy nukleinowe:

docelowy, zwany obiektem badań oraz sondę o znanej tożsamości i wyznakowaniu. Spróbujmy teraz

usystematyzować wiadomości na temat technik hybyryzacyjnych.

Techniki te można podzielić według kryterium, które mówi w jakiej postaci podawany jest

hybrydyzacji docelowy kwas nukleinowy.

Pierwsza grupa technik to są techniki hybrydyzacji w roztworze, wtedy docelowy kwas, jak

sama nazwa wskazuje, pływa w roztworze w postaci rozpuszczonej. Kolejna grupa to techniki

hybrydyzacji na podłożu stałym- kwas osadzony jest na podłożu stałym. Jaki charakter ma takie

podłoże? Najczęściej mają one postać błon. Tradycyjnie były to błony nitrocelulozowe, wypierane

teraz przez błony nylonowe albo w technikach mikromacierzy jest to podłoże szklane. Trzecią grupę

stanowią techniki In situ- dosłownie „ w miejscu” i tutaj docelowy kwas nukleinowym podany jest w

oryginalnym miejscu swojego występowania, czyli na przykład płytka metafazowa, skrawki tkanki. W

ten sposób wykrywamy kwas nukleinowy dokładnie tam, gdzie występuje on naturalnie. W

szczególnym przypadku kwas nukleinowy, który poddajemy hybrydyzacji może być wcześniej

rozdzielony elektroforetycznie. W takiej sytuacji rozdzielone cząsteczki kwasu nukleinowego

przenosi się na błonę.

Transfer

Będziemy teraz mówili o szczególnych przypadkach hybrydyzacji na podłożu stałym, czyli na

błonach. Jeżeli posiadamy żel z rozdzielonymi cząsteczkami DNA lub RNA, to kolejnym etapem jest

przeniesienie – transfer.

Transfer skąd i na co? Cząsteczki kwasu przenosimy z żelu na błonę stosując rozmaite

techniki. Najstarszą techniką jest przeniesienie kapilarne- brzmi to bardzo szumnie, jest jednak

niezwykle proste. Potrzebne jest do tego naczynie, kuweta, na środku której umieszczamy coś w

rodzaju podpory, postumentu, na którym umieszcza się bibułę, zaś jej końce zanurzamy w buforze.

Postument opływany jest przez bufor. Na bibule znajduje się żel z rozdzielonymi cząsteczkami, zaś na

nim umieszczamy błonę(nitrocelulozową bądź nylonową) oraz ręczniki papierowe. Po zmontowaniu

całego układu, umieszcza się go w lodówce, w przypadku RNA, bądź po prostu na stole w

temperaturze pokojowej, w przypadku DNA i pozostawia na kilkanaście godzin. Co się w tym czasie

dzieje?

Generowany jest przepływ buforu do transferu z kuwety poprzez bibułę, żel, błonę do

ręczników na zasadzie sił kapilarnych. Do ręczników przechodzą woda i sole, wchodzące w skład

buforu. Przy okazji prąd przepływu buforu zabiera ze sobą cząsteczki kwasu nukleinowego, przy czym

są one zbyt duże, by przejść przez barierę błony. Następuje wtedy ich retencja. Po kilkunastu

godzinach, gdy zdejmiemy ręczniki, bibułę i błonę, to fragmenty DNA, które znajdowały się na żelu

będą teraz zatrzymane na powierzchni błony- powierzchni, która przylegała do żelu. Istotne jest to,

że układ cząsteczek, który był w żelu jest zachowany na błonie. Mówimy, iż błona jest repliką żelu.

Innym sposobem transferu jest technika próżniowa- można wymuszać przeniesienie poprzez

podciśnienie. Istnieje także elektrotransfer, gdzie to przeniesienie jest wymuszane przez pole

elektryczne. Może on być przeprowadzany „na mokro” lub metodą „półsuchą”. Ten rodzaj transferu

można wykorzystywać do przenoszenia kwasów nukleinowych, jednak najczęściej jest stosowany do

przenoszenia białek z żelu na błonę.

Utrwalenie

Po transferze dokonujemy utrwalenia kwasu nukleinowego na błonie. Jeżeli mowa o błonie

nitrocelulozowej utrwalanie zachodzi poprzez wyprażanie błony w temperaturze około 80 stopni. W

przypadku błon nylonowych można stosować utrwalanie termiczne oraz, co jest wygodniejsze,

poprzez UV (promieniowanie ultrafioletowe)- kładziemy na podświetlaczu UV lub do komory

zaopatrzonej w świetlówkę UV błonę i pod wpływem działania UV dzieję się dokładnie to samo, co

przy działaniu wysokiej temperatury, tzn. wytwarzają się kowalencyjne wiązania między

podłożem(błoną), a kwasem nukleinowym.

Po etapie utrwalania DNA lub RNA nie można z błony usunąć bez jego degradacji i dopiero

po zakończeniu tego procesu następuje właściwa hybrydyzacja, czyli inkubacja błony z naniesionym

docelowym kwasem nukleinowym z sondą.

Co się dzieje w trakcie hybrydyzacji?

Przed właściwym etapem hybrydyzacji dokonuje się denaturacji zarówno obiektu badań, jak i

sondy, oznacza to, że materiał doprowadzany jest do postaci jednoniciowej. W trakcie wspólnej

inkubacji z pewną wydajnością cząsteczki sondy łączą się z docelowym kwasem nukleinowym

znajdującym się na błonie tam, gdzie ich sekwencje są komplementarne- i to jest właściwa

hybrydyzacja, czyli wytworzenie cząsteczek hybrydowych, które wykrywane są w kolejnym etapie-

detekcji.

Detekcja

Zależnie od sposobu wyznakowania sondy odpowiednio przeprowadzamy też detekcję. Jeżeli

sonda wyznakowana jest radioizotopem, to do błony przykłada się kliszę rentgenowską. Tam gdzie,

generowane jest promieniowanie jonizujące, klisza ulegnie zaczernieniu, po jej wywołaniu. Jeżeli zaś

sonda wyznakowana jest fluorescencyjnie, co rzadko stosowane jest w technice błonowej, to należy

hybrydę sonda-kwas nukleinowym podświetlić światłem wzbudzającym i dzięki temu będziemy

obserwować emisję światła pochodzącą od flouroforu. W przypadku sondy biotynylowanej (z

wbudowaną w strukturę biotyną), błonę powleka się, kąpie w roztworze streptawidyny. Następnie

błonę poddajemy kolejnej kąpieli, która zawiera biotynylowaną alkaliczną fosfatazę, czyli enzym

reporterowy, którego cząsteczki zostały sprzęgnięte z biotyną. Ponieważ cząsteczka streptawidyny

jest wielowartościowa to biotynlowana alkaliczna fosfataza będzie wiązała się z cząsteczkami

streptawidyny związanej z sondą. Ostatnim etapem detekcji jest powleczenie błony substratem, dla

alkalicznej fosfatazy, np. CSPD. Alkaliczna fosfataza pozbawia ten substrat grupy fosforanowej.

Produkt reakcji jest bardzo nietrwały i szybko się rozpada na dwie cząsteczki, a towarzyszy temu

emisja światła. Innymi słowy w miejscu, gdzie mamy docelowy kwas nukleinowy, sondę z biotyną,

streptawidynę oraz biotynylowane cząsteczki alkalicznej fosfatazy, generowane jest światło, które

powoduje zaczernienia na kliszy, którą przyłożymy do takiej błony. Ten sposób detekcji zwany jest

chemiluminescencją- luminescencją powstającą w wyniku reakcji chemicznej generowanej przez

enzym reporterowy.

Innym sposobem jest znakowanie sond digoxygeniną, czyli haptenem. Docelowy kwas

połączony jest z sondą, digoxygeniną i po etapie hybrydyzacji błonę taką kąpie się w roztworze

koniugatu. Co to jest koniugat? To są sprzężone ze sobą cząsteczki białka, a w tym przypadku

przeciwciała antyhaptenowe oraz enzym reporterowy (alkaliczna fosfataza, peroksydaza

chrzanowa(?)). Kolejnym etapem jest detekcja aktywności enzymu reporterowego. Znowu podaje się

substrat , zwany tym razem luminogennym, który pod wpływem enzymu ulega defosforylacji i

rozkładowi z emisją światła.

Występuje także alternatywne podejścia, mianowicie można stosować substraty nie

luminogenne, lecz chromogenne, czyli takie substraty, które pod wpływem defosforylacji,

realizowanej na przykład przez alkaliczną fosfatazę, generują barwne produkty- sygnał generowany

jest bezpośrednio na błonie poprzez tworzenie barwnego strątu. Czulszą metodą detekcji jest

metoda chemiluminescencyjna, zaś metoda kolorymetryczna jest mniej czuła. Na podstawie

doświadczenia kolorymetrycznego jesteśmy jednak w stanie powiedzieć, w którym fragmencie

restrykcyjnym występuje homologia z sondą.

Tego typu technika posiada wiele odmian, a podstawę rozróżnienia technik stanowi rodzaj

kwasu poddanego eksperymentowi. Jeżeli docelowym kwasem jest DNA i został on wcześniej

strawiony restrykcyjnie, to mamy do czynienia z techniką Southern (nazwa od nazwiska wynalazcy).

Wkrótce po opracowaniu tej techniki powstała technika northern dla RNA. Istnieje jeszcze technika

Western, lecz dotyczy ona głównie zagadnień związanych z biochemią oraz białkami.

To, z jakiego typu kwasem nukleinowym mamy do czynienia wymusza pewne modyfikacje w

technikach: jeżeli wykonujemy Southern, to DNA najpierw trawimy restrykcyjnie, potem się je

rozdziela, denaturuje chemicznie poprzez kąpiel alkaiczną całego żelu, następnie wykonujemy

transfer, utrwalanie i hybrydyzację. W technice northern jest nieco inaczej, gdyż RNA jest kwasem

jednoniciowym i wpływ konformacji na rozdział się już zaznacza, dlatego dany odcinek przed

obróbką, należy denaturować oraz prowadzić rozdział w warunkach denaturujących, czyli w

obecności formaldehydu. Należy zwrócić uwagę, że nie ma enzymu restrykcyjnego, gdyż restrykcyjnie

trawimy DNA, a nie RNA oraz alkalicznej denaturacji. Następne etapy przebiegają analogicznie do

techniki Southern.

PCR. Techniki PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy.

PCR- metoda, która pozwala na powielenie, amplifikację zdefiniowanego fragmentu DNA w

probówce (In vitro). Wykorzystuje się do tego polimerazę DNA, stąd nazwa techniki- łańcuchowa

reakcja polimerazy.

Jakie

składniki

potrzebujemy

tego,

żeby

przeprowadzić

taką

reakcję:

-polimeraza; obecnie używa się tzw. polimerazy Taq- nazwa pochodzi od bakterii, u której ten

enzym znaleziono, jest to bakteria Thermus aquaticus, a jej szczep, z którego wyizolowano

polimerazę występuje na przykład w gorących źródłach Parku Yellowstone. Do PCR wykorzystano

akurat tę polimerazę, gdyż reakcja jest sterowana cyklicznymi zmianami temperatur; jedna z nich jest

dosyć wysoka i wynosi ponad 90 stopni Celsjusza. Normalne enzymy w tej temperaturze ulegają

dezaktywacji , lecz nie enzymy bakterii termofilnych, takich jak Thermus aquaticus.

-matryca-

DNA,

którym

znajduje

się

fragment,

który

chcemy

powielić,

-nukleotydy- trójfosforany dezoksyrybonukleozydów ( trójfosforany dNTP: dATP, dGTP, dCTP,

dTTP), które w tej reakcji stanowią substraty,

- startery – to krótkie odcinki jednoniciowego DNA, około 20-nukleotydowe. Stanowią one zaczątki

nowosyntetyzowanych nici, a to dlatego, że polimeraza DNA, w tym Taq, nie mogą syntetyzować nici

„de Novo”, mogą jedynie wydłużać istniejące fragmenty. Przy okazji startery to te elementy

mieszaniny, które definiują, który fragment DNA będzie ulegał powieleniu, więc jeżeli chcemy

amplifikować wiele fragmentów, to do poszczególnych probówek wprowadzamy różne zestawy

starterów. Klasycznie w reakcji PCR występują dwa startery, które oskrzydlają amplifikowaną

sekwencję z prawej i lewej strony.

-bufor- zapewniający optymalne warunki dla polimerazy Taq i zawierający kationy magnezowe.

Wszystkie składniki umieszczamy w małej probówce, którą następnie przenosimy do bloku

grzejnego termocykleru.

Przebieg reakcji:

-umieszczenie w termocyklerze,

-podgrzewanie do temperatury ponad 90 stopni Celsjusza, gdzie następuje denaturacja ( z cząsteczek

dwunicowych powstają jednoniciowe),

-błyskawiczne schłodzenie mieszaniny do temperatury około 50 stopni, co skutkuje lądowaniem

starterów na matrycy. Przyłączają się one (hybrydyzują) z tymi odcinkami matrycy, które wykazują

podobieństwo sekwencji. Szybkie schładzanie zapobiega redenaturacji mieszaniny. Podsumowując,

poprzez gwałtowność procesu matryca pozostaje jednonicowa, poza fragmentami, do których

dołączają się startery.

Aby PCR zakończył się sukcesem, czyli amplifikacją określonego fragmentu, musi zaistnieć szereg

okoliczności dotyczących sposobu przyłączania się starteru. Muszą one przyłączyć się zarówno do

dolnej nici, jak i do górnej, muszą być skierowane do siebie końcami 3’ i miejsce ich przyłączania nie

powinno być zbyt odległe( mniej niż kilka tysięcy par zasad). Jeżeli te warunki są spełnione to

dochodzi do amplifikacji,

-wydłużanie nici, których zaczątki stanowią startery. Polimeraza DNA do końców starterów zaczyna

dobudowywać kolejne nukleotydy do końców 3’, zatem wydłużanie zachodzi w kierunku od 5’ do 3’.

Następnie wszystkie etapy są powtarzane, gdyż denaturacja, przyłączanie starterów oraz wydłużanie

stanowią

jeden

cykl.

Takich

cykli

PCRze

występuje

kilkadziesiąt.

Prześledźmy zatem w skrócie, jakie zmiany zachodzą podczas całego cyklu: podgrzanie

próbki do 90 stopni, separacja nici, temperatura spada do około 50 stopni, to pozwala na

przyłączenie starterów, później temperatura wzrasta do optymalnej dla enzymów, czyli około 70

stopni, wtedy polimeraza staje się aktywna i następuje wydłużanie. Po zakończeniu jednego cyklu

rozpoczyna się następny.

Zwróćmy uwagę, że po drugim cyklu mamy już 4 kopie docelowej sekwencji, pod warunkiem, że

na początku była jedna kopia. Pojawiają się nici, będące produktami syntezy, których długość jest

zdefiniowana miejscami przyłączenia starteru- są one krótkie, rzędu kilku tysięcy par zasad. Tych

produktów syntezy będzie w kolejnych cyklach przyrastać znacznie więcej niż produktów, które

długością przekraczają rejon ograniczony miejscami przyłączania. W trzecim cyklu pojawiają się już

krótkie, dwuniciowe produkty o długości zdefiniowanej przez miejsca przyłączania starterów. Po

dwudziestu kilku cyklach, przy założeniu 100% wydajności reakcji, mamy już do czynienia ze stu

milionami kopii. Tych cząsteczek jest tak wiele, że jeżeli mieszaninę reakcyjną rozdzielimy w żelu, to

zobaczymy fragmenty DNA powstałe w wyniku amplifikacji.

Przy użyciu technologii PCR jesteśmy w stanie w probówce powielić, amplifikować wybrany

fragment DNA ograniczony miejscami przyłączania. Powyższy opis dotyczy techniki klasycznej PCR.

Doczekał się on jednak niezmiernie dużej liczby modyfikacji i dziś jest wykorzystywany w każdej

dziedzinie analiz molekularnych.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 3

RT – PCR, In Situ –PCR

RT - PCR to technologia złożona z dwóch technik: pierwszej, zwanej RT i drugiej, zwanej PCR.

RT to odwrotna transkrypcja, czyli przepisania informacji genetycznej z cząsteczek RNA na DNA.

Preparat RNA stanowi matrycę w reakcji RT, jednak żeby przeprowadzić tę reakcję potrzebny będzie

także starter, nukleotydy, odpowiedni bufor i enzym, który reakcję katalizuje, czyli odwrotna

transkryptaza. Co robi odwrotna traskryptaza w tej reakcji? Na bazie cząsteczki RNA, stosując tę

cząsteczkę jako matrycę, transkryptaza wydłuża starter, dobudowując do niego nukleotydy DNA, czyli

deoksyrybonukleotydy. W rezultacie wydłużania powstaje pierwsza nić cDNA, a poprawnie mówiąc

preparat z nici cDNA, gdyż powstały one na bazie wielu nici RNA. Skrót cDNA oznacza complementary

DNA, czyli DNA komplementarne do nici RNA, która była matrycą. Po zadziałaniu transkryptazy mamy

do czynienia z tzw. heteroduplexem cząsteczki RNA i cDNA. Zatem cDNA to kwas nukleinowy, który

powstał na matrycy RNA. W technice RT- PCR preparat heteroduplexów stosuje się jako matrycę, zaś

w klasycznym PCRze matrycę stanowi DNA genomowe. Dalej postępowanie ma się tak, jak w

klasycznym PCRze: dodaje się dwa startery i amplifikuje się dany fragment otrzymanego cDNA. Tak

więc o ile na końcu RT mamy do czynienia z wieloma rodzajami cDNA, to w dalszej części PCRu

powielamy tylko jeden fragment cDNA.

Informacje uzyskiwane z RT-PCR

Pod pewnymi względami jest to technika, która daje nam zbliżoną informację do hybrydyzacji

Northern- informuje nas ona o obecności transkryptu dla określonego genu. Dlaczego transkryptu?

Dlatego, że wsadem było RNA. Dlaczego dla określonego genu? Dlatego, że zastosowaliśmy startery,

które pasują do sekwencji określonego fragmentu. Jeżeli w ogólnej puli RNA pojawiły się transkrypty

danego genu, to na żelu otrzymamy konkretne produkty.

Zalety i wady RT-PCR

Zaletą RT-PCR w stosunku do techniki Northern jest czułość. Wyniki oparte na amplifikacji

DNA są o wiele lepsze niż pozyskane w wyniku hybrydyzacji. Teoretycznie możemy wykryć już w

mieszaninie reakcyjnej jedną cząsteczkę docelowego RNA, w hybrydyzacji nie jest to możliwe.

Również prostota analizy jest tutaj zaletą, gdyż hybrydyzacja jest procesem wieloetapowym. RT-PCR

wymaga mniejszej ilości materiału.

Posiada jednak też pewne ograniczenia. Na przykład w technice tej nie jesteśmy w stanie

zaobserwować polimorfizmu transkryptu, który jest konsekwencją ich różnej długości. Dlatego jeżeli

mamy w mieszaninie trzy transkrypty różniące się długością, to w przypadku hybrydyzacji zobaczymy

trzy sygnały, natomiast stosując RT-PCR, otrzymamy tylko jeden produkt amplifikacji. To będzie ten

segment sekwencji, który jest ograniczony miejscami przyłączania starterów.

In Situ- PCR

Jest to dosyć często stosowana technika. Powiemy o nim dlatego, że wcześniej wspomniana

została hybrydyzacja In Situ i na czym ona polega i jak się można domyślić In Situ- PCR polega na

przeprowadzeniu reakcji w miejscu naturalnego występowania matrycy, czyli w tkance. Technologia

ta obejmuje następujące etapy: mamy tkankę z docelową matrycą, która jest na przykład w jądrze,

tkankę utrwalamy, następnie sprawiamy, że tkanka staje się przepuszczalna, pokrywamy tkankę

odpowiednią substancją, która zawiera wszystkie potrzebne do zainicjowania reakcji składniki, a

następnie przeprowadza się cykliczne zmiany temperatury, charakterystyczne dla techniki PCR, w

termocyklerze, który akurat w tej technice różni się od klasycznego, tym że otwory na próbki nie to

nie miejsca na próbki, zaś miejsca na płytki, będące całymi preparatami mikroskopowymi. W

rezultacie amplifikacji pojawiają się kopie docelowej sekwencji, które następnie poddaje się detekcji.

Wyróżniamy dwa typy detekcji: bezpośrednią oraz pośrednią. Direct/bezpośrednia: w mieszaninie

reakcyjnej znakowany jest prekursor- jeden z nukleotydów, który stosuje się do syntezy kopii

DNA(produkt PCR) zatem produkt jest wyznakowany. Produkt wykrywa się następnie w zależności od

zastosowanego typu znacznika. Metodzie pośredniej jest nieco inaczej; stosuje się nieznakowane

nukleotydy, która w czasie reakcji zostają inkorporowane do określonych produktów i po reakcji te

produkty wykrywa się metodą hybrydyzacji, stosując sondę. W tym przypadku In Situ- PCR jest fuzją

dwóch technik: PCRu i hybrydyzacji.

Podsumowując nasze rozważania powiedzieliśmy już o izolacji DNA, trawieniu restrykcyjnym

cząsteczek DNA, elektroforezie, która według założenia służy do rozdziału cząsteczek według

wielkości, o technikach hybrydyzacyjnych które pozwalają na wykrycie specyficznych cząsteczek DNA

lub RNA, o PCRze , który pozwala nam na powielenie cząsteczek w probówce lub In Situ. Teraz

powiemy o sekwencjonowaniu DNA, czyli poznawaniu jego sekwencji nukleotydowej.

Sekwencjonowanie

Metod sekwencjonowania jest wiele, jednak każde ma na celu poznanie sekwencji

nukleotydowej.

Najszerzej

stosowaną

techniką

jest metoda

Sangera,

zwana

metodą

dideoksypochodnych lub enzymatyczną. Nazwa metoda enzymatyczna bierze się stad, że w trakcie jej

używania próbkę traktujemy enzymem zwanym polimerazą DNA, natomiast nazwa

dideoksypochonych pochodzi tego, iż w tej metodzie wykorzystujemy właśnie dideoksypochodne,

które są pochodnymi nukleotydów, standardowych nukleotydów tworzących DNA (posiada jedną z

czterech zasad azotowych, pierścień deoksyrybozy oraz reszty fosforanowe oznaczane literami

alfabetu greckiego- aproksymalna Alfa, środkowa Beta oraz dystalna Gamma). Piroforsforan

zawierający grupy Beta i Gamma jest odłączany, a pozostała reszta wchodzie w skład cząsteczki DNA.

Dideoksypochodna takiego nukleotydu, to pochodna, która różni się tylko konfiguracją przy węglu C3,

przy której nie ma grupy hydoksylowej-OH (przy węglu C2 nie ma jej standardowo w DNA), która

została usunięta. Wyróżniamy cztery dideoksypochodne, w zależności od tego czy zasadą jest A, C, T ,

czy G.

I etap sekwencjonowania to przygotowanie odpowiednich reakcji syntezy DNA. Takich reakcji

przygotowuje się cztery. Poszczególne mieszaniny różnią się dodatkiem dideoksypochodnej: do I

dodajemy ddATP, do II ddGTP, do III ddCTP i do IV ddTTP. Jest to składnik różnicujący mieszaniny,

natomiast resztę stanowią: odcinek DNA będący matrycą, czyli DNA poddawany sekwencjonowaniu,

starter- krótki, jednoniciowy odcinek DNA, który w pewnym miejscu matrycy może się z nią połączyć,

następny składnik to standardowe nukleotydy, przy czym niektóre z nich mogą być zaopatrzone w

znaczniki, a ostatnie dwa składniki to bufor z magnezem oraz enzym- polimeraza DNA (Klenov

fragment). Synteza DNA zaczyna zachodzić po dodaniu do siebie wszystkich składników. Jak jednak

ona zachodzi? Do nici matrycowej o orientacji 5’

3’ dodajemy zaczątek w postaci startera,

następuje wydłużanie startera, tzn. do końca 3’, a konkretnie do grupy 3’hydroksylowej dodawane są

kolejne nukleotydy, przy czym inkorporacja nukleotydu sprzężona jest z dołączeniem pirofosforanu.

W mieszaninie reakcyjnej oprócz standardowych nukleotydów, dodane są dideoksypochodne.

Ugrupowania, które są przyłączane są pozbawione grupy hydroksylowej –OH przy węglu C3, oznacza

to, że są to właśnie dideoksypochodne. Ich obecność blokuje przyłączania kolejnych nukleotydów.

Zatem musimy brać pod uwagę dwa typy zdarzeń w mieszaninie reakcyjnej: jeżeli do łańcucha

polinukeotydowego zostaje wbudowany standardowy nukleotyd to synteza jest kontynuowana, jeżeli

zaś wbuduje się dideoksypochodna dalsza rozbudowa łańcucha nie jest możliwa. Następuje

terminacja syntezy, dlatego dideoksypochodne powszechnie zwane są terminatorami. Po reakcji np.

w mieszaninie, której dysponowaliśmy nukleotydami ddATP, będziemy mieć serię produktów

terminacji, które zakończone będą dideoksypochodnymi adeninowymi , w miejscach gdzie w matrycy

znajdował się nukleotyd tymidynowy. To co zachodzi dla mieszanin z ddATP jest również prawdą dla

pozostałych trzech reakcji. Jeżeli potraktujemy sumarycznie te wszystkie reakcje, to każdej pozycji

nukleotydowej, która była obecna w matrycy odpowiada konkretny produkt terminacji o danej

długości, która jest determinowana przez miejsce dołączania startera i miejsca w którym zaszła

terminacja.

II etap stanowi elektroforeza produktów syntezy w żelu poliakrylamidowym. Żele są długie i

cienkie, znajduje się w nich czynnik denaturujący, tak żeby produkty syntezy wędrowały w postaci

jednoniciowej i były pozbawione struktur II-rzędowych. Produkty syntezy mają wbudowane

nukleotydy znakowane, na przykład izotopami i jeżeli na przykład do takiego żelu po elektroforezie

przyłożymy kliszę rentgenowską to zaobserwujemy zaczernienia.

Zasada odczytu sekwencji:

Odczyt sekwencji polega na uszeregowaniu produktów w kolejnych ścieżkach żelu, przy czym

każdemu produktowi przypisujemy konkretny nukleotyd, który jest determinowany typem

dideoksypochodnej dodanej do mieszaniny reakcyjnej. Podsumowując ta metodę, polega ona na

otrzymaniu dla danego segmentu DNA serii fragmentów pochodnych, w ten sposób, iż każdej pozycji

nukleotydowej odpowiada jednej, konkretny produkt, a następnie dokonujemy uszeregowania

fragmentów według wielkości, co uzyskujemy odczytując nukleotyd , który kończy dany odcinek.

Jest to sekwencjonowanie metodą manualną, które stosowane jest obecnie dosyć rzadko.

Obecnie stosujemy sekwencjonowanie w wersji zautomatyzowanej, będące nieco zróżnicowane pod

względem podstaw chemicznych od metody manualnej.

Sekwencjonowanie automatyczne

Jest ono możliwe dzięki specyficznej metodzie wyznakowania nukleotydów terminujących.

Dideoksypochodne są znakowane fluorescencyjnie(fluorofory). W konsekwencji otrzymujemy widma

emisji poszczególnych fluoroforów. Innymi słowy te fluorofory można odróżnić po długości fali

emitowanej fluorescencji, dzięki temu pośrednio odróżniamy dideoksypochodne. Dzięki temu

możemy sobie pozwolić na przygotowanie zamiast czterech, jednej mieszaniny reakcyjnej o

składnikach takich samych, jak w sewencjonowaniu manualnym (matryca, starter, polimeraza,

nukleotydy, bufor, dideoksypochodne). Jeżeli rozpatrzymy całość cząsteczek matrycowych i

procesów tam zachodzących to odkryjemy, że w mieszaninie będzie znajdował się taki produkt

terminacji, syntezy odpowiadał, który będzie zakończony dideoksypochodną rozróżnianą po kolorze

emisji światła fluorescencyjnego. Mieszaninę reakcyjną nakłada się na żel, który następnie wkłada się

do sekwenatora DNA, który przeprowadza elektroforezę oraz analizę (detekcja fragmentów z

przypisaniem każdemu fragmentowi odpowiedniego terminatora, na podstawie emitowanej długości

fali). Jest on sprzężony z komputerem, zatem rejestrowana fluorescencja jest prezentowana w formie

wykresu na monitorze komputera. Za wzbudzanie fluorescencji migrujących w żelu cząsteczek DNA

odpowiedzialna jest dioda bądź laser. Przypomnijmy, że długości fali odpowiada konkretnej

dideoksypochodnej ,zatem od razu można im przyporządkować właściwą nazwę. Uzyskujemy w ten

sposób chromatograf sekwencyjny, będący ciągiem maksimów fluorescencji dla migrujących w żelu

cząsteczek DNA.

Strategie sekewncjonowania

Sekwencjonowanie metodą Sangera oferuje odczyty rzędu kilkuset nukleotydów. Problem

pojawia się jeżeli posiadamy matryce przekraczające długością kilkaset nukleotydów. Wtedy należy

odwołać się do jednej ze strategii sekwencjonowania, na przykład Primer Walk. W technice

wykonujemy pierwsze sekewncjonowanie, używając oczywiście matrycy. Poznajemy w ten sposób

fragment sekwencji. Kiedy znamy już ten odcinek, to projektujemy starter w dystalnej części

sekwencji poznanej i z tym starterem powtarzamy proces sekwecjonowania. W ten sposób

poznajemy kolejny odcinek sekwencji. Następnie przeprowadzamy takie cykle wielokrotnie, aż do

poznania całej sekwencji nukleotydowej. Dla pewności sekwencjonowanie przeprowadzamy również

na drugiej nici, ze starterami zakotwiczonymi po przeciwnej stronie. Następuje pierwsza runda,

druga, trzecia aż do spotkania się sekwencji na niciach i jeżeli na niciach występują różnice, to znaczy

to, że na którejś nici pojawił się błąd.

Rodzaje matryc

W praktyce laboratoryjnej najczęściej stosowane są dwa rodzaje matryc. Pierwszy to

produkty PCR, drugi zaś to klony, czyli fragmenty DNA, które zostały wprowadzone wcześniej do

wektora. W technice Primer Walk istnieje pewien problem, a mianowicie skąd wziąć informację

sekwencyjną do pierwszej rundy sekwencjonowania, bo żeby sekwncjonować metodą enzymatyczna,

trzeba znać wcześniej docelową sekwencję, oczywiście nie całą, ale na tyle, żeby możliwe było

zakotwiczenie startera. Dobór startera zależy od matrycy- jeżeli jest ona produktem PCR, to wtedy

należy zabrać jeden ze starterów wykorzystywanych w PCR. Jeżeli matrycą był klon, czyli DNA

wprowadzane do wektora, to pierwszy ze starterów kotwiczy się w obrębie sektora, który jest już

nam znany. Istnieją także inne strategie sekwencjonowania, alternatywne do Primer Walk.

Techniki klonowania molekularnego (wytwarzania klonów).

Klonowanie molekularne polega na klonowaniu cząsteczek. Schemat ogólny przedstawia się

następująco: klonowanie zależy od rodzaju DNA (tak jak w PCRze mamy dwa rodzaje DNA-

matrycowy i stertery, podobnie także w hybrydyzacji matryca i sonda), wykorzystuje się DNA, które

możemy określić mianem wektora i DNA klonowane. Klonowane DNA może pochodzić z komórki

eukariotycznej, prokartiotycznej, cDNA, gen syntetyczny, fragment syntetyczny, a wektor

preparowany jest z komórki prokariotycznej. Zarówno DNA kolonowane i wektora poddawane jest

trawieniu restrykcyjnemu, które generuje takie końce obu rodzajów DNA, której potem można łączyć

ze sobą. Przed trawieniem tych końców nie ma, czyli tych cząsteczek nie można połączyć. Oprócz

tego w przypadku klonowanego DNA, enzymy restrykcyjne przycinają je do takich rozmiarów, aby

pasowały wielkością do wektora.

Kolejnym etapem jest ligacja, czyli sklejanie tych cząsteczek ze sobą. Działanie enzymu ligazy,

który jest odpowiedzialny za reakcję ligacji, przeprowadza się najczęściej In Vivo, gdzie nici DNA

pękają i istnieje potrzeba przywrócenia ciągłości nici pod warunkiem, że ma do dyspozycji grupę

3’hydroksylową i 5’fosforanową. Inaczej zachodzi ligacja w warunkach In Vitro. Może to odbyć się na

zasadzie łączenia fragmentów zakończonych tępo bądź lepko. Ligaza działa wtedy w obrębie nici

górnej i dolnej. Produktem jej działania jest segment DNA, który powstaje poprzez połączenie dwóch

nici. O wiele wydajniej zachodzi ligacja lepkich końców, dlatego że zachodzenie tej reakcji jest

stabilizowane, przez klejenie się lepkich końców. Mniej komfortowa sytuacja jest w przypadku tępych

końców, gdyż ich oddziaływanie nie jest stabilizowane, w mieszaninie zderzają się one tylko

przypadkowo. W szczególnym przypadku produktem ligacji może być zrekombinowana cząsteczka

DNA, posiadająca segmenty różnego pochodzenia: z sekwencji wektorowej oraz wstawki . Wstawka

lub inaczej insert, to część klonowanego DNA wprowadzony do wektora. Jest to szczególny

przypadek, jednakże na takiej właśnie najbardziej nam zależy. Może także dojść do ligacji cząsteczek

klonowanego DNA , lecz ona jest nieproduktywna. Może dość do religacji, czyli łączenie się ze sobą

cząsteczek wektora lub zamknięcie się wektora w strukturę kolistą. Po etapie ligacji następuje

wprowadzenie cząsteczek zrekombinowanego DNA do komórki gospodarza, którym najczęściej są

komórki bakterii E.coli, ale także może to być komórka roślinna, drożdży, bądź innej bakterii. W

kolejnym kroku następuje selekcja, która jest wielopoziomowa, jednak najistotniejsze są trzy

poziomy.

Selekcja

I poziom selekcji, to selekcja transformatów. Są to takie klony komórki, które w trakcie

wprowadzania mieszaniny reakcyjnej otrzymały cząsteczkę wektora.

II poziom selekcji to selekcja klonów rekombinantowych. Transformanty, czyli te komórki

które zinternalizowały wektor można podzielić na dwie kategorie: pierwsza, to takie, które posiadają

wektor z insertem (wstawką) i druga to takie, które mają wektor pusty, czyli połączony sam z

sobą(takie transformanty są dla nas bezwartościowe).

III poziom selekcji, to selekcja pożądanych transformantów rekombinantów. Jedynie

określona pula t-r ma pożądany przez nas odcinek DNA z danym genem.

Klonowanie a wektory

Kategoryzacja technik klonowania jest związana z typem wykorzystywanych wektorów.

Najpowszechniejsze są wektory plazmidowe. Plazmidy są to najczęściej koliste replikony,

występujące w komórkach bakterii, które mogą nadawać komórkom pewne cechy, np. odporność na

antybiotyki, zdolność do rozkładu metabolitów lub mogą nie nadawać gospodarzom żadnych

właściwości i mówimy wtedy o nich, że mają charakter kryptyczny. Naturalnie występujące plazmidy,

posłużyły naukowcom do stworzenia wektorów klonowania molekularnego.

Przykładem takiego wektora jest pUC19, forma kulista o 2676 parach zasad. W obrębie tego

wektora występują sekwencje enzymów restrykcyjnych, znajdujące się w tak zwanych miejscach

unikalnych (szereg następujących po sobie sekwencji nie występujących nigdzie indziej). Stanowi on

tzw. MCS - miejsce unikalnego klonowania, polilinker. Jest to miejsce w wektorze do którego wędruje

wstawka. Po strawieniu wektora plazmidowego jednym z enzymów restrykcyjnych następuje jego

otwarcie i dołączenie insertu. Kolejna sekwencja, na którą należy zwrócić uwagę to tzw. Origin (Ori) -

miejsce, które warunkuje autonomiczną replikację plazmidu gospodarza, która jest zależna od

replikacji chromosomu. Znamy Ori różnego typu- mogą np. wpływać na liczbę kopii wektora. Kolejna

sekwencja to gen oporności na antybiotyk, którego produktem może być enzym, który rozkłada

ampicylinę. Funkcja tego punktu wektora to bycie markerem- ta sekwencja jest tym elementem

wektora, który pozwala na selekcję transformantów. Kolejna sekwencja to sekwencja lacKZ- jest to

fragment genu kodującego enzym betagalaktozytazę. W obręb tego genu prowadzony jest polilinker.

Wyróżniamy dwa stany: stan aktywny bez insertu i nieaktywny z wprowadzonym insertem.

Wprowadzenie insertu w obrębie polilinkera dezaktywuje sekwencję, która umożliwia rozpoczęcie

procesu selekcji transformantów rekombinantów. Jeżeli nie ma insertu to w rezultacie ligacji

sekwencja lacKZ jest aktywna i na jej bazie powstaje aktywne białko enzymatyczne, które jest zdolne

do przeprowadzenia odpowiedniej dla niego reakcji rozkładu pewnego substratu enzymu, który

również jest dodawany do pożywki tzw. X-Gal (bezbarwny), a produktem rozkładu jest substancja,

która zabarwia komórki bakterii na niebiesko. Komórki nie zawierające insertu w rezultacie na

pożywce będą niebieskie. Prześledźmy sytuację przeciwstawną. Mamy do czynienia z insertem, który

wbudowując się inaktywuje sekwencję LacKZ, zatem aktywne białko enzymatyczne nie jest

produkowane, X-Gal nie jest rozkładany przez komórki bakterii i komórki zachowują naturalną

kremową barwę. Stosując tę metodę jesteśmy więc w stanie zróżnicować transformanty na dwie

kategorie: niebieskie i kremowe.

Transformacja

Komórki najpierw odpowiednio są przygotowywane poprzez wprowadzenie w stan

kompetencji. Stan ten można indukować rozmaicie. Najczęściej robi się to przez działanie chłodem

(łaźnia lodowa) oraz poprzez wprowadzanie do hipotonicznego względem treści komórki E.coli

roztworu chlorku wapnia. Otrzymujemy bakterie, które zbiera się z pożywki w okresie ich

logarytmicznego wzrostu, czyli okresu kiedy najintensywniej się dzielą. Następnie odwirowuje się je i

zawiesza w roztworze chlorku wapnia, gdzie pęcznieją. Następnie do tej zawiesiny dodajemy

transformujący DNA. W komórce w czasie logarytmicznego wzrostu komórka rośnie tak

intensywnie, że błona komórkowa nie nadąża ze wzrostem. Występują na jej powierzchni tzw. strefy

adhezji.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 4

Wektory plazmidowe w klonowaniu (c.d.)

Po ligacji zdefosforyzowanego wektora z ufosforylowanym klonowanym DNA w obrębie

cząsteczki rekombinowanej, pojawiają się tak zwane „nicks”.

Nicks- przerwy, nieciągłości w łańcuchu polinukloetydowym, powstające w miejscach, gdzie

ligaza nie znajduję grup fosforanowych potrzebnych do połączenia dwóch nici, w celu zamknięcia

wektora. Konstrukcja wektora ze sklonowanym DNA „trzyma” się razem, dzięki działalności ligazy,

dlatego wewnętrzna i zewnętrzna nić wektora ma przywróconą ciągłość. Powstałe przerwy (nicks) są

następnie naprawiane już w komórce gospodarza, np. E coli, w której przy użyciu aktywności

enzymatycznej następuje fosforylacja oraz ligacja.

Fag Lambda i jego pochodne

Sporą grupę wektorów stanowią pochodne faga Lambda. W budowie faga wyróżniamy części

zwane: główką oraz ogonkiem. Główka zawiera genom faga, który jest cząsteczką liniową o wielkości

około 50 kB (tysięcy par zasad), ma zazwyczaj charakter dwuniciowy, gdyż na końcowych jego

fragmentach znajdują się lepkie końce, zwane Cos (Left i Right Cohesive Ends).

Cykl rozwojowy faga

Fagi to wirusy atakujące bakterie. Fagi mogą funkcjonować w wersji poza- oraz

wewnątrzkomórkowej. Fag w wersji pozakomórkowej, zwany wirionem, ulega adsorpcji na

powierzchni komórki E. coli i następuje infekcja poprzez wstrzyknięcie liniowego genomu faga do

komórki bakterii. Tam następuje jego cyrkularyzacja dzięki istnieniu lepkich końców, które kleją się do

siebie , a następnie zostaje przywrócona, aktywnościami komórki gospodarza, ciągłość genomu faga.

Od tego czasu, fag reprezentowany jest poprzez swój genom w komórce bakterii. Dalszy rozwój

bakterii może postępować dwiema drogami.

1)Pierwsza z nich to droga lityczna

. Nazwa pochodzi od faktu, iż ten sposób rozwoju faga prowadzi

nieuchronnie do lizy komórki gospodarza, do jej rozpadu, który połączony jest z uwolnieniem

wirionów faga. Infekują one kolejne komórki. W cyklu litycznym genom faga funkcjonuje w komórce

w postaci autonomicznej, tzn. replikuje się w sposób niezależny od chromosomów komórki bakterii.

Na pewnym etapie tej replikacji, tworzone są konkatamery

genomu faga. Wczesna replikacja

zachodzi sposobem dwukierunkowym, zaś późna techniką obracającego się koła, prowadząc do

powstania konkatamerów, które są liniowymi polimerami genomów faga. Na granicy pomiędzy

poszczególnymi jednostkami konkatamerów występują sekwencje Cos, które później dadzą początek

lepkim końcom. Zatem replikacja na zasadzie obracającego koła prowadzi do powstania

konkatamerów, czyli polimerów genomu faga, które są substratem reakcji pakowania. Oznacza to, że

poszczególne jednostki genomowe, w czasie pakowania są umieszczone w wnętrzu główek. Potem

Konkatamer - cząsteczka DNA zbudowana z jednakowych odcinków połączonych ze sobą na zasadzie głowa-

ogon.

dodawane są ogonki wirionów i jest to zsynchronizowane z lizą komórki gospodarza, która uwalnia

kompletne winiony.

Do główki pakowej w trakcie pakowania trafia odcinek równy danemu genomowi. Co jest

ważne, w mechanizmie pakowania, przy użyciu odpowiednich białek? Otóż zapakowaniu ulega tylko

DNA, które spełnia dwa warunki. Kryterium pierwsze to fakt, że docelowa sekwencja jest

oflankowana sekwencjami Cos (krótkie, kilkunastonukleotydowe odcinki). Istotna jest także wielkość

DNA. Najefektywniej pakowane są odcinki odpowiadające długościom genomowi, czyli około 50KD.

Czyli wielkość fragmentu oraz oflankowanie sekwencjami Cos decyduje o tym, że dany fragment

konkatemeru zostanie umieszczony we wnętrzu główki. Wykrawanie jednostek genomowych jest

także połączone z wytwarzaniem lepkich końców.

2) Inną, alternatywną drogą egzystencji faga w komórce jest droga lizogeniczna

, czyli „potencjalnie

lityczna”. W tej sytuacji fag funkcjonuje inaczej - jego genom ulega integracji z genomem bakterii (nie

jest autonomiczny). Integracja kolistego genomu bakterii (większy) oraz również kolistego genomu

faga Lamda (mniejszy) odbywa się na zasadzie rekombinacji zlokalizowanej. Jest to rodzaj

rekombinacji nieuprawnionej, czyli nie wymagającej homologii łączonych fragmentów. Rekombinacja

zachodzi w obrębie określonych miejsc obu genomów, zwanych punktem att (ang. Atchment- miejsce

przylegania,przyłączenia). Miejsce takie w genomie faga to attP od ang. phage, a u bakterii attB od

ang. Bacteria. Odpowiednie enzymy rozpoznają takie sekwencje i katalizują miejsce nacinania oraz

potem łączenia ich łączenie w taki sposób, iż genom faga staje się elementem chromosomu bakterii.

W takim stadium, faga określamy mianem kofaga, dlatego, że jego genom może ulec wycięciu i w

formie autonomicznej wejść w cykl lityczny.

Najważniejszy fag?

Jaki fag miał najistotniejszy wpływ na to, że ludzie wpadli na pomysł wykorzystania go, jako

wektora do klonowania? Był to wspomniany wcześniej fag Lambda. Aby lepiej to zrozumieć,

powróćmy na chwilę do pakowania. Do faga można zapakować dowolne DNA, spełniające podane

wyżej dwa warunki(oflankowanie Cos i wielkość). Dlatego naukowcy wpadli na pomysł, żeby

oszukiwać faga Lambda. Na mapie genomu fagowego, można znaleźć centralnie położony fragment

odpowiedzialny za integrację rekombinacji, czyli sekwencje, które są potrzebne w cyklu

lizogenicznym, czyli tym, który prowadzi do integracji. Sekwencje te można w ogóle usunąć, bądź w

ich obręb wprowadzić klonowane DNA bez upośledzenia funkcji litycznych.

Rodzaje wektorów fagowych

Wektory fagowe do klonowania można podzielić na dwie kategorie:

-insercyjne- wektory, które działają na zasadzie insercji klonowanego DNA w centralnym rejonie

genomu

-substytucyjne- w tych wektorach centralny fragment się usuwa i wprowadza się klonowane DNA.

Biorąc pod uwagę ograniczenie, jakie nakłada system pakujący, zróżnicowana jest pojemność

wektorów. Isnercyjne mieszczą około 10 KB, substytucyjne do 20 KB. Wiąże się to z faktem, iż

całkowity fragment pakowany do wektora, nie może znacząco przekroczyć 50 KB

Klonowanie w wektorze fagowym

Klonowanie typu substytucyjnego to jeden z rodzajów klonowania w wektorze fagowym. W

technice tej występuje część odpowiadająca DNA wektora i część odpowiadająca DNA

klonowanemu. Zajmiemy się najpierw DNA wektora.

W tym klonowaniu izoluje się DNA fagowe i to DNA, to w przybliżniu DNA faga, w którym

możemy wyróżnić trzy części:

I część centralna – znajdują się w niej geny odpowiedzialne za rekombinację zlokalizowaną, czyli te

których obecność jest niezbędna do przeprowadzenia cyklu lizogenicznego.

II i III część tworzą tak zwane „ramiona” przylegające do sekwencji Cos.

Przygotowanie klonowanego DNA polega na rozbrojeniu DNA faga na te segmenty enzymem

restrykcyjnym, a następnie izoluje się preparat ramion, co można osiągnąć na przykład przez

elektroforezę, czyli z żelu po rozdziale wyciąć odpowiednie prążki, odpowiadające konkretnym

segmentom. Odrzucamy natomiast część centralną- cześć zwaną wypełnieniem. Zatem na końcu tej

procedury dysponujemy preparatem ramion.

W przypadku DNA klonowanego mamy procedurę klonowania całości DNA genomowego

wektorów. Całkowite DNA genomowe trawione jest również enzymem restrykcyjnym, innym niż przy

trawieniu wektora, ale takim, który generuje zgodne lepkie końce. Produkty trawienia nie są

stosowane w całości, wykorzystuje się natomiast fragmenty o wielkości około 15 KB. Chodzi o to, by

klonowane fragmenty pasowały mniej więcej do pojemności wektora. Jeżeli więc pojemność wynosi

średnio 20 KB, to wybór fragmentów 15 KB, jest jak najbardziej wskazany. Jak izolować tą frakcję?

Również poprzez elektroforezę- rozdzielamy całość produktów trawienia. Te produkty, ponieważ jest

ich bardzo wiele, a nie różnią się znacznie od sobie, na żelu tworzą smugę i to z niej należy pożądany

segment wyciąć.

Trawienie takie, jest trawieniem częściowym (partial). Oznacza to, że nie wszystkie miejsca

restrykcyjne są przez enzym przecięte, strawione. Realizuje się to w ten sposób, że dodaje się albo za

mało enzymu, albo trawi się przez krótszy czas, niż wymagany jest do całkowitego strawienia. Chodzi

o to, by wszystkie sekwencje wchodzące w skład genomu były reprezentowane w tej frakcji 15KB.

Jeżeli strawilibyśmy wszystko całkowicie, to otrzymalibyśmy jedynie reprezentację genomu,

natomiast jeżeli stawimy częściowo, to otrzymamy rozmaite sekwencje, które w sumie dadzą

komplet sekwencji genomowej. Zatem, dlatego że jedne cząsteczki poddawane trawieniu będą

strawione całkowicie, a inne częściowo, uzyskamy komplet sekwencji.

Na koniec następuje połączenie w mieszaninie otrzymanych fragmentów z preparatami

ramion, a ligacja prowadzona jest przy takich stężeniach klonowanego DNA i DNA wektora, aby

faworyzować tworzenie krótkich linowych produktów, które są pewnego rodzaju konkatamerami.

Jednostka takiego konkatameru wygląda następująco: lewe ramię- wstawka-prawie ramię- Cos- lewe

– wstawka – prawe –Cos…

Te produkty ligacji i wzbogacone konkatamery, są następnie wykorzystane do reakcji zwanej

pakowaniem In Vitro

Pakowanie In Vitro

Proces ten polega na tym, że mieszaninę ligacyjną, dodaje się do preparatu białek fagowych,

zdolnych po formowania wirionu. Ten preparat otrzymujemy poprzez podanie firmie produkującej

takie preparaty pakujące odpowiednich danych. Posiada ona dwa szczepy bakterii Escherichia coli.

Każdy z tych szczepów jest zainfekowany defektywnym fagiem, tzn. że w żadnym z tych szczepów nie

dochodzi do formowania wirionu. Każdy z tych szczepów może z tym fagiem żyć, gdyż nie wpływa on

na niego destrukcyjnie. Ekstrakt białkowy takich szczepów, zawierający fagowe ekstrakty białek obu

szczepów, łączy się ze sobą i dzięki temu otrzymujemy w tej mieszaninie komplet białek potrzebnych

do formowania wirionu i ten preparat miesza się z produktami ligacji. Po wymieszaniu w rezultacie

tworzą się fagi potomne, o charakterze rekombinantowym, bo zamiast centralnej części genomu

posiadają klonowane DNA. Tymi rekombinantowymi fagami infekuje się bakterie E. coli.

Infekcja E. coli

Infekcja realizuje się w ten sposób, że fagi rekombinantowe dodaje się do odpowiednio

przygotowanej kultury szczepu E. coli. W jednej próbce mieszamy dwa składniki, poprzez dodanie

fagów do zawiesiny E. coli. Te probówki inkubuje się w 37 stopniach przez pół godziny, dając w ten

sposób fagom czas na zainfekowanie komórek E. coli.

Należy zwrócić uwagę na fakt, iż muszą być kontrolowane miana fagów- liczba cząstek

fagowych nie może być zbyt duża. Należy dodać odpowiednie miano fagów. Jest to spowodowane

tym, że większość komórek ma pozostać zdrowych, a jedynie nieliczne mają być zainfekowane.

Następnie dodaje się do tej zawiesiny letnią, lecz płynną, agarozę, miesza powstałą substancję i

wylewa na płytkę, która wcześniej jest przygotowana: znajduje się na niej podłoże z agaru

odżywczego.

W ten sposób na płytce mamy dwie warstwy : agar odżywczy oraz top agar z komórkami E.

coli, z których co poniektóre są zainfekowane. Te zainfekowane komórki po jakimś czasie ulegają

lizie, dlatego że fag ulega w nich rozwojowi litycznemu. Uśmiercone komórki uwalniają zatem nowe

fagi do otoczenia, powodując infekcję sąsiadujących komórek i są uśmiercane. Strefa zabijanych

komórek się powiększa. Równocześnie z tym procesem zachodzi także intensywne namnażanie

jeszcze niezarażonych komórek. Innymi słowy, top agar intensywnie przerasta różnymi bakteriami,

robi się „mleczny” i tam, gdzie znalazła się zainfekowana komórka, rozszerza się strefa klarowna

(niemleczna). Miejsca z bakteriami są „mętne”, zaś tam, gdzie komórki ulegają lizie, pojawia się coś

podobnego do czystego, niezabarwionego agaru. Takie klarowne miejsca śmierci komórek określamy

mianem łysinek fagowych. Jeżeli zastosujemy więc wektor fagowy, będący pochodną faga Lambda, to

klony rekombinantowe będą wzrastać w postaci łysinek a nie w postaci kolonii, z którymi mieliśmy

do czynienia w przypadku wektorów plazmidowych.

Każda z łysinek charakteryzuje się obecnością konkretnego fragmentu klonowanego DNA.

Następnie przeprowadza się selekcję klonów rekombinanowych zawierających specyficzną, określoną

sekwencję, o której powiemy później.

Wektory kosmidowe

Kolejną kategorią wektorów są wektory kosmidowe. Nazwa kosmid pochodzi od dwóch słów:

Cos- sekwencja Cos faga Lambda oraz mid- od słowa plazMID. Kosmidy są to twory łączące cechy faga

i plazmidu. Będąc bardziej specyficzne, kosmidy są to plazmidy, do których wprowadzono sekwencję

Cos faga Lambda.

Klonowanie wygląda następująco: wektor kosmidowy jest izolowany z komórek Escherichii, a

następnie zlinearyzowany. Po tym etapie miesza się linearyzowany preparat z DNA klonowanym i

następuje ligacja faworyzująca powstawanie liniowych polimerów złożonych odcinków: kosmid-

klonowane DNA-kosmid- klonowane DNA –itd. Takie jednostki są oflankowane sekwencjami Cos. Do

produktów ligacji dodaje się ekstrakt fagujący. Powstają wiriony potomne, rekombinantowe, którymi

infekuje się E. coli dokładnie w taki sam sposób, jak dla w przypadku wektorów fagotowych. Wysiew

bakterii po infekcji jest zupełnie inny. Nie ma formowanie warstwy top-agaru. Bakterie po infekcji

wysiewane są na klasyczną pożywkę agarową z czynnikiem selekcyjnym i oczekujemy na pojawienie

się kolonii. Dlaczego nie ma top-agaru oraz łysinek? Należy zwrócić uwagę, że z całego genomu faga

Lambda w kosmidach znajdują się tylko sekwencje Cos, nie ma żadnych sekwencji kodujących, wobec

tego nie ma mechanizmu, który mógłby tę komórkę zabić.

Kosmidy rekombinantowe funkcjonują w komórce, jak zwykłe plazmidy i w związku z tym

obserwujemy formowanie kolonii. Co zatem zyskujemy, jeżeli struktury te funkcjonują jak plazmidy?

Korzyści są dwie: klasyczne klonowanie przy użyciu wektora plazmidowego pozwala na wstawienie

insertu nie większego niż 10 KB. W przypadku kosmidu można wstawić ponad 40 KB. Zatem pierwszą

korzyścią jest pojemność wektora. System pakujący jest w stanie pomieści w cząstce fagowej, a

następnie przemycić do E. coli duże segmenty klonowanego DNA. Są one tak duże, bo dopełniana jest

wtedy pojemność wektora do pojemności około 50KD. Druga zaleta to, że do wprowadzenia

klonowanego DNA do komórek wykorzystuje się system naturalnie wykształcony przez fagi. W

związku z tym, jeżeli użyjemy odpowiedniej ilości fagów, każda komórka zostanie zainfekowana,

podczas kiedy przy użyciu klasycznej transformacji komórek kompetentnych Escherichii takiego

wyniku nie jesteśmy w stanie osiągnąć. Zaletami kosmidów jest więc zwiększona pojemność oraz

duża wydajność.

Wektory wielkopojemnościowe YAC

Rozwojem systemów klonowania kierowała chęć zwiększenia pojemności wektorów.

Standardowa pojemność wstawek przy użyciu wektorów plazmidowych to kilka tysięcy par zasad,

przy użyciu wektorów fagowych typu substytucyjnego to około 20 tysięcy par zasad, a kosmidów

około 40 tysięcy par zasad. Ale i tak wielkość w przypadku kosmidów nie jest wystarczająca,

zwłaszcza przy konstruowaniu bibliotek genomowych organizmów eukariotycznych, które zawierają

bardzo duże ilości DNA. Potrzebne są więc wektory o jeszcze większej pojemności. Pierwszymi

powszechnie stosowanymi wektorami o takiej ultra-dużej pojemności były YACi [czyt. „jaki”].

Nazwa wektorów YAC bierze się z greckiego rozwinięcia skrótu- sztuczny chromosom

drożdżowy. Mają one charakter nie tylko drożdżowy. YACi mają sekwencje zarówno funkcjonujące w

komórkach drożdzy, jak i sekwencje, które pozwalają im funkcjonować w komórce bakterii, a

konkretnie w E. coli. O takich wektorach mówimy, że są wektorami wahadłowymi, gdyż mogą mieć

więcej niż jednego gospodarza.

Forma YACa funkcjonującego w komórce E. coli przedstawia się następująco: jest to

cząsteczka kolista, występuje bakteryjne ORI oraz marker selekcyjny. Pozostałe sekwencje, to

sekwencje dedykowane dla komórki drożdży: ARS1 – sekwencja autonomicznej replikacji, jest to

miejsce spełniające analogiczne funkcję, jak ORI w wektorze plazmidowym- miejsce początku

replikacji funkcjonujące w komórkach drożdży; kolejna grupa sekwencji to TRP1, URA3 i HIS3-

drożdżowe markery selekcyjne. Działają one na innej zasadzie niż markery selekcyjne, z którymi

spotkaliśmy się do tej pory. Komplementują one najpierw mutacje auksotroficzne obecne w szczepie

drożdży wykorzystanych do klonowania.

Mutacja auksotroficzna- to taka mutacja, która sprawia, że komórka nie może funkcjonować

bez określonego składnika na pożywce, nie może go syntetyzować, należy go jej podać. Jakie to

związki, można wywnioskować z nazw mutacji, np. aminokwasy, zasady azotowe. Innymi słowy ten

szczep drożdży, do którego wprowadzane są wektory typu YAC, jest mutantem i ma wspomniane

mutacje auksotroficzne. Zatem ten szczep drożdży nie może funkcjonować na pożywkach

pozbawionych pewnych składników, np. tryptofanu. Jeżeli więc, szczep wysiejemy na pożywkę

minimalną(pozbawioną

składników),

nie

będziemy

stanie

obserwować

wzrostu.

Sekwencje w YACach komplementują te mutacje, które u drożdży są obecne-

komplementują, tzn. znoszą ich efekt, uzupełniają je. Komórka drożdży nie będzie zatem zdolna do

wzrostu na pożywce mnimalnej, chyba że w wyniku transformacji dostanie na pożywce drożdże

danym markerem. Takich markerów, czyli sekwencji które komplementują mutacje auksotroficzne

występujące w szczepie drożdży wykorzystywanym do klonowania, jest 3 w YAC4.

W YACu występuje także sekwencja centromerowa , która zapewnia odpowiednią segregację

YACa do komórek potomnych. Występują także inne charakterystyczne sekwencje chromosomów

eukariotycznych, a mianowicie dwie sekwencje telomerowe, o przeciwnej orientacji, zwrócone do

siebie oraz sekwencja SUP4, która pozwala na identyfikację transformantów rekombinantów, w

obrębie której jest miejsce EcoR1- jest to miejsce klonowania i to miejsce przyjmuje insert.

Schemat klonowania

Przedstawiany schemat koncentruje się głównie na kolejach losu wektora, nie zaś na DNA

klonowanego.

I etap

to namnożenie wektora w komórce E. coli. W szczepie Escherichii zawierającym YACa

powielana jest odpowiednia ilość DNA wektorowego, które jest następnie izolowana i trawiona

restrykcyjnie. Trawienia dokonuje się przy użyciu dwóch enzymów restrykcyjnych: BamH1 wytrawia

segment DNA oddzielający sekwencje telomerowe. Drugi enzym eksponuje miejsce klonowania, do

którego powędruje DNA, np. EcoR1. W ten sposób cały preparat ulega roztrawieniu na 3 segmenty:

lewe ramię- z jednym markerem selekcyjnym(TRP1) ,prawe ramię- z kolejnym markerem(URA3) oraz

odcinek z markerem HIS3, który jest odrzucany.

Trawienie takie jest połączone z frakcjonowaniem, dzięki któremu uzyskuje się preparat

ramion (każde ramię ze swoim markerem).

II etap- ligacja preparatu ramion z klonowanym DNA. Klonowane DNA jest również przygotowywane

na drodze trawienia restrykcyjnego, przy czym po tym trawieniu izolowane są jeszcze większe

fragmenty DNA. To DNA rozdziela się metodą elektroforezy pulsacyjnej, także żel będzie miał trochę

inny zakres rozdzielanych fragmentów- najmniejszych prawdopodobnie nie będzie widać. Izolujemy

fragmenty o wielkości około 800 KB. Ten preparat jest następnie poddawany ligacji z ramionami.

Produktami ligacji powinny być liniowe cząsteczki złożone z następujących segmentów: lewe ramię-

insert- prawe ramię. W takiej konfiguracji liniowe sekwencje wprowadzane są do komórek drożdży,

gdzie funkcjonują podobnie do oryginalnych chromosomów. Pożądane transformanty będą

wykazywały komplementację mutacji TRP1 i URA3, natomiast nie powinny komplementować mutacji

HIS3 i powinny być czerwone. Poprzez zastosowanie YACów zyskujemy ogromną pojemność, rzędu

nawet miliona par zasad.

Biblioteki DNA

Efektem procesu klonowania są biblioteki DNA. W rezultacie tego procesu otrzymujemy

kolekcję

płytek.

Biblioteki

DNA,

które

generujemy

dzieli

się

dwie

kategorie:

-genomowe- klonowane DNA ma charakter genomowy;

- biblioteki

cDNA

(cDNA-

komplementarne

DNA,

uzyskane

matrycy

RNA).

Biblioteka DNA

to kolekcja fragmentów DNA(genomowego lub cDNA) danego organizmu,

które to fragmenty ,zostały wprowadzone do określonego wektora. Od rodzaju wektora zależy postać

biblioteki. Jeżeli mamy do czynienia z wektorami plazmidowymi, kosmidowymi i YAC, biblioteka ma

postać kolekcji klonów, które umieszczane są na wielopłytkach (mają one format najczęściej 384

dołków). Wszystkie klony rekombinantowe są umieszczane w poszczególnych studzienkach biblioteki.

Jest to tak zwana biblioteka uszeregowana, ponieważ każda płytka ma swój numer, a oprócz tego

każda studzienka w wielopłytce ma swoje współrzędną (jest elementem konkretnego szeregu i

kolumny). Jesteśmy więc w stanie określić położenie każdego klonu w bibliotece.

Nieco inaczej jest w przypadku konstrukcji bibliotek, do których używamy wektorów fagowych.

Biblioteki przechowuje się w probówkach- jest to zawiesina cząstek fagowych. Przed każdym jej

wykorzystaniem należy przeprowadzić wysiew, połączony z otrzymaniem łysinek i wtedy uzyskujemy

pożądaną liczbę szalek.

Dlaczego tworzymy biblioteki genomowe?

Posłużmy się analogią do wyjściowego terminu, który stosowany jest do opisu bibliotek

genomowych, a mianowicie biblioteki w sensie klasycznym. Do takiej biblioteki udajemy się po to,

żeby pożyczyć książkę. Z jakichś źródeł dowiadujemy się, że dana książka zawiera interesujące nas

treści, a następnie udajemy się do biblioteki i wypożyczamy dany skrypt. W przypadku bibliotek DNA

jest bardzo podobnie- do bibliotek tych udajemy się w pewnym celu- chcemy z nich pozyskać klony

zawierające specyficzny odcinek DNA. Biblioteka jest to dla nas źródło klonów zawierających

pożądane sekwencje.

Dobra bibliotek zawiera komplet sekwencji, lecz z reguły jesteśmy zainteresowani specyficzną

częścią. Istnieje zatem konieczność selekcji pożądanych klonów rekombinantowych. Są to poziomy

selekcji, które stosuje się przy klasycznym klonowaniu. Musimy mieć możliwość wybrania z biblioteki

przedmiotu naszego zainteresowania.

Rozmaite metody służą do selekcji klonów rekombinantowych:

-selekcja bezpośrednia- polega na tym, że poszukiwany klonowany fragment DNA zmienia w sposób

charakterystyczny fenotyp gospodarza. Klonowana sekwencja ulega ekspresji (transkrypcja ,translacja

i otrzymane białko wpływa na fenotyp gospodarza). Jest to sytuacja dosyć komfortowa, gdyż poprzez

obserwację szalki z koloniami mamy możliwość wybrania jednej, interesującej nas. Jest to jednak

sytuacja rzadka, bo klonowane DNA niezbyt często komórkom gospodarza nadaje określony fenotyp.

Z reguły ma to miejsce np. gdy sekwencje bakteryjne klonujemy w innych bakteriach (często

spokrewnionych).

-selekcja immunologiczna- klonowany odcinek DNA ulega ekspresji (transkrypcji i translacji) i musi w

związku z tym formowane być białko, ale nie musi ono nadawać komórkom gospodarza nowego

fenotypu, bo i tak jesteśmy w stanie ten określony klon komórek gospodarza odnaleźć. Używamy do

tego specyficznego przeciwciała, przeciwko temu białku, które powstaje na bazie klonowanego

fragmentu. Następnie kompleks przeciwciało- białko jest przy użyciu przeciwciała drugorzędowego

wykrywany, co jest sprzężone z aktywnością enzymu reporterowego.

-selekcja oparta o hybrydyzację- Co zrobić, jeżeli białko, które ma powstać na bazie klonowanego

DNA nie powstaje? Jeżeli takie białko nie występuje, odwołujemy się do kolejnego typu selekcji.

Wtedy insert w wektorze wykrywamy używając specyficznej sondy, która posiada znacznik.

Hybyrydyzuje ona wtedy z insertem i wykrywamy go koniungatem przeciwciała antyhaptenowego z

enzymem. Dzięki temu sposobowi selekcji, sekwencja klonowana nie musi ulegać ani transkrypcji ani

translacji. Źródłem sondy (odcinka DNA lub RNA) jest bazowanie na homologii. Jeżeli pracujemy z

organizmem modelowym to można sekwencję docelową wykryć przy użyciu np. sekwencji

reprezentującej tą samą rodzinę wielogenową. Innymi słowy mając jednego członka rodziny

wielogenowej, mając jeden gen, można go wykorzystać jako sondę do poszukiwania członków tej

rodziny. Jeżeli zaś pracujemy z organizmem słabo poznanym , to jako sondy wykorzystujemy geny z

roślin modelowych, czyli poznanych.

Przeprowadzanie selekcji metodą immunologiczną i hybrydyzacyjną

Wykonuje się to poprzez przeniesienie klonów rekombinantowych na błony. Ten proces

przenoszenia na błony odbywa się następująco: dysponujemy szalką, np. z łysinkami fagowymi, ale

mogą to być kolonie bakteryjne, na tą szalkę nakładamy fragment błony nitrocelulozowej, bądź

nylonowej, w każdym razie błony hybrydyzacyjnej. Po jakimś czasie odklejamy błonę i część materiału

białkowego, która znajdowała się na pożywce przykleja się do błony, a następnie błonę poddajemy

procesowi selekcji immunologicznej, bądź hybrydyzacyjnej- procesowi detekcji specyficznego białka

lub fragmentu DNA. Problem polega na tym , że sygnały muszą być odniesione do tego co

uzyskaliśmy na płytce. Jest to dosyć problematyczne i służy temu naniesie pewnych współrzędnych,

którymi są nakłócia, które robi się igłą na błonie i agarze. Następnie jeżeli mamy naświetloną kliszę

fotograficzną, umieszczamy pod nią błony i sygnałami hybrydyzacyjnymi lub immunologicznymi

zaznaczamy miejsca ulegające perforacji. Na kliszy umieszczamy szalki, a ten zabieg pozwala na

właściwe ustawienie szalek. Potem dzięki dopasowaniu, wycinamy odpowiednią kolonię(dysponując

sygnałami na kliszy), który prawdopodobnie zawiera docelową łysinkę.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 5

Biblioteka cDNA a biblioteka genomowa – różnice
Biblioteka genomowa – daje komplet informacji genetycznej,
Biblioteka cDNA- daje pewne frakcje informacji genetycznej, są to frakcje reprezentowane przez
cząsteczki RNA (różnią się źródłem RNA oraz transkryptem)
Po co na biblioteki?
Do bibliotek DNA udajemy się po klon z określoną sekwencją. Jest to trudne, ponieważ genomy
eukariontów zawierają wiele sekwencji repetytywnych i niekodujących. Sekwencje takie, mówimy,
rozcieńczają docelowe geny. Ma to miejsce jeżeli wyszukujemy sekwencje w bibliotece genomowej.
Lepsza zatem, pod tym względem, jest biblioteka cDNA. Biblioteki są więc dla nas bazą do analizy
genomów.
Mapy fizyczne
Uszeregowanie klonów biblioteki genomowej, która odzwierciedla oryginalny układ genów
chromosomie, opiera się na konstrukcji jego mapy fizycznej. Na mapie takiej, odległości między loci
zaznaczone są w milionach par zasad – odbywa się to poprzez znakowanie.
Na jakiej zasadzie następuje szeregowanie ciągów klonów? Można rozróżnić dwa podejścia:
I: finger printing- tworzenie genetycznego odciska palca klonów. Na bazie klonów znajdujących się w
wielopłytce, wytwarzamy jego profil genetyczny. Jeżeli mamy serię klonów, to do każdego z nich
otrzymujemy odpowiedni profil. Następnie analiza komputerowa profili ( na podstawie powstałych
prążków), szereguje jest dobrej kolejności.
II: uczynienie z klonu albo z terminalnej sekwencji sondy, które wykazują wtedy homologię z
fragmentami chromosomów. Klony, które są w bibliotekach, są klonami zachodzącymi i niektóre
fragmenty reprezentowane są w większej liczbie klonów.
Metody klonowania genów:
Metody:
1)klonowania bazie homologii sekwencji
2) klonowanie na bazie znajomości białka
3)klonowanie genów kodujących białka oddziaływujące ze znanymi białkami/RNA
4)klonowanie genów (sekwencji nukleotydowych) przylegających do znanego regionu DNA
5)klonowanie pozycyjne
6) klonowanie genów o zróżnicowanej ekspresji
7)klonowanie fenotypowe.
Ad1) Klonowanie na bazie homologii z sondą: można otrzymać bibliotekę genomową i cDNA i
przeszukać ją sondą wykazującą podobieństwo sekwencji. Źródła podobieństwa fragmentów:
dysponowanie analogicznymi genami, jak np. u organizmu modelowego lub bazowanie na
poszukiwaniu geny reprezentującego całą rodzinę genową.
Ad2)Klonowanie na bazie znajomości białka: dysponując białkiem można uzyskać specyficzne
przeciwciało, dzięki któremu przeglądamy bibliotekę ekspresyjną, aż do wyszukania genów
rekombinantowych.
Ad3) klonowanie genów kodujących białka oddziaływujące ze znanymi białkami/RNA: metody:
Yeast two-hybrid system, Reverse two-hybrid system, Dial – bait system
Inicjacja: to że rozpocznie się transkrypcja, zależy od oddziaływania białek oraz białek z cząsteczką
matrycowego DNA. (tworzenie tran skryptu to oddziaływanie typu: białko-RNA)
Yeast two-hybrid system – Dwuhybrydowy system drożdżowy
Dysponujemy drożdżami, reprezentowanymi przez szczep reporterowy. Do komórki drożdży
wprowadzany jest tzw. konstrukt, czyli fragment DNA, który powinien zawierać gen reporterowy
poprzedzony miejscem wiążącym domenę DBD. Konstruktem może być na przykład plazmid, który

koduje białko złożone z dwóch komponentów: DBD –domena oraz „przynęty” – czyli domeny
tworzonej przez białko, dla którego działa (np. cząsteczka polimerazy). Dzięki temu systemowi
możliwe jest wyławianie białka czynników transkrypcyjnych..
Co dzieje w się w komórce szczepu?
(…)???
Ad 4) klonowanie genów (sekwencji nukleotydowych) przylegających do znanego regionu DNA:
wykorzystanie szczepu reporterowego, którego ekspresję łatwo wykryć. Mamy do czynienia z
domeną Hook-DBD i konstruktem, którego produktem jest rekombinantowa cząsteczka przynęty RNA
– RNA kotwiczące. W tym szczepie mamy do czynienia z ekspresją genu biblioteki. Szczep: struktury
Hook, hybrydowa cząsteczka RNA i konstrukt z biblioteki kodującej białko z biblioteki i z segmentu
rekombinacyjnego.
Ad5) klonowanie pozycyjne:
Techniki: inverse PCR, vectorette PCR, tail- PCR, race PCR
Metoda ta stosowana jest jeżeli mamy do czynienia ze znaną sekwencją znajdującą się w otoczeniu
nieznanej. Szukamy wtedy tej nieznanej, np. w kontekście genomowym lub na poziomie cDNA.
Vectorette custom primer- cząsteczka adaptorowa – dwuniciowa cząsteczka DNA, w której
homologia ograniczona jest do końców sekwencji. Technika tak bazuje na PCRze. Etap wstępny w
Vectorette to trawienie restrykcyjne badanej próbki, żeby wytrącić segment ze znaną sekwencją- jest
to punkt wyjścia dla dalszych manipulacji. Produkty trawienia poddajemy i ligacji z cząsteczkami
adaptorowymi. Dopiero wtedy przeprowadzamy reakcję PCR. W pierwszym cyklu reakcji generowane
jest miejsce przyłączenia startera.
CASETA VECTORETTE

????

Race PCR – realizacja przebiega na poziomie cDNA . RACE- oznaczają szybką amplifikację cDNA. Może
zachodzić na dwa sposoby : realizacja 3’ i 5’:
Realizacja 3’ – na bazie RNA przeprowadzamy odwrotną transkrypcję. Matryca: PCR- preparat jednej
nici cDNA. Startery: starter dla sekwencji adaptorowej, 3’AMP- informacja na tamat 3’ wyjściowej
cząsteczki DNA.
Realizacja 5’- sztuczna poliadenylacja (terminalna transferaza). Poliadenylowane cDNA stanowi
matrycę do reakcji PCR. 3 startery?
Klonowanie pozycyjne
Klonowanie to pozwala na sklonowanie genu na podstawie znajomości jego pozycji na mapie
genetycznej. Do przygotowania reakcji należy dysponować: zintegrowaną mapą genetyczną oraz
biblioteką genomową ( arrayed genomic library).
Zasada mapowania genetycznego – klasyczne odkładanie loci ( Loci klasyczne to geny o znanym
efekcie fenotypowym i poznanej sekwencji)
- markery molekularne, które również mają znaną sekwencję ,ale
nie warunkują wystąpienia cech fenotypowych
- mapa zintegrowania (połączenie obu typów)

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 6

*Ciąg dalszy klonowania pozycyjnego

Folia przedstawia zamazane kropki, które powstają na tle okrągłych cieni. „Kropki” posiadają

różną intensywność. Przedstawia ona selekcję różnych klonów rekombinantowych poprzez

hybrydyzację. Historia przedstawionych obrazów jest następująca: do trzech szalek, w pewnym

momencie zostały przyklejony fragmenty błony nylonowej, następnie błona została odklejona i część

materiału biologicznego, w tym przypadku część komórek została przyklejona do błony, reszta

pozostała na szalce, następnie błona poddana została pewnego rodzaju obróbce, polegającej na lizie

komórek do niej przyklejonych- robi się to poprzez położenie błony na bibule nasączonej

odpowiednimi roztworami. Po lizie następuje etap denaturacji, czyli błonę kładzie się na podłożu o

pH alkalicznym, które doprowadza do separacji odcinków DNA. Następnie taką błonę hybrydyzuje się

z sondą dla genu, który jest poszukiwany.

Jeżeli przeprowadzalibyśmy selekcję przy pomocy przeciwciał, to efekt detekcji klonów

rekombinantowych wyglądałby całkiem podobnie, z tym że inne byłoby podłoże fizykochemiczne

produkowanych sygnałów, sygnały byłyby rezultatem aktywności enzymów, które są koniugowane z

przeciwciałami drugorzędowymi.

Mapy genetyczne

Podstawą klonowania pozycyjnego, jest występowanie danego genu na mapie genetycznej,

która powstaje w rezultacie analizy częstości rekombinacji. Należy dysponować mapą genetyczną, na

której znajduje się dany gen, o którym wiemy, jak segreguje w raz z innymi cechami- znamy jego

efekt fenotypowy, a konkretnie efekt fenotypowy jego mutacji, na podstawie którego możemy

wnioskować o występowaniu allelu zmutowanego, dzikiego. Podsumowując, znamy pozycję na

mapie, fenotyp, nie znamy zaś sekwencji nukleotydowej tego genu. Zatem celem klonowania

pozycyjnego jest, bazując na informacji genetycznej, poznanie sekwencji nukleotydowej. Należy także

dysponować biblioteką genomową, w której każdy klon ma określoną pozycję w jednej z wielopłytek-

każdy klon zdefiniowany jest przez 3 współrzędne: numer wielopłytki, numer kolumny i numer

wiersza, w którym się znajduje. Są to najczęściej klony uzyskane na bazie sztucznych chromosomów

(np. drożdżowych).

Mapy genetyczne - powstają na bazie analizy częstości rekombinacji - mamy dane loci i w

populacji obserwujemy sekwencje poszczególnych genów i na tej podstawie wnioskuje się o ułożeniu

poszczególnych loci na chromosomie. Odległość pomiędzy poszczególnymi loci mierzone są w

jednostkach mapowych lub inaczej w centymorganach - częstość rekombinacji, jaka zachodzi

pomiędzy poszczególnymi genami. 1 centymorgan oznacza, że 1 na 100 wytworzonych gamet ma

układ rekombinantowy alleli w stosunku do organizmu rodzicielskiego.

Loci, z którymi zazwyczaj można spotkać się na kursach genetyki klasycznej, określane są

mianem loci klasycznych, czyli to są loci, względem których znamy efekt fenotypowy, np. czerwone

oczy, odporność na chorobę, karłowatości liści, itp., ale nie znamy ich sekwencji nukleotydowej.

Jednakże analogiczne mapy (do map genetycznych) można stworzyć dla markerów molekularnych.

Markery molekularne

Markery molekularna to sekwencje DNA, fragmenty DNA, którymi dysponujemy, jednak nie

warunkują one żadnego fenotypu lub nie wiem o tym, by wpływały na występowanie danej cechy.

Markery można także nanosić na mapy genetyczne. Jeżeli w populacji mapowej, charakterystycznymi

cechami będzie obecność określonego fragmentu DNA, wykrytego pewną metodą (np. hybrydyzacją),

i będzie ona warunkować wystąpienie cechy, to możemy ten fragment zmapować. Można uzyskiwać

zatem mapy w sensie klasycznym lub mapy, które zawierają loci dla markerów molekularnych.

Przykładami map mogą być:

-mapa klasyczna

-mapa markerów molekularnych

-mapa zintegrowana, zawierająca dane o sekwencji wyjściowej oraz dane o markerach

molekularnych.

Analiza wycinka mapy zintegrowanej

Integracja sprawia ze loci klasyczne zyskują kontekst markerów molekularnych. Można

dzięki temu stworzyć jedną zintegrowaną mapę. W tej mapie występują loci klasyczne w otoczeniu

loci molekularnych, co do których mamy pewną informację sekwencyjną- są to punkty zaczepienia,

które możemy wykorzystać, jako narzędzia do sklonowania danego genu.

Wycinek mapy może posłużyć, jako źródło informacji. W klonowaniu pozycyjnym jedną z

metod jest chromosomowe walking. Dla tych markerów, które oznaczają docelowy gen mamy

określoną pewną informację sekwencyjną, co sprawia, że dzięki temu możemy uzyskać sondę

molekularną (wyznakowane fragmenty DNA). Tymi sondami przegląda się biblioteki genomowe.

Obserwując produkt, po wystąpieniu charakterystycznych cieni, powstałych w trakcie hybrydyzacji,

można wywnioskować, że znajdują się one na pewnych poziomach, liniach, odpowiadającym ułożeniu

odcinków DNA w wielopłytce. Dzięki hybrydyzacji identyfikujemy klony, które zawierają homologię z

sondą, czyli klony, reprezentujące sekwencje, które w genomie znajdują się w pobliżu

docelowego fragmentu.

Przeprowadzając walking, klon, który został zidentyfikowany w czasie pierwszej rundy

hybrydyzacji, jest źródłem kolejnych sond. I rzędowe klony są źródłem sond do spinu II-rzędowego

(konkretnie to sekwencje terminalne są przygotowywane do tworzenia sond). Tymi sondami

przegląda się bibliotekę. Jest to możliwe dlatego, że klony zachodzą na siebie fragmentami sekwencji,

a jest to możliwe dlatego, że do tworzenia biblioteki zastosowano trawienie częściowe (partial

digest). Cykl następnie powtarza się dla wszystkich markerów. Robimy to aż do momentu, kiedy

któryś z wyciągniętych klonów zawiera sekwencję markera brakującego po drugiej stronie.

Selekcja klonów rozpoczęta od markera np. „b”, jeżeli doprowadzi nas on do wyciągnięcia

markera „c”, to wiemy, że w którymś z klonów znajduje się gen przez nas poszukiwany. Jest to

niezwykle istotne, gdyż jeżeli wyciągniemy sekwencję markera „a”, znajdującego się wcześniej,

wiemy wtedy, że spacer (walking) prowadzimy w złym, przeciwnym kierunku. Klony można

analizować sekwencyjnie i dzięki temu możemy wskazać miejsce genomu, które zawiera poszukiwany

przez nas gen.

W rezultacie klonowania izoluje się geny kandydujące, a związek z fragmentu z cechą należy

potwierdzić eksperymentalnie poprzez:

- przywrócenie funkcji (gain of function)

-utrata funkcji ( loss of function).

Organizacja genomu

Genom- komplet chromosomów danego organizmu, całkowity materiał genetyczny organizmu,

aczkolwiek czasem termin ten jest używany także w innych kontekstach, np. genom wirusa lub

genom organelli, np. genom plazmidowy

Genotyp- skład alleliczny danej komórki lub organizmu, a mamy na myśli zazwyczaj konkretne allele

pewnego genu lub grupy genów. W niektórych kontekstach można mówić o całościowym zbiorze

alleli organizmu.

Genomy mogą występować w rozmaitych formach i konfiguracji, np. u E. coli występuje

genom kolisty. W komórce możemy mieć też do czynienia z chromosomem liniowym. Oprócz

chromosomów w komórkach bakteryjnych mamy do czynienia z plazmidami.

Chromosom

- cząsteczka DNA, która zwiera wszystkie geny niezbędne do życia komórki

Plazmidy – elementy zawierające informację genetyczną, czyli geny, które mogą być przydatne, ale

nie niezbędne do np. aktywności metabolicznej lub lekoodporności, zdolność do transformacji,

koniugacji, itp. Istnieją plazmidy, które nie kodują cech fenotypowych, a jedyne co robią, to

replikacja własnego materiału. Plazmidy te nazywamy kryptycznymi. Podsumowując, plazmidy nie są

to struktury esencjonalne dla życia i bytowania komórki, ale w pewnych sytuacjach mogą się przydać.

Megaplazmid- graniczny przypadek plazmidów, charakteryzujące się posiadaniem miejsca początku

replikacji typu plazmidowego, ale zawierający geny esencjonalne dla funkcjonowania komórki. Są z

reguły większe od standardowych plazmidów, lecz mniejsze od chromosomów. Prowadzi nas to do

kolejnego wniosku: genom bakterii może mieć charakter wielocząsteczkowy- może być

rozczłonkowany na wiele fragmentów/ cząsteczek.

Chromosom bakteryjny – organizacja i budowa

Chromosom bakteryjny (na przykładzie E.coli) to kolista cząsteczka, upięta w pętle ok. 40-50

pętli. Występuje szkielet białkowy, który spina ze sobą pewne fragmenty DNA, tworząc wspomniane

wcześniej pętle. Zawierają one kilkadziesiąt tysięcy par zasad. Dodatkowe struktury powstają

poprzez super-zwinięcie niektórych genów. Super-zwinięcia można przestawić za pomocą

kabla/przedłużacza. Taki kabel- cząsteczka DNA, charakteryzuję się określoną liczbą par zasad

przypadającą na skręt- jest to 10 par zasad na skręt. Zatem naturalna skrętność superhelisy to 10 par

zasad na skręt. Nie jest to wartość stała, może się zmieniać w pewnych zakresach-cząsteczkę można

dokręcać, czyli zwiększać skrętność lub rozkręcać, czyli skrętność zmniejszać. Obydwa takie zabiegi

(roz- i skręcanie) powodują wystąpienie pewnych napięć, czego skutkiem jest wystąpienie super-

zwojów. Efekt zmiany skrętności może być rozmaity: w cząsteczkach mających wolne końce, napięcia

mogą być przez nie relaksowane. Innym sposobem jest wystąpienie skrętów, można powiedzieć,

wyższego rzędu , zwanych super zwojami. Zatem jeżeli mamy wolne końce, to energia która została

wprowadzona podczas skręcania lub rozkręcania jest relaksowana przez obrót wolnych końców.

Natomiast jeżeli końce są zatopione w strukturę kolistą, bądź zlepione w strukturę pętli i zwojów,

wtedy energia prowadzi do powstania super-zwojów. Kierunek super-zwinięcia zależy od kierunku

skręcania , dodatni + , występuje przy wzroście skrętności, zaś ujemny - przy spadku skrętności.

Skręcalność cząsteczki opisują 2 liczby:

T – liczba skrętów

W-liczba super-zwojów

T+W = L = const – liczba opleceń ( dla cząsteczki kolistej lub o unieruchomionych końcach)

Ten wzór informuje nas o tym, że w takiej cząsteczce jakakolwiek zmiana skrętności prowadzi

również do zmiany liczby zwojów, tak żeby liczba opleceń pozostała stała. Tak mogą zachowywać się

pętle w chromosomach bakteryjnych oraz cząsteczki plazmidów.

Topoizomery – cząsteczki DNA, które różnią się liczbą opleceń, ale pod innymi względami są

identyczne, tj. sekwencja, długość, itp. Enzymy odpowiedzialne za zmianę liczby opleceń nazywane

są topoizomerazami.

Wielkości genomów:

Bakteryjne:

•

Mycoplasma gentalium

0,6 Mb

1 kolista cząsteczka

•

Escherichia coli

4,6 Mb

1 kolista cząsteczka

•

Sinorhizobium melitowi

6,7 Mb

1 kolista cząsteczka, 2 megaplazmidy

Genomy bakteryjne charakteryzują się dużą gęstością, czyli jest w nich mało sekwencji niekodujących.

Genomy eukariontów:

Genom jądrowy tworzy chromosomy.

•

Drożdze

np.13 Mb

•

Wielokomórkowe eukarionty 100 i >100 Mb

Genów w genomie jest około kilkadziesiąt tysięcy, jednakże niemożliwe jest podanie

dokładnej wartości, gdyż ciągle ona się zmienia. Na przykład ostatnio znacząco powiększająca się

liczba genów (pozornie powiększająca się, gdyż geny te istniały, natomiast my nie wiedzieliśmy nic na

temat ich istnienia lub funkcji), są geny kodujące mikroDNA- są to cząsteczki regulatorowe

odpowiadające za regulację aktywności docelowych dla siebie cząsteczek DNA. Stosunkowo

niedawno dowiedziano się o ich istnieniu.

C-value paradox

W genomach eukariontów większość przestrzeni genomowej zajmują geny niekodujące-

gęstość genomu jest mała. Jest to przyczyną tzw. paradoksu wartości C. Wartość C to wielkość

genomu, którą można wyrazić w parach zasad lub w pikogramach. Jest to wielkość genomu

haploidalnego. U poszczególnych grup organizmów przedstawia się ona następująco: u Mycoplazm

jest najmniejsza, u bakterii jest nieco większa, wzrasta u glonów i grzybów, następnie robaki, wynika

to z procesu ewolucji, ale przechodząc od form prymitywnych do bardziej zaawansowanych

widocznie zwiększa się pojemność genomu. Jednak do pewnego poziomu , bo u form najbardziej

zaawansowanych taka prawidłowość zanika, np. mięczaki mogą mieć genomy takie jak płazy, ryby, a

niektóre takie jak ssaki. Płazy mogą mieć genomy o wiele większe od genomów ssaczych. Wzrostowi

złożoności organizmu niekoniecznie towarzyszy wzrost wielkości genomu. Co więcej, w obrębie

nawet jednej grupy organizmów spokrewnionych, może wahać się w bardzo istotnych granicach.

Rekordzistami są rośliny kwiatowe, gdzie wielkość genomu może różnić się nawet o 3 rzędy wielkości,

czyli ponad 1000 razy. Na przeciwległych krańcach zakresu można umieścić Szachownicę zasadzką

oraz Kasztanowiec, a po obserwacji można byłoby powiedzieć, że Kasztanowiec nie wygląda na 1000

razy prymitywniejszy od Szachownicy. Tą cechę genomu określa się mianem paradoksu wartości C,

polega to na tym, że wielkość genomu nie koresponduje ze złożonością organizmu.

Z czego wynika istnienie paradoksu wartości C? Nie zależy on od mnogości sekwencji

kodujących, gdyż są one porównywalne u poszczególnych organizmów, lecz wiąże się one z ilością

sekwencji repetytywnych, które są kategorią sekwencji niekodujących.

Jak genomy są uorganizowane?

DNA u eukariontów wchodzi w skład chromatyny. Chromatyna jest to kompleks DNA oraz

białek oraz w pewnym stopniu również RNA. Wśród tych białek dominują białka histonowe. Są to

niewielkie białka zasadowe, o wielkości z reguły ok. 100 reszt aminokwasowych i charakteryzują się

dużą stabilnością ewolucyjną (porównywane u różnych organizmów są do sobie bardzo podobne).

Możemy wyróżnić pięć białek histonowych H1, H2(A,B), H3, H4. Podstawową jednostką organizacyjną

chromatyny jest nukleosom, składający się z oktameru histonowego- 8 cząsteczek histonowych,

tworzących coś w rodzaju dysku. Oktamer budują 2 cząsteczki H2A, H2B, H3 i H4 (w oktamerze nie

ma histonu H1). Nukleosom tworzy także DNA nawinięty na oktamer, który formuje się w niecałe

dwa obroty. Koresponduje to z długością 146 par zasad. Te dwa składniki tworzą rdzeń nukleosomu.

Oprócz tego w skład nukleosomu wchodzi łącznikowy DNA- DNA znajdujący się pomiędzy rdzeniami

(do około 80 par zasad). W skład nukleosomu wchodzi także histon H1, który znajduje się w

przestrzeni tworzonej przez łącznikowy DNA.

Organizacja nukleosomowa manifestuje się przez tworzenie włókna nukleosomowego. Jego

średnica jest porównywalna do średnicy oktameru i wynosi około 11 nm. Takie włókno chromatyny

zwija się w solenoid- helisę, gdzie 1 skręt tworzy 6-7 nukleosomów. W tej strukturze dyski

oktamerów ułożone są równolegle do osi długiej włókna. Średnica solenoidu wynosi 30 nm. Na jeden

skręt przypada 1200 par zasad (146par zasad x8 plus ok. 80par zasad).

Chromatyna tworzy także struktury wyższych rzędów. Włókno solenoidowe może tworzyć

strukturę pętli, które wyodrębniają odcinek DNA wielkości kilkudziesięciu tysięcy par zasad (ok. 50

tys.). DNA tworzące pętle ma około 300 nm średnicy. Wyższy poziom organizacji to rozety- 6 pętli,

czyli pojemnościowo jest to 6x50 tys. par zasad=300 tys. par zasad. Kolejną jednostką organizacyjną

jest skręt chromatyny, który składa się z 30 rozet, czyli około 300tys. x 30= 9 mln par zasad.

Chromosomy średnio mają około 10 skrętów, zatem występuje około 90 Mbp (90 mln par zasad).

Każda taka struktura ma swoje oddziaływania stabilizujące, w przypadku chromosomu mamy

do czynienia z wiązaniami między DNA i histonami. Histony obdarzone są ładunkiem dodatnim, jako

cząsteczki zasadowe, natomiast DNA ma ładunek ujemny, zatem wiązaniami jonowymi cząsteczki te

łączą się. Strukturę solenoidu stabilizują wiązania między białkami histonowymi. Jeżeli chodzi o pętle,

to u podstawy związane są białkami HMG, a rozety, w centralnej części posiadają białko zwane

kondensyną .

Modyfikacje histonów

Histony są składnikami struktury DNA, nie znaczy to jednak, że nie są one dynamiczne. O

dynamice świadczą różne modyfikacje:

-acetylacja – realizowana jest przez enzymy zwane acetylotransferazami histonowymi (oraz

deacetylazy). Grupy acetylowe dodawane są do lizyn. Acetylcja wpływa na redukcję ładunku

niesionego przez histony i powoduje osłabienie wiązań pomiędzy DNA i histonami. Ten typ

modyfikacji zachodzi w rejonach euchromatyny, czyli chromatyny aktywnej transkrypcyjnie.

-metylacja- grupy metylowe dodawane są do Lizyn i Argninin. Metylacja może być związana z genami

aktywnymi lub nieaktywnymi i zależy od docelowego aminokwasu.

-fosforylacja- grupy fosforanowe dodawane są do tych aminokwasów, które mają wolne grupy

hydroksylowe : treoniny i seryny. Fosforylacja towarzyszy kondensacji chromatyny u komórek

przygotowujących się do mitozy lub mejozy.

Euchromatyna

Heterochromatyna

Luźno upakowana, stopnień maksymalnego
upakowania to pętle solenoidów.

Wyższe stopnie upakowania

Formuje się w tam, gdzie jest wiele genów

Formuje się tam, gdzie genów jest niewiele,
głównie

rejonach

centromerów

terminalnych

(telomery)

oraz

ruchome

fragmenty chromosomów

Geny aktywne, wykazują zmniejszoną metylację
cytozyn w rejonach CpG (cytozyna poprzedzona
guaniną), podwyższona acetylacja histonów,
obecność charakterystycznego wariantu histonu
H2B

Geny

nieaktywne,

podwyższona

metylacja

cytozy, obniżona acetylacja histonów

Przeciwieństwo do heterochromatyny

Może być konstytutywna lub fakultatywna

W jądrze interfazowym upakowana w postaci
pętli o rozmiarach 30nm, które zlokalizowane są
w kompleksie poru jądrowego.

W jądrze interfazowym tworzy struktury
wyższego rzędu niż chromatyna.

Tworzy się tam, gdzie występuje wiele genów

Obszary, gdzie geny nie występują lub jest ich
niewiele, np. okolice centromeru, telomery oraz
bloki sekwencji powtarzalnych.
Heterochromatyna może mieć charakter

konstytutywny (rejon genomu, w którym

heterochromatyna zawsze jest
heterochromatyną, niezależnie od tkanki) lub
fakultatywny (odwrotność )

Rejony transkrybowane aktywnie. Replikacja
zachodzi

najpierw

stosunku

heterochromatyny

Rejony nieaktywne transkrypcyjnie. Replikacja
zachodzi po replikacji euchromatyny

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 7

Sekwencje repetytywne

Podział sekwencji repetytywnych. Mogą być one podzielone na dwie kategorie, które różnicują się ze

względu

sposób

ułożenia

fragmentów

powtarzających

się

względem

siebie.

1. Rozproszone sekwencje repetytywne

2. Tandemowe sekwencje repetytywne

Jeżeli mamy do czynienia z sekwencją repetytywną typu rozproszonego, wtedy jednostka

powtórzenia JP, jest oddalona od innych jednostek powtórzenia np. JP1,JP2, jakimiś innymi

jednostkami. Możemy mieć do czynienia z układem powtórzeń cis, gdzie poszczególne jednostki

znajdują się na jednej cząsteczce DNA lub może zaistnieć sytuacja, że powtórzenie znajdować się

będzie na innym chromosomie.

Druga kategoria to powtórzenia tandemowe, w przypadku których mamy do czynienia jedynie z

układem cis, w którym jednostki JP, JP1 i JP2 leżą bezpośrednio po sobie i nie występują sekwencje

dystansujące jednostki między sobą.

Jeżeli jednostki powtórzenia występują w układzie cis, to mogą mieć orientację zgodną – mówimy

wtedy o powtórzeniach zgodnych(>>>), lub mogą mieć charakter odwrócony (><).

Sekwencje rozproszone

Jakie sekwencje składają się na poszczególne kategorie. Jeżeli chodzi o rozproszone, to dzieli się je na

kolejne dwie podkategorie, które są wyróżnione na podstawie długości jednostki wydłużenia:

-SINE – krótkie sekwencje rozproszone, do około 500 par zasad

-LINE- długie sekwencje , od 500 do kilku tysięcy par zasad.

Pochodzenie sekwencji powtórzonych, restrotranspozycja.

Głównym mechanizmem powstania tego typu sekwencji powtórzonych, jest tzw. retrotranspozycja.

Przedrostek „retro”, odnosi się do angielskiego terminu reverse transcription – odwrotna

transkrypcja. Nie ma to żadnego związku z czasem powstania, mimo że nazwa może sugerować, że

powstały „wcześniej”. U podstaw powstania sekwencji powtórzonych dla retro transpozycji,

znajduje się leżąca w genomie aktywnie transkrybowana sekwencja, np. jakiś gen. Gen ten jest

transkrybowany, przez co tworzone są liczne kopie tego genu w formie RNA. W komórce zdarza się, iż

mamy do czynienia z aktywnościami odwrotnej transkryptazy. Powoduje ona, że niektóre transkrypty

RNA przeprowadzane są w cząsteczkę cDNA. Niewielka frakcja z powstałego cDNA może być

integrowana z powrotem w genomie do kompletnie innego miejsca . Powstaje retro-kopia, możliwa

do zidentyfikowania po tym, że nie występują w niej introny i sekwencje regulatorowe, które

normalnie otaczają wyjściowy gen, nie będący retro-kopią. Im wydajniej jest transkrybowany dany

gen, tym częściej retro-kopie mogą być identyfikowane w genomie.

Sekwencje tandemowe

Sekwencje telomerowe zlokalizowane są terminalnie na chromosomach, Mają one u danego

organizmu zdefiniowaną sekwencje, np. u roślin to TATATAGGG, powtórzone od 2 do 20 tys. razy.

Genezą sekwencji telomerowych: powstają w rezultacie aktywności enzymu telomerazy.

Charakteryzuje się tym, że jest to bardzo zmieniona odwrotna transkryptaza. Enzym ten ma w swojej

strukturze kofaktor RNA i dzięki niemu wie, jakie sekwencje dobudowywać do końców

chromosomów. Zatem kofaktor ten, służy jako matryca do dodawania do końców chromosomów

jednostek powtórzenia w układzie tandemowym.

Po co chromosomom telomery? Rozwiązują one pewien problem z replikacją cząsteczek liniowych.

Replikacja wiąże się z koniecznością zastartowania syntezy. Polimerazy DNA mogą jedynie

dobudowywać nukleotydy do istniejącej nici, nie mogą działać de Novo. Dlatego przy syntezie

enzymy potrzebują zaczątków nowosyntetyzowanych nici. Są nimi startery RNA. W miarę

postępowania cykli replikacji, sekwencje znajdujące się za miejscem przyłączenia ostatniego startera,

mogły by być tracone. W rzeczywistości są one tracone, jednak dzięki obecności telomerów

i aktywności telomerazy, straty dotyczą sekwencji niekodujących. Ich brak nie będzie powodował

występowania dla komórek żadnych znaczących konsekwencji.

Innymi funkcjami chromosomów, jest na przykład zapobieganie fuzji chromosomów, które przy

rozchodzeniu się do przeciwnych biegunów wrzeciona kariokinetycznego mają tendencję do klejenia

się. Poza tym obecność telomerów stabilizuje pozycję chromosomów w jądrze interfazowym,

w którym każdy chromosom zajmuje pewną domenę (chromosomy nie są ułożone bezładnie). O

ułożeniu chromosomów decydują właśnie sekwencje telomerowe, które łączą się z otoczką jądrowa.

Od telomerów zaczyna się też koniugacja chromosomów w czasie repliko-fazy I , pierwszego podziału

mejotycznego.

Mikrosatelity

Sam przedrostek sugeruje, że jednostki powtórzenia są rozmiarów „mikro” – małych, rzędu kilku

nukleotydów. Z reguły występują poza sekwencjami kodującymi , lecz zdarzają się wyjątki i o

obecności takiego powtórzenia w sekwencji kodującej świadczy trakt, tworzony przez konkretną

resztę aminokwasowa. Takie sekwencje mają duże znaczenie praktyczne, ze względu na tzw.

polimorfizm- mikrosatelity są bardzo polimorficzne. Oznacza to, że konkretne osobniki różnią się w

danym locus mikrosatelitarną liczbą powtórzeń. Jeżeli rozważalibyśmy parę chromosomów

homologicznych i znaleźlibyśmy w jednym chromosomie jakieś locus mikrosatelitarne, to bardzo

często okazuje się, że w obrębie tego locus jesteśmy heterozygotami (od ojca otrzymujemy np. 3

powtórzenia, a od matki 4 danej sekwencji).

Sekwencje są w takim sposób polimorficzne, że wybierając z genomu kilka lub kilkanaście takich

sekwencji i określając liczbę powtórzeń w obrębie tych loci, jesteśmy w stanie dokonać identyfikacji

osobnika. Robi się to na zasadzie łańcuchowej reakcji polimerazy- takie locus otacza się starterami i

amplifikuje się, następnie otrzymane produkty rozdziela się w żelu sekwencyjnym z dokładnością do

jednego nukleotydu i można określić liczbę powtórzeń poszczególnych alleli u danego osobnika z

populacji.

Takie technologie wykorzystywane są w analizie sądowej, jeżeli na miejscu zbrodni znajdziemy jakieś

ślady i jest kilka osób podejrzanych. Poprzez amplifikację takich sekwencji , nie jednej, lecz całego

profilu takich sekwencji, jesteśmy w stanie ze wszystkich podejrzanych wybrać sprawcę zbrodni. Inne

zastosowanie to ustalanie ojcostwa.

Minisatelity

Różnią się one od wspomnianych mikrosatelit długością powtarzalnych sekwencji. Mają one od

kilkudziesięciu do kilkuset par zasad. Minisatelity składają się na szereg segmentów hetero

chromatynowych w genomie.

rDNA

Kolejna kategoria sekwencji powtórzeniowych, to takie odcinki DNA, które kodują rybosomalne RNA.

Te odcinki rybosomalnego RNA charakteryzują się tym w odróżnieniu od innych RNA, że potrzebne są

komórce w bardzo dużych ilościach. W komórce panuje bardzo duże zapotrzebowanie na

rybosomalne RNA. Przyroda rozwiązała to w ten sposób, że pomnożyła liczbę kopii genów kodujących

rybosomalne RNA.

*Nie tylko sekwencje niekodujące mogą mieć charakter repetytywny. Również nukleotydy

występujące w mitochondriach, histony, białka zapasowe u roślin oraz podjednostki Rubisco.

Replikacja

Replikacja oznacza formowanie replik, w tym przypadku mówimy o replikach cząsteczki DNA. Kiedy

poznano strukturę DNA, rozważano jak to się dzieje, że cząsteczki DNA się powielają i powtarzają

swoją sekwencję z pokolenia na pokolenie. Powstało kilka modeli: model konserwatywny

(zachowawczy), model dyspersyjny (rozproszony) i semikonserwatywny. Jeżeli chodzi o model

konserwatywny, to jego zachowawczość polegała na tym, że w toku replikacji powstaje cząsteczka

potomna i odtworzona jest (zachowana) cząsteczka złożona z nici rodzicielskich, czyli tych które nie

zawierają nowych nukleotydów. Model semikonserwatywny, zakłada że po replikacji mamy do

czynienia z dwoma cząsteczkami o charakterze hybrydowym: to znaczy, że złożone są z jednej nici

zachowanej- rodzicielskie i jednej nowo zsyntetyzowanej. Model dyspersyjny zakładał, że nowo

syntetyzowane segmenty nici są rozproszone pomiędzy segmentami powstałymi wcześniej, w

poprzednim cyklu replikacyjnym. Nici obydwóch cząsteczek są więc mozaiką cząsteczek nowo- i

poprzednio zsyntetyzowanych. Okazało się, że w przyrodzie występuje model półkonserwatywny.

Model semi-konserwatywny

Na początku należy odwołać się jednak do samego zdarzenia syntezy- inkorporacji nukleotydów, czyli

o mechanizmie całego procesu. Do syntezy potrzebujemy substraty, czyli 4 nukleotydy w formie

fosforanowej, matrycy oraz zaczątku nowosyntetyzowanej nici- startera. Reakcję katalizuje

polimeraza DNA. Jak wygląda inkorporacja nukleotydów? Musimy dysponować nicią matrycową oraz

drugą nicią, która jest wydłużana, poprzez dobudowywanie nukleotydów w formie fosforanowej

(gdzie poszczególne grupy fosforanowe oznaczane kolejnymi literami alfabetu greckiego). Synteza

polega na ataku grupy Alfa-fosforanowej na grupę 3’hydroksylową rozbudowywanej nici. Jest to tak

zwany atak nukleofilowy. W rezultacie tego ataku powstaje wiązanie 3’-5’, bo węgiel 3’poprzedniego

nukleotydu, wiąże się z węglem 5’ następnego i odszczepiona zostaje grupa pirofosforanowa. Kilka

zjawisk przesuwa równowagę reakcji na korzyść syntezy: po pierwsza jest to oddziaływanie

nowodobudowywanego nukleotydu z komplementarnym nukleotydem w obrębie nici matrycowej.

Oprócz tego nowodobudowywany nukleotyd oddziaływuje wiązanimi hydrofobowymi z poprzednim

nukleotydem, konkretnie oddziaływanie pomiędzy zasadami azotowymi. Sprzyja temu fakt, że zasady

mają charakter cząsteczek płaskich i bocznymi powierzchniami mogą zawiązywać wiązania. Kolejnym

czynnikiem jest odłączanie pirofosforanu, który zaraz po odłączeniu ulega działaniu pirofosfatazy i

przekształceniu do ortofosforanu. To wszystko sprawia, że synteza postępuje.

Miejsce w DNA, w którym dochodzi o startu replikacji określamy mianem widełek replikacyjnych.

Widełki powstają przez separację nici matrycy. Należy zwrócić uwagę, że synteza na poszczególnych

niciach zachodzi w inny sposób. Na jednej z nich zachodzi w sposób ciągły, poprzez ciągłe

rozbudowywanie jednego odcinka, na drugiej zaś w sposób nieciągły, tzn., że syntetyzowane są

kawałki nici, które potem łączone są w jedną całość. Taki kawałki określamy jako fragmenty Okazaki.

Nić, która powstaje w sposób ciągły nazywa się linią prowadzącą (leading), natomiast nić

syntetyzowana nieciągle nazywana jest nicią opóźnioną.

Z czego wynika fakt, że nici charakteryzują się asymetrią syntezy? Synteza nie przebiega jednakowo

na obu niciach, a ma to źródło w trzech faktach:

Fakt nr 1: konstrukcja podwójnej helisy DNA sprawia, że każda z nici jest odwrotnie usytuowana

(koniec 5’ jednej spotyka się z końcem 3’ drugiej i na odwrót).

Fakt nr 2: sposób działania polimerazy DNA, która syntetyzuje nic zawsze w jednym kierunku od

końca 5’ do 3’, poprzez rozbudowywanie końca 3’.

Fakt 3: konstrukcja widełek replikacyjnych, a właściwie kierunek migracji widełek. Nie są one

statyczne, przemieszczają się. Aby nić mogła być syntetyzowana musi nastąpić rozplecenie helisy,

każdemu rozpleceniu towarzyszyć będzie goniąca je replikacja. Dlatego, żeby nastąpiła pełna

replikacja, układ widełek replikacyjnych musi się przesuwać, aby następowała separacja nici. Dlatego

właśnie synteza nici wiodącej następuje wraz z postępem widełek, natomiast synteza nici opóźnionej

przeciwnie do migracji.

Należy zwrócić także uwagę na to, że fragment syntetyzowanej nici opóźnionej rozpoczyna się

starterem RNA, dlatego dochodzimy tu do pewnego paradoksu: żeby syntetyzować DNA, musimy już

to DNA mieć. Musimy dysponować zaczątkiem nowosyntetyzowanej nici. Jak do się dzieje, że takie

zaczątki są dostarczane? Przypomnijmy sobie, że w PCRze zaczątki nici dostarczane są poprzez

dodanie starterów do mieszaniny reakcyjnej. W komórkach, takich starterów nie ma kto dodać, więc

są one syntetyzowane przez specjalne enzymy, które same nie wymagają starterów: polimerazy RNA.

Zatem in vivo za rozpoczęcie syntezy DNA odpowiadają enzymy posiadające zdolności polimerazy

RNA, czyli tzw prymaty. Synteza fragmentu Okazaki rozpoczyna się od syntezy startera RNA poprzez

prymazę. Startery są następnie wycinane i zastępowane fragmentami DNA. Długość starterów to

około 30 nukleotydów. Poznaliśmy dzięki temu jeden z enzymów, który działa w obrębie widełek

replikacyjnych - prymazę. Niezbędnymi enzymami są także helikazy, które odpowiedzialne są za

separację nici DNA, na koszt ATP. Stan rozwinięcia DNA, jako niekorzystny energetycznie musi być

stabilizowany poprzez związanie z białkami zwanymi SSB - single strended DNA-binding proteins.

Stan ten jest niekorzystny dlatego, że zasady azotowe, które mają charaktery wybitnie hydrofobowy

są eksponowane do środowiska hydrofilowego. Normalnie, w podwójnej helisie, która jest pewnego

rodzaju prętem, tworzone jest mikrośrodowisko: wewnętrzne, w środku hydrofobowe, za co

odpowiadają zasady azotowe, a z zewnątrz hydrofilowe, co zależy od szkieletu cukrowo-

fosforanowego. Jest to sytuacja komfortowa termodynamicznie. Natomiast w stanie rozwinięcia

istnieje tendencja do powtórnego łączenia się nici ze sobą i żeby to łączenie nie zachodziło, stan

jednoniciowości jest stabilizowany wiązaniem białek SSB. Separacja nici w obrębie migrujących

widełek replikacyjnych powoduje napięcia torsyjne. Przed widełkami formują się struktury

superzwinięte, dlatego że, albo cząsteczka ma unieruchomione końce, jak w przypadku cząsteczki

kolistej albo ma unieruchomione końce, dzięki temu że pewna domena tej cząsteczki jest spięta

strukturami białkowymi w postaci pętli. W takiej cząsteczce liczba opleceń jest stała. Jeżeli w takiej

cząsteczce zmienimy liczbę skrętów (w separacji nici, liczba skrętów jest ewidentnie zmieniona), to

musi to znaleźć odzwierciedlenie, czy kompensację, w formowanych superzwojach, aby liczba

zwojów pozostała taka sama dla całej cząsteczki. Figurujące widełki replikacyjne powodują, że z

przodu widełek powstają superzwoje. Gdyby nie były one neutralizowane, relaksowane, to

naprężenie cząsteczki byłoby tak duże, że dalszy postęp replikacji nie byłby możliwy. Za relaksację

odpowiadają enzymy zwane topoizomerazami. Topoizomerazy działają w ten sposób, iż dokonują

nacięcia w obrębie jednej nici podwójnej helisy DNA. Jeden koniec tego nacięcia zostaje związany,

natomiast drugi koniec może oddać energię superzwoju poprzez rotacje. Efektem jest przejście z

formy superzwiniętej do formy zrelaksowanej. Dokładniej rzecz ujmując enzym działa najpierw, jak

endonukleaza, czyli formuje Nick- nacięcie w podwójnej helisie, z jednym końcem tego nacięcia

pozostaje enzym związany wiązaniem fosfotyrozynowym (łączy się przez resztę tyrozyny z końcem

3’), natomiast drugi koniec oddaje energię poprzez rotację. Po tym etapie rotacji enzym manifestuje

kolejne oblicze- tym razem działa jak ligaza- z powrotem zakleja Nick, i w ten sposób superzwienięcie

jest eliminowane.

Centralne enzymy replikacji – polimerazy DNA

U bakterii centralnych enzymów replikacji w postaci polimeraz jest 3: polimeraza I, polimeraza II oraz

polimeraza III.

Przede wszystkim, każda z polimeraz kodowana jest przez inne geny i posiada inną strukturę, czego

wyrazem jest choćby różny ciężar cząsteczkowy. Istotniejsze jest jednak to, że różnią się one

aktywnościami enzymatycznymi. Tak naprawdę są to nie tylko polimerazy DNA, oczywiście każda z

nich ma tą statutową aktywność, czyli dobudowują nukleotydy do końca 3’ nowosyntetyzowanej

nici, lecz mogą mieć one także właściwości egzonukleolityczne (egzonukleazy 3’

5’ i 5’3’) o

obydwu orientacjach. Egzonukleaza wytrawia, degraduje cząsteczkę kwasu nukleinowego od jego

końca i może to czynić albo od końca 3’ (3’

5’) lub 5’ (5’3’). Enzym polimeraza I posiada wszystkie

wymienione wyżej aktywności, bo ma oczywiście aktywność polimerazową, ale także obydwie

aktywności egzonukleolityczne.

Zastanówmy się teraz, do czego te aktywności są mu potrzebne. W czasie syntezy nici opóźnionej,

mamy nić rodzicielską i nić nowosyntetyzowaną, potomną. Przyglądając się widełkom replikacyjnym

bliżej, możemy mieć do czynienia z dwoma fragmentami Okazaki (wcześniej i później syntetyzowany).

Takie fragmenty oddziela w pewnym momencie, w miarę postępującej syntezy, tylko Nick- nacięcie.

Oznacza to, że w tym miejscu nie brakuje nukleotydów. Jeżeli tych nukleotydów brakuje, to o taki

miejscu mówimy gap- luka. Te dwa terminy są przeciwstawne. Jeżeli mamy do czynienia tylko z

nickiem, aktywność będzie wykazywać tylko polimeraza I- koniec 3’poprzedniego fragmentu Okazaki

traktuje jako miejsce primingu- miejsce startera i go następnie rozbudowuje, aktywnością polimerazy

5’

3’. W pewnym momencie enzymowi temu zaczyna przeszkadzać kolejny fragment Okazaki.

Enzym w tej sytuacji objawia swoją aktywność egzonukleazy 5’

3’; występuje rozbudowywany

koniec 3’ oraz koniec 5’ startera RNA i enzym polimeraza I starter ten wytrawia działalnością

egzonukleazy 5’

3’. Na miejsce tego wytrawionego startera RNA, symultanicznie dobudowuje

fragment DNA. W ten sposób starter jest zastępowany. W pewnym momencie starter wytrawiony

jest już całkowicie, enzym dochodzi do kolejnego fragmentu Okazaki i tu kończy swoją działalność i w

tym momencie ten przesunięty Nick, jest likwidowany działalności ligazy. Podsumowując ligaza DNA

nadaje ciągłość nici opóźnionej. Polimeraza I posiada jeszcze jedną aktywność, mianowicie

egzonukleazy 3’

5’. Ta aktywność nazywana jest aktywnością korekcyjną. Służy ona do naprawy

błędnie inkorporowanych, wstawianych nukleotydów. Z jakąś częstością pod matrycę podstawia się

nukleotyd niezgodny z tym, co matryca dyktuje, jest to nukleotyd niekomplementarny. On może

zostać w obrębie rosnącej nici. W takich sytuacjach enzym, który ma aktywność egzonukleazy 3’

5’

zatrzymuje się w swojej syntezie i wycina nowowstawiony, błędny nukleotyd. Dzięki temu,

frekwencja błędów jest w czasie replikacji stosunkowo niska i wynosi np. u bakterii 10

-9

, oznacza to,

że tylko 1 na 10

nukleotydów inkorporowany jest błędnie i jest źródłem mutacji. Polimeraza może

także działać w systemie naprawy DNA i działa tam polimeraza II o aktywności egzo3’

5’. Za

właściwe funkcje replikacyjne odpowiada polimeraza III. Ona także posiada aktywność korekcyjną

egzo3’

5’. Polimeraza III realizuje syntezę replikacyją w postacie dimerów. Jedna z podjednostek

obsługuje syntezę nici wiodącej(synteza postępuje za widełkami replikacyjnymi). Jeżeli chodzi zaś o

drugą podjednostkę polimerazy III, to sytuacja jest bardziej skomplikowana. Nić, którą obsługuje

jednostka druga, jest wypętlona wokół podjednostki. Takie wypętlenie sprawia, że kierunek syntezy

na nici opóźnionej jest lokalnie zgodny z kierunkiem ruchu widełek. Jest to konieczne, ponieważ

podjednostki połączone są ze sobą w jedną całość, wobec tego musza migrować razem za widełkami.

Z tego wynika kolejny fakt: wypętanie się przesuwa.

Podsumowując działanie enzymów, można po kolei powiedzieć, że najpierw działa prymaza, która

syntetyzuje starter, działając w kompleksie zwanym prymosomem, potem następuje działanie

kolejno polimerazy III i polimerazy I, przy eliminacji starterów i zastępowaniu ich przez fragmenty

DNA. Wcześniej działa też helikaza rozplatająca nici, białka SSB, które stabilizują stan rozwinięcia oraz

topoizomerazy przed widełkami, które niwelują superzwoje. Występuje też ligaza DNA, która łączy

powstałe fragmenty Okazaki, nadając ciągłości nici opóźnionej.

Jeżeli chodzi o eukarionty, to enzymów o aktywności polimerazy DNA jest o wiele więcej. Zostały one

oznaczone literami alfabetu greckiego. Funkcje replikacyjne pełnią różne enzymy: nić opóźnioną

obsługuje enzym alfa, natomiast nić wiodącą enzym delta. Oprócz enzymów działających przy

replikacji i naprawie DNA jądrowego, występują również u eukariontów enzymy funkcjonujące w

organellach autonomicznych, czyli posiadających własne DNA. W przypadku zwierząt są to

mitochondria, zaś u roślin są to mitochondria i plastydy, które również posiadają własne polimerazy

DNA.

Kontrola replikacji

Replikacja zajmuje określony etap cyklu komórkowego w fazie S. Po fazie S następuje faza G2, która

oddziela fazę S od mitozy. Co decyduje o tym, że należy ropocząć fazę syntezy. Decyduje o tym

powstanie tzw. S-phase promoting factor- czynnika promującego fazę S. Czynnik ten jest kompleksem

dwóch kategorii białek: cyklin i kinaz zależnych od cyklin. Cykliny, które kumulują się w komórce w

zależności od określonych czynników, łącząc się z kinazami (w kategorii cdk) , sprawiają, że kinazy

zyskują aktywność, która polega na fosforylacji białek docelowych i ta fosforylacja powoduje kaskadę

zdarzeń prowadzących do syntezy DNA. U bakterii dla kontroli procesu replikacji najważniejsza jest

replikacja. Inicjacja zachodzi w miejscu zwanym Ori- miejsce początku procesu replikacji. W

przypadku chromosomu E. coli , to ori, nosi miano Ori C- konkretny locus w chromosomie. Ori C

formują jednostki powtórzenia- sekwencje repetytywne, które występują w dwóch kategoriach: 3

powtórzenia 13-sto nukleotydowe i 4 powtórzenia 9-cio nukleotydowe. Powtórzenia 13-sto

nukleotydowe są AT-bogate (bogate są w adeninę i tyminę), zaś całość tego odcinka to 245 par

zasad, czyli stosunkowo niewiele. Ori C funkcjonuje następująco: pierwszy etap to formowanie w

obrębie tego Ori kompleksu białek, które są produktem genu DNA A, te białka łączą się z ori

powtórzeniem 9-cio nukleotydowym. Ten kompleks sprawia, że owija się wokół niego podwójna

helisa- indukowane jest super zwinięcie podwójnej helisy na kompleksie. Powstanie superzwinięcia,

to próba zmiany liczby opleceń, dlatego musi zajść proces, który kompensuje tą zmianę, poprzez

zmianę skrętności. Zmiana liczby skrętów polega na rozkręceniu podwójnej helisy w obrębie

powtórzeń 13-sto nukleotydowych. Powstaje tzw. Kompleks otwarty, do którego wędruje kompleks

białek DNA C i DNA B, z których B, to helikaza. Helikaza, nie tyle podtrzymuje, co aktywnie promuje

stan separacji nici, poprzez rozwijanie kolejnych partii podwójnej helisy DNA, w chromosomie

bakterii(czyli rozszerzanie widełek w przeciwnych kierunkach). W rezultacie działania helikazy, tworzy

się oczko replikacyjne, do którego wchodzi białko DNA G, czyli prymaza, która syntetyzuje startery

RNA.

Co potrzebne jest do rozpoczęcia replikacji?

Skąd bakterie wiedzą, kiedy rozpocząć kolejną rundę replikacji ? Do zainicjowania tego procesu

potrzebne są:

odpowiednio

wysoki

poziom

akumulacji

białka

DNA

(białko

inicjujące),

2) musi wystąpić odpowiedni poziom metylacji Ori C. W komórkach Escherichii wystepuję tzw.

Metylaza DAM, które metyluje nukleotydy adeninowe w konkretnym kontekście: w obrębie

sekwencji GATC. Tylko w pełni zmetylowane Ori C jest w stanie zainicjować replikację, a do tego

potrzeba czasu. Po replikacji mamy do czynienia z hetero dupleksami nici rodzicielskiej i nici

syntetyzowanej. Nic rodzicielska będzie zmetylowana, zaś nić nowosyntetyzowana początkowo nie

jest zmetylowana. Taki status określamy jako hemi-metylację.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 8

Kontrola pozytywna i negatywna procesu replikacji.

U eukariontów replikacja zachodzi w fazie S cyklu komórkowego, gdzie do przejścia w fazę S

potrzebny jest czynnik promujący fazę S, który utworzony jest z cyklin oraz kinaz zależnych od cyklin.

W kontroli replikacji eukariontów występuje zarówno kontrola pozytywna, jak i negatywna.

Kontrola pozytywna polega na tym, że dany proces nie jest uruchamiany do momentu włączenia go

przez odpowiedni czynnik, który możemy określić mianem aktywatora. Stanem domyślnym zatem

jest stan „off”- wyłączenia i dopiero pojawienie się czynnika powoduje zmianę stanu na „on”-

włączenie.

Jeżeli chodzi o kontrolę pozytywną, to do podjęcia replikacji, do miejsc początku replikacji w

chromosomach eukariotycznych, muszą przyłączyć się białka kompleksu rozpoznania Ori. Oprócz

białek tego kompleksu, potrzebne są także licensing facotrs- czynniki licencjonujące, które

akumulowane są w fazę G1, która poprzedza fazę syntezy S. Białka te to: Cdc6 oraz Cdc1. Potrzebne

są one dla pokrycia DNA przez białka NCS, które również są licensing factors. Po rozpoczęciu replikacji

białka te opuszczają rejon widełek replikacyjnych .

Kontrolą negatywną będziemy określać taką kontrolę, w której domyślnym stanem, jest stan „on”-

włączenia. Proces domyślny zachodzi, chyba że zostaje wyhamowany przez czynnik hamując, który

możemy nazwać represorami.

Bardzo często układ kontrolowany jest zarówno pozytywnie i negatywnie, co pozwala na łatwiejsze i

szybsze dostosowanie się go, do zachodzących wokół niego zmian. Jądro komórkowe w fazie G2

zawiera genilinę, która umożliwia pokrycie nowosyntetyzowanego DNA białkami MCM. Po

zakończeniu syntezy genilina jest degradowana, dlatego DNA w komórkach potomnych będzie zdolne

do odpowiedzi na obecność licensing factors, a tym samy do podjęcia replikacji w fazie S.

Przepływ informacji genetycznej w komórce: transkrypcja.

Transkrypcja - określenie odnosi się do przepisywania informacji genetycznej z cząsteczki DNA na

RNA. Może zachodzić także proces odwrotny, czyli odwrotna transkrypcja – przepisania informacji z

RNA na DNA. Ten proces dosyć rzadko zachodzi w środowisku naturalnym, wykorzystują go niektóre

wirusy. Znajduje także zastosowanie w praktyce laboratoryjnej do otrzymywanie cDNA.

Transkrypcja u bakterii

Do rozpoczęcia transkrypcji potrzebne jest rozplecenie podwójnej helisy DNA i utworzenie tzw. bąbla

transkrypcyjnego. W transkrybowanym DNA mamy do czynienia z nicią kodującą i nicią matrycową.

Nic matrycowa, to ta nić , która będzie pozostawała w dupleksie z tworzącą się nicią RNA. Jest

łańcuch polinukleotydowy, na którym budowana jest cząsteczka RNA- ta nić będzie dosłownie

matrycą dla syntezy RNA. Natomiast pod względem sekwencyjnym, cząsteczce RNA odpowiada

druga nić, za wyjątkiem par zasad T-U. ( Z reguły w bazach danych podawany jest rekord

odpowiadający sekwencji z nici kodującej, jednak naprawdę transkrybowana jest nić przeciwna).

Polimeraza RNA

Escherichia posiada jeden taki enzym. Ten enzym tworzą dwie podjednostki Alfa, Beta, Beta’ i czynnik

Sigma. Funkcje poszczególnych podjednostek są następujące: podjednostki Alfa odpowiadają za

złożenie w całość cząsteczki polimerazy, mają też znaczenie w rozpoznawaniu promotorów i mogą

wiązać się z czynnikami aktywującymi transkrypcję. Podjednostki Beta i Beta’ tworzą centrum

katalityczne enzymu, przy czym Beta to ta podjednostka, która wiąże substraty. Czynnik Sigma

zapewnia specyficzność rozpoznania promotora. W komórce promotorów (promotor- miejsce, gdzie

przyłącza się polimeraza RNA w czasie rozpoczynania procesu transkrypcji) jest wiele i o tym jaki

promotor zostanie rozpoznany i jaki gen zostanie poddany transkrypcji, decyduje właśnie czynnik

Sigma. Występują różne czynniki Sigma dla różnych promotorów, a przez to dla różnych genów.

Większość genów rozpoznaje czynnik zwany Sigma

. Taką postać enzymu, zbudowaną z wszystkich

tych jednostek określamy mianem holoenzymu. Jeżeli od tego holoenzymu odejmiemy czynnik

Sigma, otrzymamy rdzeń, czyli dwie podjednostki Alfa, Beta, Beta’. Holoenzym jest potrzebny do

inicjacji transkrypcji. W momencie, kiedy proces ten zostanie zapoczątkowany, czynnik Sigma jest

uwalniany i reakcji bierze udział już tylko część rdzeniowa.

Promotory

Promotor jest to miejsce, do którego przyłącza się polimeraza RNA, rozpoczynająca proces

transkrypcji. Jeśli chodzi o elementy promotora to mamy dwa konserwatywne bloki: -10 i -35. Skąd

wiemy, że są one konserwatywne? Jeżeli zestawiamy ze sobą wiele promotorów, to okaże się, że w

wielu z nich te sekwencje są do siebie podobne. Pozostałe miejsca mają mniejsze znaczenie w sensie

zawartości sekwencyjnej. Skąd biorą się oznaczenia -10 i -35? Przyjęta jest konwencja, w myśl której

pierwszy transkrybowany nukleotyd matrycy dostaje numer +1. Wszystko co jest downstream w

stosunku do nukleotydu +1 , czyli coś co znajduje się za tym nukleotydem, dostaje numer dodatni.

Wszystko w kierunku upstream , czyli przed nukleotydem +1 otrzymuje numerację ujemną. Pozostaje

jeszcze zdefiniowanie pojęć upstream i downstream. Za downstream uważa się kierunek zgodny z

kierunkiem transkrypcji, czyli z prądem. Upstream oznacza pod prąd transkrypcji. Pozostają jeszcze

sekwencje, które przylegają do konserwatywnych bloków -10 i -35. Sekwencja nukleotydowa w tym

znaczeniu nie jest istotna, znaczenie ma ich długość. Powinny one mieć od kilku do kilkunastu

nukleotydów.

Funkcje -10 i -35

Blok -35 wiąże jako pierwszy polimerazę RNA. Segment -10 umożliwia przejście kompleksu w stan

„otwarty”. Za różnicowanie promotorów odpowiedzialny jest fragment zwany dyskryminatorem.

Stadia transkrypcji:

-inicjacja

-elongacja

-terminacja.

Inicjacja

Jest to pierwszy etap transkrypcji – etap wiązania enzymu, a konkretnie holoenzymu z sekwencją

promotorową, gdzie tworzy się tak zwany kompleks zamknięty. On przechodzi w kompleks otwarty,

który charakteryzuje się tym, że występuje w obrębie promotora, rozpoczynająca się od sekwencji

-10 separacja podwójnej helisy DNA (inaczej: topnienie). W tym kompleksie otwartym pojawiają się

tak zwane transkrypty poronne, których synteza jest przerywana zaraz po jej zapoczątkowaniu. Po

oddysocjowaniu czynnika Sigma rozpoczyna się właściwa synteza docelowego transkryptu.

Chemia procesu zbliżona jest do chemii replikacji. Kierunek syntezy transkryptu jest taki sam 5’

3’

poprzez dobudowywanie nowych nukleotydów do końca 3’. Grupa 3’-hydroksylowa atakuje grypę

alfa-fosforanową nowowprowadzanego nukleotydu i w rezultacie powstanie wiązanie 3’-5’. Energia

czerpana jest z rozkładu trójfosforanu do monofosforanu. Następnie zachodzi transkrypcja,

zazwyczaj w tempie około 40 nukleotydów na sekundę, aż do momentu terminacji.

Terminacja może zachodzić według dwóch mechanizmów:

1) mechanizm Rho-niezależny

2)mechanizm Rho-zależny

Terminacja Rho- niezależna

Przy końcu 3’ transkryptu znajdują się odwrócone powtórzenia, które mogą formować strukturę II-

rzędową stem-loop , czyli łodygi-pętli. Jeżeli prześledzilibyśmy proces transkrypcji, to on stopniowo

postępuje, a kiedy pojawią się odwrócone powtórzenia sekwencji, to tworzą się struktury stem-loop.

Jest ona tym stabilniejsza, im tą cześć „łodygową” formują pary G-C, jest wtedy bardzo

termodynamiczne stabilna. Pojawienie się przy końcu 3’ takiego ugrupowanie powoduje

rozdysocjowanie całego komplesu: transkrypt-matryca-polimeraza.

Terminacja Rho- zależna

W tym modelu terminacji wymagana jest obecność białka Rho, występującego w formie heksameru.

Wiąże się ono z RNA na końcu 3’ transkryptu w miejscu zwanym Root. Obrazowo rzecz ujmując,

mamy matrycę, cząsteczkę polimerazy RNA, rosnący transkrypt, który rośnie, aż w pewnym

momencie następuje przywiązanie białka Rho w formie heksameru. Ta cząsteczka białka Rho porusza

się po RNA, w pewnym momencie doganiając enzym i w ten sposób indukuje terminację, poprzez

rozdysocjowanie wyżej opisanego kompleksu.

Kontrola transkrypcji

Opisując kontrolę transkrypcji można powiedzieć, że jest identyczna jak w przypadku replikacji.

Mamy do czynienia z kontrolą negatywną, wtedy geny są włączone, domyślnie działają i są

transkrybowane. Chyba że do DNA wiąże się białko regulatorowe, wtedy dopiero dochodzi do

wyłączenia tego procesu. Przeciwnie do tego rodzaju regulacji, jest regulacja pozytywna, wtedy

domyślny jest stan wyłączenia.

Regulacja transkrypcji – operon laktozowy

Regulacja procesu transkrypcji, u bakterii powiązana jest z organizacją genów- mianowicie większość

genów zorganizowana jest w tzw. operony. Klasycznym przykładem operonu jest operon laktozowy.

Jest to tak zwany operator kataboliczny, czyli gen znajdujący się w obrębie tego operonu, tzw. gen

struktury, koduje białka związane z rozkładem, czyli z katabolizmem laktozy. Sekwencja tego operonu

jest następującą, idąc od końca 3’: sekwencja Lack Y, Lack Z i Lack O- geny stuktury. Pierwszy z nich,

Lack Z, został opisany w czasie poznawania struktury wektora plazmidowego, wykorzystywany jako

marker, który pozwala odróżnić klony rekombinantowe od nierekombinantowych- w klonowaniu,

przy standardowych wektorach otrzymujemy zróżnicowane kolonie barwne: białe i kremowe-

rekombinanty i niebieskie – nierekombinanty. To rozróżnienie jest możliwe dzięki temu, że w obręb

wektorów plazmidowych, wkomponowana jest sekwencja Lack Z.

Zapoznajmy się teraz z funkcjonowaniem takiej struktury genów. Upstream w kierunku od nich, czyli

powyżej, czyli idąc w przeciwnym kierunku niż transkrypcja, mamy sekwencję Lack O- operatora. Jest

to sekwencja natury regulatorowej, która sama w sobie nie koduje białka, ale ma wpływ na

transkrypcję operonu. Dalej mamy sekwencję promotora P, która będzie kodowała polimerazę,

następnie jest odcinek DNA, który nie spełnia żadnej konkretnej funkcji oraz sekwencja I, kodująca

gen Lack I – represor, kolejne białko regulatorowe. Transkrypcja tego genu ma charakter

konstytutywny, co oznacza ze jest ona przeprowadzana na stałym poziomie i na sekwencję

transkrypcji tej sekwencji nie mają wpływu inne czynniki. Należy rozważyć jak ten system

funkcjonuje- jest to uzależnione od podaży laktozy w komórce. Laktozę określa się mianem

induktora. Pierwszy przypadek opisuje nam sytuację, gdy występuje brak laktozy. Wtedy białko

represorowe, wykazuje duże powinowactwo do sekwencji operonowej. Jakie to ma konsekwencje dla

transkrypcji- polimeraza RNA przyłączając się do sekwencji promotorowej, chociaż by chciała, nie

może przejść na teren genów struktury i przeprowadzić transkrypcji. Wiązanie operatora z

represorem blokuje ten proces. W rezultacie RNA nie powstaje i nie powstają białka. Może się

zdarzyć, że dostarczymy do środowiska laktozę. Białko reprsorowe ma też zdolność wiązania laktozy.

Jeżeli ją wiąże, to wpływa ona konformację białka i traci zdolność wiązania się z represorem i

polimeraza może przejść do transkrypcji. Formuje ona długi transkrypt, zwany policistronowym, czyli

transkrypt zawierający sekwencję wszystkich genów operonu. Na podstawie takiego transkryptu

będą formowane odpowiednie białka.

Operon laktozowy, podlega także nadrzędnemu systemowi regulacyjnemu, zwanego represją

kataboliczną. Jest to system regulatorowy, który może kierować i zarządzać wieloma operonami

katabolicznymi, w tym przypadku laktozowym. Jest to system, który faworyzuje wykorzystanie

glukozy w charakterze źródła węgla- surowca dla bakterii. Działa w ten sposób, że glukoza, z poziomu

fizjologicznego, działa hamująco na ekspresję operonów katabolicznych, w tym laktozowego. Jest to

realizowane w następujący sposób: regulacja nadrzędna, zwana represją kataboliczna, wykorzystuje

dwa elementy: cyklicznego AMP (cAMP), cykliczny dlatego, ze węgle 5’ o 3’ są połączone przez grupy

fosforanowe , oraz białko CRP. Status tego systemu zależy od podaży glukozy. Jeżeli glukoza jest w

środowisku, wtedy nie zachodzi synteza cAMP, nie łączy się i nie oddziałuje wtedy z białkiem CPR i w

rezultacie kompleks cAMP-CRP nie działa aktywująca na transkrypcję operonów katabolicznych.

Natomiast w momencie, gdy glukoza się wyczerpie, wtedy pewien enzym prowadzi syntezę

cyklicznego AMP, który wiąże się do CRP, aktywując go i wtedy taki kompleks przyłącza się do

rejonów promotorowych, działając aktywująco na transkrypcję. Do wydajnej transkrypcji operonu

laktozowego, potrzebne są wydajne warunki fizjologiczne: po pierwsze potrzebny jest brak glukozy,

wtedy jest przyzwolenie z poziomu nadrzędnego, a po drugie to obecność laktozy, co spełnia

wymagania dla poziomu lokalnego, dla poziomu operonu. Wtedy transkrypcja zachodzi na wysokim

poziomie. Jeżeli mamy do czynienia z obecnością obydwu cukrów (laktozy i glukozy) występuje

sprzeczność w statusie obydwóch systemów regulacyjnych, bo mamy przyzwolenie z punktu

widzenia systemu lokalnego – operonowego, bo ten system wtedy pozwala na transkrypcję, lecz nie

mamy przyzwolenia na jej rozpoczęcie, bo ten system nie aktywuje transkrypcji (RNA powstaje, lecz

jest go bardzo niewiele!).

Operon tryptofanowy

Podstawowa różnica pomiędzy operonem tryptofanowym a laktozowym jest taka, że jest to operon

anaboliczny, tzn. enzymy kodowane przez geny struktury, biorą udział w biosyntezie (???). Jak

wygląda regulacja tego operonu: regulacja ta może zachodzić pod wpływem białek regulatorowych,

które są produktem genu trpR. Należy zastanowić się, jak ten system zachowuje się w sytuacji, gdy

obecny jest czynnik decydujący o statusie tego operonu, czyli tryptofan. Jeżeli mamy do czynienia z

obecnością tryptofanu, to łączy się on z białkiem represorowy, tworząc aktywny represor. Białko

represpresorowe, samo w sobie jest nieaktywne- jest aporepresorem i wymaga do działa liganda,

który, jest tryptofan, by uaktywnić swą czynność. Przy dużej podaży tryptofanu zatem, łączy się on z

produktem białka trpR – represorem, ten zaś przyłącza się w regionie promotorowo-operatorowym

tego operonu i hamuje jego transkrypcję. Jest to logiczne, dlatego, że jeżeli mamy w komórce dużo

tryptofanu to nie ma potrzeby transkrypcji genu kodującego jego syntezę. Konsekwentnie jeżeli

podaż tryptofanu spada, to pojawiają się cząsteczki represora pozbawione ligandu, czyli nieaktywne,

niezdolne do hamowania transkrypcji, która zostaje wtedy uruchomiona. Pojawia się transkrypt,

który

rezultacie

prowadzi

powstania

specyficznego

szlaku

syntezy.

Nie jest to jednak jedyny sposób regulowania pracy tego operonu. Może być regulowany także przez

tzw. atenuację. Co to takiego? Atenuacja, to dosłownie osłabianie, w tym przypadku osłabianie przez

przedwczesną terminację transkrypcji. Jak dochodzi do ateunacji? Mając odcinek promotorowo-

operatorowy, następnie pierwszy gen struktury i kolejny i sekwencja liderowa znajduje się pomiędzy

odcinkiem promotoro-operatorowym a pierwszym genem struktury. Ma ona 160 par zasad, w tym

regionie występują 4 podregiony. Co ciekawe, te podregiony na poziomie RNA, mogą formować

struktury drugorzędowe- łodygi i pętli (na zasadzie: pierwszy-drugi, drugi-trzeci, trzeci-czwarty). Jeżeli

utworzy się spinka 3-4, to mamy do czynienia właśnie z ateunacją, czyli przedwczesną terminacją

transkrypcji. Te struktury tworzą się po procesie transkrypcji na poziomie RNA. Jak to zachodzi? Do

zrozumienia tego procesu, trzeba uzmysłowić sobie, iż u bakterii procesy transkrypcji i translacji nie

są rozdzielone przestrzennie i czasowo- tzn. jeszcze przed zakończeniem syntezy mRNA, to mRNA do

końca 5’ może przyłączyć rybosom, który będzie realizować translację. Zjawisko translacji,

wykorzystane jest właśnie w procesie terminacji zwanym ateunacją. Pewna porcja sekwencji

diderowej ulega translacji do tzw. peptydu liderowego. Ten peptyd ma około 14 aminokwasów

długości i jest tworzony na bazie regionów : 1 i odcinka przed pierwszym regionem. Istotne jest to, że

ten peptyd zawiera dwie reszty tryptofanowe, odpowiadają temu dwa kodony tryptofanowe, w

odcinku, który ten peptyd koduje. Są one w układzie tandemowym- jeden po drugim.

Przebieg regulacji rozpatrujemy na dwa sposoby. Sytuacja pierwsza: wysoki poziom tryptofanu. Przy

wysokim poziomie tryptofanu rozpoczyna się transkrypcja od przyłączenia polimerazy w regionie

promotorowo-operatorowym i przechodzi do sekwencji liderowej i tam transkrybuje sekwencje

liderową. Z tego korzysta już rybosom, przyłączając się do końca 5’ i rozpoczynając translację

sekwencji liderowe (konkretnie peptydu liderowego). Podczas tej syntezy, rybosom przechodzi przed

odcinek poprzedzający sekwencje nr 1, wchodzi na sekwencje nr 1, na której znajdują się dwa kodony

tryptofanowe. Jeżeli mamy dużo tryptofanu, to jest on płynnie wbudowywany w strukturę peptydu

liderowego. Wobec tego rybosom przechodzi przed odcinek pierwszy i wchodzi na odcinek drugi.

Należy zwrócić uwagę na fakt, że istnieje współzawodnictwo o odcinek nr 3 (trzeci), pomiędzy drugim

i czwartym. Jeżeli rybosom płynnie przejdzie przez odcinek pierwszy, wejdzie na drugi i go

„przyblokowuje”, to uniemożliwia mu oddziaływanie z trzecim, a z tego korzysta czwarty, formując

terminator transkrypcji. Jest to przedwczesny terminator, bo cały proces zachodzi jeszcze w obrębie

sekwencji liderowej (transkrypcja genu struktury się nie rozpoczęła, a już ulega przerwaniu- stąd

atentacja) . Sytuacja druga: jeżeli mamy mało tryptofanu, to wtedy również z odcinka promotorowo-

operatorowego rozpoczyna się synteza mRNA, wchodzi na teren sekwencji liderowej, przyłącza się

rybosom, który chce rozpocząć transkrypcję peptydu liderowego, ale docierając do dwóch kodonów

tryptofanowych napotyka na problem. W związku z tym zatrzymuje się on na odcinku pierwszym, a

wtedy drugi może spokojnie oddziaływać z trzecim, czwarty zostaje niezwiązany, a to pozwala na

kontynuację transkrypcji.

Podsumowanie: fragmentów jest cztery: 1, 2, 3, 4. Te numerki odnoszą się do pewnych segmentów

sekwencji liderowej. Jest ona pomiędzy sekwencją promotorowo- operatorową a pierwszym genem

struktury. Sekwencja liderowa posiada 4 regiony, które definiuje fakt, że jeżeli sekwencja DNA

ulegnie przepisaniu na RNA, to wtedy te regiony mogą tworzyć struktury łodygi . Może się zatem

tworzyć struktura powstała z oddziaływania regionu 1-2, 2-3 i 3-4. Tylko jedna z tych struktur działa

terminująco na transkrypcję, jest to terminacja Rho-niezależna. Jeżeli pewien odcinek łodygi (spinkę),

a co za tym idzie odcinek pętli, utworzy spinka 3-4, wtedy mamy do czynienia z utworzeniem pętli

terminacyjnej, która zahamuje proces transkrypcji. Najważniejsze znaczenie ma to, która ze spinek-

struktur łodygi się wytworzy, a decyduje o tym rybosom. A wpływ na rybosom ma podaż tryptofanu:

jeżeli podaż tryptofanu jest duża, to robosom płynnie przejdzie przez odcinek pierwszy, na drugi

uniemożliwiając tym samym oddziaływanie z trzecim. Trzeci zaczyna wtedy oddziaływać z czwartym,

a to równa się powstaniu atenuatora, czyli przedwczesnego terminatora transkrypcji. Jeżeli mamy

mało tryptofanu, transkrypcja się zaczyna, transkrybowany jest region liderowy, ale od razu przyłącza

się rybosom. Jeżeli zatrzyma się na regionie pierwszym, bo tryptofanu nie ma i nie może być

wbudowany do peptydu, wtedy drugi jest niezablokowany przez rybosom i oddziaływuje z trzecim-

tworzy się struktura pętli 2-3. W związku z tym nie tworzy się 3-4 ( a to była terminacyjna). Skoro

tworzy się 2-3, to transkrypcja jest kontynuowana, bo nie jest przerywana.

Możemy powiedzieć, że operon tryptofanowy jest regulowany zarówno przez białko represorowe, jak

i atenuację. Jeżeli mamy do czynienia z represją- czyli odblokowaniem operonu, to wtedy

transkrypcja rośnie 70-krotnie, przy wyeliminowaniu ateunacji, będzie ona wzrastać kolejne 10 razy.

Działanie obydwu systemów regulacji, pozwala zmienić poziom transkrypcji 700 razy!

Ryboprzełączniki (aspekty działania bakteryjnego RNA).

Ryboprzełączniki są to składniki wkomponowane w sekwencje liderowe pewnych mRNA

bakteryjnych. (sekwencje znajdują się przy końcu 5’). Te sekwencje liderowe, mogą zawierać rybo

przełączniki- składają się na niego dwa segmenty: domena aptamerowa oraz platforma ekspresyjna.

W rzeczywistości RNA tworzy bardzo skomplikowane struktury II-rzędowe, które formują się na bazie

domeny aptamerowej. Domena ta, w związku, ze swoją bogatą topografia, może wiązać określone

metabolity, przy czym przed i po związaniu różnych związków, ma różną konformację. Ta zmiana

konformacji indukuje określone specyficzne zachowania w obrębie platformy ekspresyjnej. Jakie to

mogą być zachowania? Przyłączenie metabolitu, może zablokować miejsce inicjacji translacji, czyli w

domenie aptamerowej istnieje miejsce inicjacji translacji, czyli miejsce w którym rybosom

rozpoczyna syntezę białka i w związku ze zmianą konformacji to miejsce zostaje zablokowane, przez

utworzenie alternatywnej struktury. Kolejny przykład: po związaniu metabolitu może dojść do

utworzenie w obrębie platform ekspresyjnej spinki terminacyjnej. Można zauważyć, że tworzy się ona

w końcu 5’, czyli przed obrębem kodującym. Zachodzi zatem przedwczesna terminacja transkrypcji.

Kolejny przykład: związanie metabolitu, spowoduje, że platforma ekspresyjna zachowa się jak

rybozym- enzym mający naturę cząsteczki RNA. Konkretnie ten rybozym przeprowadza własną

autodestrukcję- w obrębie platformy dochodzi do przecięcia cząsteczki RNA. We wszystkich tych

przypadkach związanie metabolitu, doprowadza do zahamowania ekspresji odpowiedniej cząsteczki

mRNA. Zatem poprzez wiązanie metabolitu nie obserwujemy syntezy odpowiedniego białka. Jak się

można

domyślić,

ryboprzełączniki

są

intensywnie

studiowane

rozmaitych

bakterii

chorobotwórczych. Dąży się do tego, by przy użyciu ryboprzełączników, zahamować proces rozwoju

tych bakterii- produkuje się leki, które potrafiłyby symulować metabolity występujące naturalnie u

bakterii, które wyłączałyby ekspresję czynników chorobotwórczych komórki bakteryjnej.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 9

Transkrypcja w komórce eukariotycznej.

W przeciwieństwie do komórki bakteryjnej, u eukariontów mamy do czynienia z kilkoma

polimerazami RNA. Są one ponumerowane cyframi rzymskimi I, II, III i różnią się pulą

transkrybowanych genów.

RNA-Pol I

transkrybuje rRNA

RNA-Pol II

transkrybuje mRNA !

RNA-Pol III

transkrybuje tRNA i inne (niewielkie cząsteczki)

RNA- Pol II

Zajmijmy się najpierw strukturą promotora dla polimerazy II. W przypadku definicji

promotora bakteryjnego, mówiliśmy, że jest to sekwencja, do której wiąże się polimeraza DNA,

rozpoczynając proces transkrypcji. Dla eukariontów sytuacja ma się inaczej- tutaj, o promotorze

mówimy, iż jest to segment sekwencji, który znajduje się przed genem (częścią kodującą)i jest istotny

dla procesu transkrypcji. Do rozpoczęcia procesu transkrypcji u eukariontów potrzebny jest cały

kompleks białek, nie tylko polimeraza RNA, ale również białka wspomagające transkrypcję, tzw.

czynniki transkrypcyjne. Są one nazywane ogólnie transcription factors i oznaczane skrótem TF.

Sama polimeraza RNA nie jest w stanie u eukariontów rozpocząć transkrypcji, musi współdziałać z

czynnikami białkowymi.

Struktura promotora dla RNA- Pol II

W obrębie tego promotora możemy wyróżnić dwa rodzaje sekwencji, mianowicie: tzw.

promotor podstawowy oraz elementy położone powyżej (jest to „mało zgrabne” tłumaczenie

angielskiego terminu „upstream elements”).

W skład promotora podstawowego wchodzi tzw. kaseta TATA (ang. TATA Box), która znajduje

się mniej więcej 25 nukleotydów przed pierwszym transkrybowanym nukleotydem, zwanym

miejscem rozpoczęcia transkrypcji. Oprócz niej, w skład promotora wchodzi także sekwencja

inicjatorowa, która znajduję się wokół nukleotydu +1 – pierwszy transkrybowany nukleotyd.

Co dzieje się na promotorze podstawowym?

Promotor podstawowy jest miejscem składania kompleksu inicjacyjnego, czyli miejscem, w

którym budowany jest kompleks polimeraz RNA wraz z czynnikami inicjującymi (czynnikami

transkrypcyjnymi). Dla sekwencji promotorowej można przeprowadzić analizę mutacyjną.

Jeżeli na osi x wykresu, odłożymy pozycję nukleotydową w rejonie sekwencji promotorowej i

jeżeli jako 1 przyjmiemy aktywność promotora niezmutowanego, to mutacje wprowadzane w

różnych pozycjach sekwencji promotorowej, mają różny wpływ na aktywność tego promotora. Jest

szereg pozycji, które właściwie wpływu nie maja, są pozycje, które mają wpływ redukujący i

znajdować się one będą głównie w obrębie kasety TATA i rejonie sekwencji inicjatorowej. Jeżeli

udamy się na wykresie up-stream w stosunku do promotora podstawowego, to również

odnajdziemy pozycje, które pod wpływem mutacji, będą negatywnie wpływać na aktywność

promotora, a co za tym idzie aktywność prowadzonej transkrypcji i te elementy określa się mianem

up-stream elements. Rolą up-stream elements jest wiązanie się z białkami czynników

transkrypcyjnych, dodatkowo aktywując proces transkrypcji. Poszczególne geny będą różnić się

poszczególnymi up-stream elements. Z reguły jednak będą w nich występować elementy promotora

podstawowego. Należy zwrócić uwagę także na fakt, że w niektórych genach takich sekwencji nie

ma, są nieobecne.

Co dzieje się w trakcie inicjacji transkrypcji na promotorze podstawowym?

W trakcie inicjacji zachodzi łączenie się z promotorem rozmaitych podstawowych białek:

1. Pierwszym z tych białek, jest białko czynnika transkrypcyjnego D, tzw. TF

D (czynnik

transkrypcyjny D dla polimerazy II). A zatem po pierwsze przyłącza się czynnik D, który tak naprawdę

jest kompleksem białek, w którego skład wchodzi białko TBP (TATA Box priming Protein), czyli białko

wiążące się z kasetą TATA, oraz białka TAF (plural TAFs)- białka zasocjowane łączące się z kasetą TATA

(jest ich kilkanaście).

2. Przyłączanie kolejnych czynników: TF

A,TF

B, kompleks TF

F z RNA Pol II (czynnik z polimerazą

II RNA), TF

E oraz TF

H&J (w odpowiedniej kolejności!).

* Zwrócić należy uwagę na czynnik H, który posiada dwojaką aktywność: jest helikazą oraz kinazą.

Aktywnością kinazową fosforyluje on C-terminalną (końcową) domenę polimerazy RNA (chodzi tu o

największą podjednostkę polimerazy RNA). Zdarzenie fosforylacji rozpoczyna proces transkrypcji i

tym momencie polimeraza zaczyna syntezę nici mRNA.

Dodatkowe czynniki warunkujące inicjację transkrypcji

Należy zwrócić uwagę, że do rozpoczęcia procesu transkrypcji, oprócz elementów promotora

podstawowego i elementów up-stream, wymagane są dodatkowe sekwencje DNA. Te sekwencja

określa się mianem wzmacniających –tzw. enhancery (ang. Enhancer). Różnica w budowie sekwencji

wzmacniającej i promotorowej jest następująca: sekwencja wzmacniająca może być zlokalizowana

zarówno up jak i down-stream, czyli powyżej lub poniżej genu. Zachowuje ona swoją aktywność

niezależnie od pozycji wobec genu. Podczas kiedy promotor musi znajdować się w bezpośrednim

sąsiedztwie sekwencji kodującej. Enhancery działają także w obydwu orientacjach. Jeżeli w wyniku

rekombinacji In vitro odwrócimy orientacje takiej sekwencji, to będzie ona aktywna. Inaczej jest w

przypadku sekwencji promotorowej. Enhancery nie muszą znajdować się bezpośrednio w rejonie

kodującego

genu,

natomiast

promotor

musi.

Działają

rozmaitej

odległości.

Do sekwencji wzmacniających także wiążą się czynniki transkrypcyjne (inne niż dla

promotorów-te czynniki to ogólne (generalne) czynniki transkrypcyjne).

Wpływ czynników transkrypcyjnych wiążących się z sekwencjami wzmacniającymi

na transkrypcje danego genu.

Sekwencja, która dystansuje kontrolowany gen od sekwencji wzmacniającej, może ulec

wypętleniu. Jeżeli jest to sekwencja enhancerowa, to białka, która znajdują się w pobliżu wypętlenia,

mogą bezpośrednio oddziaływać z białkami, które znajdują się na promotorze podstawowym . Mogą

też istnieć białka pośredniczące, które odpowiadają za taki kontakt innych białek. Odnosi się to do

kontroli pozytywnej- czyli zwiększania tempa transkrypcji, pod wpływem czynników ją aktywujących.

Oprócz tego mamy do czynienia u eukariontów z represją.

Represja transkrypcji

Białka represyjne u eukariontów mogą wiązać się z sekwencjami, będącymi przeciwieństwem

sekwencji wzmacniających, z tzw. silencerami – wyciszaczami. Białka tego typu, o charakterze

represorów,. mogą współzawodniczyć z białkami aktywującymi o wiązanie z sekwencjami

wzmacniającymi. Podsumowując, mamy do czynienia zarówno z kontrolą pozytywną, jak i

negatywną.

Modyfikacje transkryptu

Transkrypt, który powstaje bezpośrednio rezultacie aktywności polimerazy typu II, nazywany

jest transkryptem pierwotnym. Na końcu 5’ posiada 3 grupy fosforanowe, dalej znajduje się mozaika

sekwencji kodujących – egzonów, i niekodujących – intronów oraz koniec 3’.

Typy modyfikacji:

Modyfikacja końca 5’ – ulega on tzw. cappingowi - do końca 5’ dołączana jest czapeczka

(ang. cap). Cap jest to nukleotyd guaninowy, który jest dodawany do końca 5’, przy pomocy

wiązania nietypowego 5’-5’. Źródłem tego nukleotydu jest GTP. W czasie formowania

czapeczki odczepiany jest beta i gamma fosforan GTP (transferaza guanylynowa) oraz

gamma fosforan końcowego nukleotydu. W rezultacie odczepiane są 3 grupy fosforanowe

oraz łączą się dwa węgle 5’. Dodatkowo zachodzi metylacja pozycji N7 terminalnej guaniny

(metylotransferaza guaninowa) oraz metylacje grup –OH drugiego i trzeciego nukleotydu.

Może także dojść do metylacji grupy –OH drugiego nukleotydu, jeżeli jest nim adenina.

Z strukturą cap-u łączy się kompleks, który stabilizuje i zabezpiecza cząsteczkę RNA,

ma także znaczenie w transporcie mRNA z jądra do cytoplazmy i wyborze kodonu startowego

przy translacji. Prawidłowość odczytu białka przy translacji zależy do wyboru właściwego

kodonu startowego, który decyduje, gdzie białko się zaczyna i decyduje o ramce odczytu.

Bardzo często, jako kodon startowy wybierany jest kodon AUG, kodujący metioninę za

czapeczką.

Modyfikacja końca 3’, na końcu którego zachodzi poliadenylacja, z której robimy użytek

podczas chromatografii powinowactwa, do izolacji frakcji poliadenylowanego RNA oraz w

kontekście odwrotnej transkrypcji, jako sekwencja występująca u wszystkich cząsteczek

mRNA, które są syntetyzowane w jądrze komórkowym, wobec czego można ją zastosować,

jako swego rodzaju sekwencję adaptorową i przyłączyć do niej starter odwrotnej transkrypcji

i przepisać w ten sposób informację przenoszoną przez cząsteczkę RNA na cDNA.

Co do każdego transkryptu możemy być pewni lub niemal pewni, że posiada

poliadenylowany koniec 3’, do którego możemy dołączyć starter. Na czym polega

modyfikacja końca 3’?

Blisko końca 3’ znajduje się fragment sekwencyjny, już w obrębie cząsteczki RNA:

AAUAAA , który jest rozpoznawany przez czynnik białkowy, a następnie nieco poniżej tego

motywu AAUAAA, następuje przecięcie transkryptu i pojawia się nowy koniec 3’, powstały

nie w wyniku terminacji transkrypcji, lecz jego obróbki. Następnie ten nowy koniec, powstały

dzięki trawieniu endonukleolitycznemu, jest adenylowany przez polimerazę poliA, która w

sposób niezależny od matrycy, dodaje z reguły około 200 nukleotydów.

Usuwanie intronów- splicing, składanie RNA, usuwanie intronów. Większość genów posiada

introny, niewiele genów jest wyjątkiem od tej reguły (np. geny kodujące histony). Organizacja

intronów może być rozmaita w poszczególnych genach. Mogą mieć od kilku do kilkuset

tysięcy nukleotydów. Wtedy takie geny rozciągnięte są na szereg kilkuset tysięcy par

nukleotydów. Istnieją dwa sposoby wycinania intronów:

-samoczynnie, wtedy introny wykazują aktywność zwaną rybozymową, gdzie intron sam

dokonuje swojego wycięcia

-współdziałanie z czynnikami białkowymi oraz faktorami RNA.

*Produkty wycinania intronów mogą być rozmaite, np. mRNA i struktura lassa, powstała z wyciętego

intronu. Składanie może zachodzić w układzie cis- najczęściej zdarzające się. Składanie może

zachodzić także w inny sposób i jest to raczej wyjątek, niż reguła, mianowicie introny moją być

wycinane w układzie trans- takie wycinanie zachodzi gdy, włączone egozny znajdują się na różnych

cząsteczkach RNA, na różnych transkryptach pierwotnych( gdzie typowo znajdują się na jednej). Tzw.

przerwany intron, zapewnia, że fragmenty z odpowiednich transkrpytów, zostaną złączone. Intron,

którego część znajduje się w obrębie dwóch cząsteczek, posiada sekwencje komplementarne, które

pozwalają na odnalezienie się dwóch transkryptów w mieszaninie.

Korzyści płynące z budowy intronowo-egzonowej genu, to między innymi składanie

alternatywne. Oznacza to, że z jednego transkryptu pierwotnego, mogą być uformowane dwa lub

więcej transkryptów dojrzałych, które różnią się składem sekwencji egzonowych. Takie rozwiązanie,

pozwala na podstawie jednego genu formować różne izoformy danego białka, różniące się składem

domenowym. Bardzo często poszczególne egzony, kodują funkcjonalne domeny konkretnego białka.

Wobec tego powstaje zróżnicowany produkt. Zatem jeden gen może kodować rozmaite białka, które

ulegają transkrypcji w różnych tkankach i dzięki temu zapewniają nieco inne funkcje, w związku z

zawartością różnych domen.

Kolejna korzyść z budowy intronowo-egzonowej ma charakter ewolucyjny. Taka organizacja

ułatwia powstawanie nowych genów. Dzięki zjawisku niesymetrycznego crossing over, następuje

wymiana odcinków między niehomologicznymi segmentami chromosomów, co może doprowadzić

do powstania genów, które różnią się składem egzonów. Modułowa struktura sprzyja temu, iż w

rezultacie zdarzeń rekombinacyjnych mogą powstać nowe geny, które budowane są nie de Novo, lecz

z preegzytującuch cegiełek modułowych, którymi są sekwencje egzonowe, przy okazji kodujące

funkcjonalne domeny białek, czyli powstają fuzyjne białka różniące się składem domen. To zjawisko

może być określone mianem tasowania egzonów.

Redagowanie RNA- modyfikacja ta jest stosunkowo rzadka, nie występuje we wszystkich

transkryptach. Redagowanie można określić, jako drobne zmiany w sekwencji RNA

pojawiające się przed procesem jego translacji. Zmiany te są subtelne, lecz mogą mieć istotny

wpływ na produkcję białek. Redagowanie można podzielić na dwie kategorie: substytucyjne

lub inercyjne. Substytucyjne, polega na zamianie określonych nukleotydów, np. C na U na

zasadzie dezaktywacji. Jest to nic innego, jak chemiczna modyfikacja już istniejącego

nukleotydu. Rozwijając ten wątek, u ssaków mamy do czynienia genem kodującym

apoliproteinę B. Otwarta ramka odczytu tego genu formowana jest przez 4563 kodony

aminokwasowe i kodon STOP.

Losy redagowanego RNA : na początku ulega on transkrypcji zarówno w wątrobie jak i w

jelicie. W wątrobie translacji ulega nieredagowana cząsteczka RNA, synteza białka zachodzi

na bazie kompletu kodonów, czyli w efekcie powstaje białko, mające 4563 reszty. Jest to

białko apoB100. W jelicie zachodzi drobna modyfikacji, w kodonie glutaminy 2153, następuje

konwersja C do U: cytozyna przechodzi w uracyl. W rezultacie kodon aminokwasowy ulega

konwersji do kodonu STOP. Jeżeli taka cząsteczka ulega translacji, formowane jest krótsze

białko o długości 2153 reszt aminokwasowych. Dzięki redagowaniu nastąpiła zmiana sensu w

obrębie centralnej części otwartej ramki odczytu, prowadząca do formowania kodony STOP

zamiast białkowego. Powstaje białko apoB48. Białka te różnią się też funkcją: w wątrobie

apoB100 transportuje cholesterol ,a w jelitach apoB48 absorbuje lipidy. Jest to jeden z

przykładów kodowania substytucyjnego.

Innym rodzajem jest zmiana kodonu aminokwasowego na inne kodony

aminokwasowe. Może również generować kodony START – AUG. Czyli ogólnie ma wpływ na

kształt syntetyzowanego białka.

W redagowaniu może także występować insercja lub delecja. Polega ona na

wstawieniu nowych nukleotydów lub usunięciu już istniejących. Przy wstawieniu

nukleotydów nowych, mamy do czynienia z preredagowanym RNA oraz redagowanym RNA-

od pierwszego miejsca redagowania sekwencja jest wtedy całkowicie różna od pierwotnej

nici. Jest to logiczne, gdyż tego typu zmiana zmienia ramkę odczytu, więc od miejsca zmiany,

całkowicie zmienia się charakter odczytywanej sekwencji.

Redagowanie występuje dosyć rzadko, sporadycznie w przypadku genów

transkrybowanych w jądrze komórkowych, lecz jest to dosyć powszechne w mitochondriach,

głównie roślinnych. Występuje także w plastydach oraz powszechnie u pierwotniaków.

Interferencja RNA – odkryta stosunkowo niedawno, ma bardzo duże znaczenie

regulatorowe. Proces polega na wyciszaniu ekspresji danej sekwencji poprzez obecność

dwuniciowego RNA, obejmującego tę sekwencję. Cząsteczki dwuniciowego w cząsteczce

eukarionty

maja

zdolność

rozpoczynania

procesu

interferencji.

Źródła takiego rodzaju RNA to m.in. wirusy. Infekcja wirusów może prowadzić do

pojawienia się dwuniciowego RNA danego wirusa. Może ono także pojawić się w rezultacie

transkrypcji pewnych genów. Pierwsza kategoria takich genów, to te geny, które zostały

zmienione pod wpływem mutacji, kolejna to transgeny (geny wprowadzone sztucznie przez

człowieka) lub transpozony, czyli ruchome elementy genetyczne. Kolejna kategoria, która w

rezultacie może dawać dwuniciowe cząsteczki RNA, to geny kodujące tzw. mikroRNA.

MikroRNA to cząsteczki RNA, których zadaniem jest regulacja ekspresji genów docelowych

na zasadzie zjawiska interferencji. Kolejną kategorią jest dostarczane z zewnątrz do komórki

RNA przy użyciu transfekcji (wprowadzenie sztucznego RNA, np. poprzez zamknięcie w

pęcherzykach lizosomalnych).

Jakie by nie było źródło dwuniciowego RNA, procesy zachodzące w procesie

interferencji są podobne. Najpierw kompleks DICER przycina dwuniciowe RNA do krótszych,

około 20 nukelotydowych, elementów, które określane są mianem siRNA- krótkie

interferujące RNA (jeżeli powstają na bazie zmienionych genów, RNA wirusowego lub RNA

translokowanego) lub mikroRNA (jeżeli powstają na bazie prekursorów RNA). Te cząsteczki

RNA ulegają rozpleceniu i pojedyncze nici pojedynczych cząsteczek są eksponowane na

powierzchni tzw. kompleksu RISC – kompleks wyciszający indukowany przez RNA. Następnie

do wyeksponowanej nici mogą wiązać się cząsteczki mRNA, mogą być one kompletnie

dopasowane, bądź dopasowane częściowo. Jeżeli dopasowane są kompletnie, zachodzi

trawienie, rozcięcie cząsteczki i w rezultacie nie stanowi już ona wartościowej matrycy do

syntezy. Jeżeli dopasowanie jest niekompletne może ono również zapobiegać syntezie białka,

ale poprzez samo wiązanie cząsteczki transkryptu.

Rola interferencji: zjawisko to ogranicza replikację wirusów w komórkach eukariotycznych,

poprzez niszczenie elementów wirusowych. Po drugie, ogranicza ekspresję nieprawidłowych

genów, czyli takich, które zlokalizowane są na ruchomych elementach genetycznych. W ten

sposób ograniczają ekspansję transpozonów. Ograniczają także ekspresję genów zmutowanych

oraz transgenów. Zjawisko intereferncji leży u podstaw, tego że zwłaszcza u roślin, po

transformacji, w miarę rozwoju i w późniejszych pokoleniach obserwujemy zanik transkrypcji

nowowprowadzonego genu. Kolejne źródło, mianowicie prekurosory mikroRNA- to kolejny

mechanizm ekspresji genów w komórkach eukariotycznych. Na poziom tworzonego białka,

komórka może wpływać nie tylko poprzez liczbę kopii transkrybowanego genu i tempo inicjacji

transkrypcji,

ale

także

poprzez

syntezę

odpowiednich

cząsteczek

RNA.

Szlak syntezy cząsteczek mikroRNA: pre-miRNA (cząsteczka powstająca bezpośrednio

w rezultacie transkrypcji z genomu)

dwuniciowe segmenty, w skład których wchodzą nici

eksponowane na kompleksy, są wycinane

transport tego RNA do cytoplazmy obróbka przez

DICER

ekspozycja na powierzchni kompleksu RISC. Jeżeli do takiego wyeksponowanego miRNA

zwiąże się cząsteczke mRNA, może być zahamowana jej translacja.

Jest to dosyć potężne narzędzie badawcze, gdyż zamiast otrzymywać mutanty, czyli

dokonywać knock outu całego genu w całym cyklu życiowym organizmu, można na ekspresję

tych genów wpływać ograniczająco, poprzez podawanie na drodze transfekcji, odpowiedniego

dwuniciowego RNA- są to tzw. mutacje warunkowe. Inny sposobem modulacji ekspresji jest

wprowadzanie genów kodujących mRNA do genomu biorcy i następnie wykorzystywanie tego do

wyciszania genów szlaku mikroRNA.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 10

Translacja:

Tłumaczenie sekwencji nukleotydów na język aminokwasów. Reguła rządząca procedurą tłumaczenia

to kod genetyczny. Cechą kodu jest m.in. trójkowość – jeden aminokwas kodują 3 nukleotydy. Kod

genetyczny jest także bezprzecinkowy: brak sygnałów wyznaczających granice między kodonami. To

sprawia, że podstawowe znaczenie zyskuje wybór kodonu inicjacyjnego. Wybór ten mówi o tym jaki

ma być pierwszy aminokwas w białku, a także w jakiej fazie mają być odczytywane pozostałe

nukleotydy w matrycowym RNA. Kod genetyczny ma także charakter nadmiarowy, który czasem

określany jest degeneracją kodu. Polega to na tym, iż jeden aminokwas może być kodowany przez

więcej niż jedną trójkę – kilka trójek może kodować jeden aminokwas. Czwarta cecha kodu to

uniwersalność: znaczenie poszczególnych trójek jest identyczne niezależne od tego z jakim systemem

translacji mamy do czynienia: u bakterii, w plastydach, mitochondriach itd. Przy czym ta reguła

posiada odstępstwa. AGA – koduje arginine, a u niektórych pierwotniaków może kodować np. sygnał

STOP. Większość kodonów koduje aminokwasy. 3 kodony nie kodujące aminokwasów to tzw. kodony

STOP – stanowią sygnały zatrzymania (terminacji) translacji. AUG jest to trójka kodująca Metioninę –

jest to także kodon inicjacyjny, od którego rozpoczynamy translację.

Jest kilka aminokwasów kodowanych przez 6 trójek: Arginina, Leucyna i Seryna. Na drugim biegunie

kodu znajdują się aminokwasu kodowane tylko przez jedną trójkę – Metionina, Tryptofan.

Kiedy chcemy zaprojektować startery do PCR, a posiadamy jedynie informację o sekwencji białka to

teoretycznie na tej podstawie jesteśmy w stanie zaprojektować starter. Przy czym najlepiej skorzystać

z regionów białka gdzie występuje kumulacji kodonów Metioninowych i Tryptofanowych, bo tam

sekwencje można określić w sposób jednoznaczny.

Reguła tolerancji Cricka:

Odnosi się do faktu, że mamy 61 kodonów aminokwasowych, a podstawowa liczba aminokwasów

białkowych to 20. Natomiast jeżeli przyjrzeć się liczbie obsługujących te kodony aminokwasów

cząsteczki tRNA to jest ich mniej - tRNA nie jest tyle ile kodonów aminokwasowych. Jedna cząsteczka

tRNA musi rozpoznawać więcej niż jeden kodon (są to oczywiście kodony dla tego samego

aminokwasu). Reguła tolerancji: do rozpoznania kodonu w mRNA poprzez antykodon w tRNA

wystarcza komplementarność dwóch pierwszych zasad nukleotydów (pierwszych w notacji dla

kodonu).

Zasada

pozycji

5’

antykodonie

Paruje się z:

Zasada w pozycji 3’ w kodonie

C lub U

A lub G

I (inozyna)

A, U lub C

Inozyna – nukleotyd, który jako zasadę posiada tak zwaną hypoksnatynę.

W związku z tym wszystkie kodony kodu genetycznego mogą być obsłużone przez mniejszą liczbę

cząsteczek tRNA. Mamy więc do czynienia z sytuacją, w której jedna cząsteczka tRNA może

obsługiwać kilka kodonów dla jednego aminokwasu, może się także zdarzyć, że jeden aminokwas jest

obsługiwany przez więcej niż jedną cząsteczkę tRNA – takie tRNA nazywamy izoakceptorowym.

Struktura drugorzędowa tRNA

Schemat budowy tRNA:

α, ramię antykodonowe A;

β, ramię aminokwasowe (akceptorowe);

γ, ramię dodatkowe (zmienne);

δ, ramię dihydrourydynowe D;

τ, ramię rybotymidowe (pseudourydynowe) T

Struktura drugorzędowa cząsteczki tRNA opisuje

oddziaływania

komplementarne

pomiędzy

różnymi regionami cząsteczki tRNA. Widać, że

możemy wyróżnić regiony wewnątrzcząsteczkowej

komplementarności i oddzielające je pętle. Są 4

pętle. Podstawowe znacznie funkcjonalne ma tak

zwana pętla antykodonowi (A) – tutaj znajdują się

trzy nukleotydy antykodonu. Mamy też pętle D

(nazwa od dihydrourydyny). Mamy także pętle

pseudourydynową (T) – nazwa pochodzi od

zmodyfikowanej zasady – pseudourydyny. Pętla

zmienna (γ ) – różni rozmaite cząsteczki tRNA

i odpowiada za ich zróżnicowaną długość. Długość

cząsteczek tRNA wynosi ok. 80 nukleotydów.

Całość struktury 2-rządowej to tzw. struktura liścia koniczyny. W cząsteczce tRNA występuje jeszcze

jedna funkcjonalna część – ramie akceptorowe (β). Ramię akceptorowe jest miejscem do którego

dołączana jest reszta aminoacylowa czyli aminokwas. Konkretnie jest on dołączany do końca 3’, na

którym z reguły mamy sekwencję CCA.

Nietypowe zasady występujące w cząsteczce tRNA biorą się z modyfikacji enzymatycznej cząsteczek

tRNA, które można by uznać za „redagowanie”.

Z reguły identyfikację cząsteczki zapewnia sekwencja antykodonowa i z reguły nukleotydy z ramienia

akceptorowego.

Struktura trzeciorzędowa tRNA: struktury drugorzędowe są uformowane przestrzennie w kształt

litery L. Długie ramię litery L kończy się pętlą antykodonowi, natomiast krótkie ramię tworzy ramię

akceptorowe z końcem 3’.

Identyfikację cząsteczek tRNA przeprowadza enzymy zwany syntetazą aminoacylo tRNA – są to

enzymy odpowiadające za obładowanie cząsteczek tRNA odpowiednimi aminokwasami. Syntetyzują

tzw. cząsteczki aminoacylo tRNA = reszta aminokwasowa + tRNA.

ATP

ADP+P

Aminokwas + tRNA

aminoacylo tRNA

Każdy aminokwas ma swoją syntetazę. Pierwszym etapem tej reakcji jest tzw. aktywacja, w której

reakcji ulega aminokwas i ATP, produktem jest zaś aminoacyloadenylan, czyli reszta aminokwasowa

połączona z AMP. Następnie mamy przeniesienie reszty aminoacylowej z AMP na koniec 3’ tRNA.

Przeniesienie to może nastąpić zarówno na grupę 2’ lub 3’ hydroksylową.

Rybosomy:

Rybosomy są utworzone z białek i RNA. Te białka i RNA tworzą 2 podjednostki – dużą i mała. Zarówno

rybosomy jak i podjednostki czerpią swoje nazwy od odpowiednich stałych sedymentacji. Np.

rybosom bakteryjny 70S ulegający dysocjacji na podjednostkę 50S i 30S (wartości nie te nie są

addytywne – wiąże się to z naturą fizyczną sedymentacji, które nie zależy jedynie od masy cząsteczki,

ale także od jej kształtu).

Duża podjednostka 50S bakteryjnego rybosomu składa się z:

•

2 cząsteczek RNA – 23S rRNA i 5S rRNA

•

31 białek

Mała podjednostka 30S bakteryjnego rybosomy składa się z:

•

16S rRNA

•

21 białek

Białka te są ponumerowane od 1 do 31 i od 1 do 21 i odpowiedni numer jest poprzedzony literą L lub

S w zależności od tego czy mamy dużą (L) czy małą (S) podjednostkę.

W obrębie 16S rRNA mamy pewne domeny, które oddziaływają z różnymi białkami.

Na rybo somie możemy wyznaczyć miejsce takie

jak A, P, E.

Miejsce A – miejsce aminoacylowe, które zajmuje

cząsteczka tRNA z nowo włączana resztą

aminoacylową.

Miejsce P – (P od peptydy) – zajmowane przez

cząsteczkę tRNA z połączoną z dotychczas

syntetyzowanym łańcuchem polipeptydowym.

Miejsce E – exit – miejsce, które zajmuje tRNA

pozbawiony reszty peptydylowej (zdeacylowany tRNA) przed usunięciem z rybosomy.

rybosomie

możemy

także

wyróżnić

rejon

odpowiedzialny

aktywność

zwaną

peptydylotransferazą.

Inicjacja:

Rozpoczyna się od połączenia z małą podjednostką rybosomu czynników białkowych zwanych F1 oraz

F3. Ten kompleks (F1+F3+mała podjednostka rybosomu) łączy się z cząsteczką mRNA w rejonie

kodonu inicjacyjnego (AUG przy końcu 5’). Kodonów AUG może być bardzo wiele, lecz przed

miejscem inicjacji translacji znajduje się sekwencja zwana Shine-Dalgarno. Sekwencja ta wykazuje

częściową komplementarność do 16S rRNA z małej podjednostki rybosomu.

W przypadku translacji Eukariotycznej bardzo często jest obierany za inicjacyjny pierwszy kodon AUG

za czapeczką (za strukturą cap’a). O tym wyborze decyduje jednak także kontekst sekwencyjny

kodonu AUG.

Do kompleksu preinicjacyjnego (F1+F3+mała podjednostka rybosomu) przyłącza się kolejny kompleks

złożony z czynnika F2, który występuje w kompleksie z GTP oraz cząsteczki zwanej n-

formylometionylo-tRNA (tRNA połączony z właściwym kodonem inicjacyjnym AUG). Tworzy się w

rezultacie kompleks inicjacyjny.

3 etap tego procesu to hydroliza GTP, po której następuje dysocjacja czynników inicjacyjnych, a na

ich miejsce przyłączone zostaje przyłączona duża podjednostka. Jest to zakończeniem inicjacji.

Elongacja:

Rozpoczyna się od tego, iż do miejsca A (aminoacylowego) wnika aminoacylo-tRNA, który jest

determinowany sekwencją kolejnego kodonu. Kolejny aminoacylo-tRNA jest przynoszony do

rybosomy w kompleksie z czynnikiem zwanym EF-Tu (Elongation Factor).

Kolejny etap elongacji to formowanie wiązania peptydowego. Biochemicznie jest to atak

nukleofilowy grupy α-aminowej aminokwasu na grupę karbonylową poprzedniego aminokwasu. Za

aktywność peptydylotransferazy odpowiada cząsteczka 23S rRNA (przykład rybozymu).

Trzecim etapem jest translokacja polegająca na tym, że rybosom przemieszcza się jeden kodon w

kierunku 3’ cząsteczki mRNA. Rybosom przemieszcza się więc po cząsteczce mRNA w kierunku od 5’

do 3’ a synteza białka następuje od N-końca do C-końca (5’ mRNA to N-koniec cząsteczki białka). W

związku z tym zmienia się położenie tRNA połączonego z resztą peptydylową na miejsce P. Miejsce A

uwolni się, a zdeacylowany tRNA przejdzie do miejsca E.

Etap czwarty to uwolnienie zdeacylowanego tRNA z miejsca E. Teraz może się rozpocząć kolejna

runda syntezy, czyli przyłączenie nowej cząsteczki aminoacylo-tRNA, dyktowanej przez następny

kodon, w miejsce A. Proces ten przebiega do mementu, w którym w miejscu A pojawi się kodon

STOP. Wtedy zamiast cząsteczki aminoacylo-tRNA, do miejsca A wędruje czynnik zwany RF (Realisig

Factor). Ów czynnik sprawia, że peptydylotransferaza przeniesie resztę peptydylową na cząsteczkę

wody i jest to jednoznaczne z jej uwolnieniem. To także powoduje dysocjację aparatu translacyjnego.

Jednym z czynników, jaki może interferować z procesem translacji i wpływać na jego inhibicję są

antybiotyki. Np. teracyklina inhibuje wiązanie aminoacylo tRNA z robosomem. Streptomycyna

interferuje z procesem falowania pomiędzy aminoacylo-tRNA i mRNA w rezultacie powstają zmienne

białka. Erytromycyna wiąże się z 23S rRNA i blokuje elongację. Klorafenikol także blokuje elongację

poprzez hamowanie aktywności peptydylotransferazy.

Po procesie translacji biała są jeszcze modyfikowane.

Modyfikacje terminalne: zarówno C-koniec jak i N-koniec mogą ulegać modyfikacji.

Utrata sekwencji sygnałowej – sekwencje sygnałowe są to fragmenty cząsteczki białka

odpowiadające za jego właściwą lokalizację w komórce. W niektórych przypadkach są zachowywane

w innych – usuwane.

Modyfikacja konkretnych reszt aminokwasowych: np. fosforylacja, metyzacja, karboksylacja lub

bardziej rozległe modyfikacje takie jak dodatek reszt oligocukrowych, izoprenylowych, dodatnie grup

prostetycznych (np. hemu w cytochromie C). Może także dojść do obróbki proteolitycznej czy

utworzeniu mostków disiarczkowych.

Przykładem takiej modyfikacji może być modyfikacja pro insuliny w insulinę wiążąca się z usunięciem

fragmentu cząsteczki białka prekursorowego i utworzeniem mostków dwusiarczkowych.

Czasem zdarza się, że tak zwana poliproteina (białko pierwotne) daje w wyniku trawień

proteolitycznych początek rozmaitym białkom bądź peptydom pochodnym o często rozmaitej,

odmiennej funkcji.

Regulacja translacji:

ma mniejsze znaczenie niż regulacja transkrypcji. Regulacja ta może być realizowana na różne

sposoby:

•

Poprzez modulacje aktywności czynników inicjacyjnych. Np. fosforylacja poprzez określone

kinazy może działać hamująco na czynniki inicjacji.

•

Wiązanie z się z cząsteczkami mRNA białkowych regulatorów.

•

Poprzez związanie antysensownych RNA, które na zasadzie komplementarności tworzy

dupleks z mRNA nie pozwalając na ich translację.

•

Na drodze interferencji RNA.

Import białka:

Białka formowane są na terenie cytoplazmy, lecz lokalizacja docelowa może być zupełnie inna. Białka

mogą zostać w cytoplazmie, mogą być kierowane do różnych organelli, do błony komórkowej lub na

zewnątrz błony (białka sekrecyjne). O tym gdzie znajdzie się docelowe białko decydują procesy

importu, zwanego czasem kierowaniem białka. Najczęściej o docelowej lokalizacji białka decyduję

sekwencja wchodząca w jego skład. Sekwencje mogą być położone N-teminalnie, C-terminalnie, a

także mogą znajdować się wewnątrz cząsteczki. Bywa, że ta sekwencja kierująca jest zatrzymana w

cząsteczce, ale czasem dzieje się tak, że jest usuwana. Poszczególne lokalizacje różnią się naturą

sekwencji sygnałowych.

Np. w przypadku importu do retikulum endoplazmatycznego – sekwencja sygnałowa zlokalizowana

jest przy N-końcu, po imporcie zostanie usunięta, składa się z rdzenia, który stanowi od 6 do 12

długich hydrofobowych aminokwasów, często poprzedzonych jednym lub kilkoma aminokwasami

zasadowymi.

Podczas transportu do macierzy mitochondrialnej to sekwencja sygnałowa zlokalizowana jest N-

terminalnie, po imporcie także jest usuwana i składa się z 3 do 5 (niekoniecznie ułożonych jedna przy

drugiej) Arginin i Lizyn. Zapewnia to ładunek dodatni tejże sekwencji.

Sekwencja kierująca do jądra komórkowego położona jest wewnątrz cząsteczki białka, z tego względu

jest zachowana także w dojrzałej cząsteczce.

Ze względu na te charakterystyczne motywy, na podstawie sekwencji białka można przewidzieć jego

docelową lokalizację. Służą do tego odpowiednie oprogramowania.

Import do retikulum endoplazmatycznego: sekwencja zlokalizowana na N-końcu (pojawia się jako

pierwsza). Po syntezie, która ma miejsce w cytoplazmie, sekwencja sygnałowa rozpoznawana jest

przez tzw. cząstkę SRP (Signal Recognition Particle) – rybonukleoproteinę wiążącą się do sekwencji

sygnałowej. Związanie się SRP z sekwencją kierującą działa hamująco na translację. Dodatkowo

pozwala na związanie kompleksu rybosom-mRNA-peptyd (dotychczas zsyntetyzowany) z błoną

retikulum endoplazmatycznego, w którego błonie znajduje się białko będące receptorem cząstki SRP.

Po tym związaniu SRP dysocjuje i może przyłączyć się do kolejnego rybosomu, a translacja może

zostać wznowiona. Kompleks rybosom-kompleks SRP może się poruszać w związku z faktem, iż błona

ma charakter półpłynny. Poruszanie to sprawia, że w pewnym momencie cały kompleks wchodzi w

kontakt z tzw. translokonem – kompleksem białek odpowiadających za import białka zaczynającego

się sekwencją sygnałową do wnętrza retikulum. Po przemieszczeniu się rybosomu na translokon,

rybosom jest zostawiany na translokonie, przy czym sekwencja sygnałowa pozostaje związana z

wnętrzem kanału translokacyjnego, który w tym translokonie występuje. Ten kanał jest bardzo wąski

(średnica - 15Å), oznacza to, że białko musi być przeciskane przez niego w postaci rozwiniętej i

przechodzi przez kanał w miarę postępującej syntezy. We wnętrzu retikulum białko to jest wiązane

przez białka opiekuńcze (tzw. chaperony), które sprawiają, że nowo uformowane białko nie wejdzie

w niekontrolowane interakcje z innymi białkami. Oddziaływanie z białkami pomocniczymi sprawia

także, iż równowaga reakcji jest przesunięta na korzyść importu. W czasie procesu translokacji

sekwencja sygnałowa ulega odcięciu – istnieje specjalna peptydaza sygnałowa, która wykonuje to

cięcie.

W związku z tym, że liczne rybosomy syntetyzujące białka zaczynające się sekwencjami sygnałowymi

wiążą się z błoną retikulum endoplazmatycznego błona ta pokryta jest cała pokryta rybosomami –

stąd pochodzi nazwa szorstkiego retikulum endoplazmatycznego.

Inaczej jest z białkami, które są skierowane nie do wnętrza retikulum, lecz do błony retikulum. Wtedy

białka te mają sekwencję sygnałową na N-końcu, która później jest usuwana. Mechanizm transportu

jest taki sam jak w poprzednim przypadku, lecz białka te mają także ulokowane wewnętrznie

sekwencje zatrzymania transferu. W momencie wprowadzenia owej sekwencji do kanału

translokacyjnego, kanał uwalnia białko do dwuwarstwy lipidowej. Sekwencja STOP-transfer staje się

sekwencją transmembranową (czyli tą, która penetruje dwuwarstwę lipidową).

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 11

Prócz białek transportowanych do błony zawierających tylko jedną domenę, poprzez którą łączą się z

tą błoną istnieją także białka posiadające więcej takich domen. Białko takie ma sekwencje sygnałową

na N-końcu. Kiedy w kanale translokacyjnym pojawi się sekwencja STOP-transfer, biało to uwalniane

jest do błony, lecz może się okazać, że w dalszej części zawieraja więcej sekwencji sygnałowych co

wywołuje kaskadę zdarzeń podobnie jak w poprzednich wypadkach: wiązanie się z SRP oraz wiązanie

z receptorem na błonie retikulum. W przypadku pojawienia się kolejnej sekwencji STOP-transfer

białko ponownie uwalniane jest do błony przy czym będzie miało już kolejną domenę

transmembranową.

Białka kierowane do retikulum mogą być kierowane do jego światła lub bezpośrednio do błon. Białka

rozpuszczalne oraz błonowe wchodzą później w obieg tzw. transportu pęcherzykowego.

Import do macierzy mitochondriów:

Niewielka frakcja białek tych organelli jest produkowana w ich wnętrzu, mimo iż posiadają własną

informację genetyczną oraz własne rybosomy. Większość białek pochodzi z terenu cytoplazmy. Białka

przeznaczone do macierzy mitochondriów mają sekwencję sygnałową na N-końcu. Cechą

charakterystyczną tej sekwencji jest to, iż obdarzona jest ładunkiem dodatnim, czyli występują w niej

reszty aminokwasów zasadowych. Białka te oddziaływają sekwencją sygnałową z receptorem, który

znajduje się w wewnętrznej błonie organelli. Receptor ten w kompleksie z białkiem ulega bocznej

dyfuzji, w wyniku której białko zostaje przeniesione do miejsc, które zawierają tzw. kompleksy

translokacyjne TOM (Translocase of Outer Membrane) oraz TIM (Translocase of Inner Membrane).

Ten kompleks zawiera także kanał translokacyjny, który wymaga przejścia białka w formie

rozwiniętej. W poprzek wewnętrznej błony mitochondriów występuje różnica potencjałów – wnętrze

organelli ma potencjał ujemny. Dzięki temu dodatnio naładowana sekwencja sygnałowa jest

wciągana do wnętrza organelli. Tu także znajdują się białka opiekuńcze. Po imporcie odcinana jest

sekwencja sygnałowa. Import do macierzy mitochondriów jest przykładem importu potranslacyjnego.

Import jądrowy:

W tym przypadku mamy do czynienia z przeniesieniem białka w formie zwiniętej i również

potranslacyjnie. Import ten odbywa się przez pory jądrowe, które posiadają złożoną strukturę. Białko

aby trafiło do jądra musi posiadać tzw. sekwencję lokalizacji jądrowej, która umieszczona jest

wewnątrz sekwencji białka. Sekwencja ta rozpoznawana jest przez receptory importy jądrowego,

zwana czasem importynami. Tworzy się kompleks białko-importyna, który kierowany jest do wnętrza

poru poprzez włókna pora jądrowego. We wnętrzu jądra następnie dysocjacja importowanego białka,

a importyny są przenoszone z powrotem na stronę cytoplazmatyczną. Sekwencje sygnałowe nie

zostają usunięta z importowanego białka.

Zmienność genetyczna:

Mutacje

zmienność

ewolucja

selekcja

Mutacje: dziedziczne zmiany w materiale genetycznym. Większość działa szkodliwie, ale mogą być

też takie, które są neutralne, lub nawet korzystne. Mutacje można podzielić na pewne kategorie:

•

Mutacje punktowe – dotyczą pewnego pojedynczego genu.

•

Mutacje chromosomowe – dotyczą pewnej puli genów.

Podział mutacji ze względu na to, gdzie zachodzą:

•

Mutacje linii somatycznej – zachodzą w linii komórek somatycznych. Nie mogą być

dziedziczone, są jedynie istotne dla ich nosicieli.

•

Mutacje linii płciowej – mutacje te mogą być przenoszone do kolejnego pokolenia.

Podział mutacji ze względu na ich genezę:

•

Spontaniczne

•

Indukowane

Podział ze względu na efekty fenotypowe:

•

Mutacje morfologiczne (widoczne)

•

Mutacje biochemiczne – mutacja narusza pewien szlak biochemiczny, najczęściej powodując

wymaganie pewnej specyficznej substancji, której nie może syntetyzować nosiciel.

Mutacje auksotroficzne – ich nosiciele wymagają pewnych określonych substancji do wzrostu.

Prototrofy – mogą rosnąć na minimalnych podłożach.

Podział mutacji ze względu na funkcje:

•

Mutacje utraty funkcji – zwykle są to mutacje typu recesywnego

•

Mutacje zyskania funkcji – pojawia się skokowo nowa funkcja i zwykle jest kodowana allelami

dominującymi

Możemy także wyróżnić inne kategorie mutacji takich jak:

•

Mutacje warunkowe – ich efekty przejawiają się tylko w określonych warunkach. Np.

mutanty temperaturo wrażliwe.

•

Mutacje supresorowe – mutacje znoszące efekt innych mutacji. Mogą być zlokalizowane w

tym samym genie – są to supresje intragenowe, lub jeśli są zlokalizowane w innym genie to

nazywamy je su presjami intergenowymi.

Np. jeżeli w danym genie dojdzie do insercji nukleotydu, a następnie do delecji – jest to mutacja

supresorowa intragenowa.

Typy mutacji punktowych:

•

Substytucje – polegają na zastąpieniu jednych nukleotydów innymi

•

Insercje pojedynczych nukleotydów (wstawienia)

•

Delecje

Zwykle ostatnie dwa typy (insercje oraz delecje) mają największy wpływ na kodowane białko gdyż

zmieniają ramkę odczytu.

Substytucje możemy podzielić na dwie kategorie:

•

Tranzycje – wymiany nukleotydów purynowych na inne purynowe, lub pirymidynowych

na inne pirymidynowe.

•

Transwersje – wymiany nukleotydów purynowych na pirymidynowe i odwrotnie.

Mutacje te mogą zachować sens wyjściowego kodonu, ale mogą także prowadzić do zmiany sensu –

jakiś aminokwas w sekwencji wyjściowej ulega konwersji w inny w sekwencji zmutowanej. Mamy

także mutacje nonsensowne w wyniku których kodony aminokwasowe zostają zamienione na kodony

STOP. W rezultacie syntetyzowane białka są krótsze.

Otwarta ramka odczytu (ORF): są to sekwencje, które potencjalnie mogą kodować białko.

Przypuszczenie o tym, że sekwencja może kodować białko bierze się stąd, iż mamy sekwencje

startową (kodon AUG), następnie pewną rozsądną ilość kodonów aminokwasowych zakończonych

kodonem STOP. Wszystkie te elementy muszą się znajdować się w tej samej fazie odczytu.

Częstotliwość mutacji: 10

-5

– 10

-7

mutacji na gen na pokolenie ≈0,5 na genom.

Frekwencja mutacji: procent osobników populacji, które są nosicielami danej mutacji.

Genetic load: liczba recesywnych mutacji letalnych, które zawiera jeden osobnik. Każdy z nas kilka z

takich mutacji zawiera. Mutacje te nie eliminują nas, bo są recesywne i mamy je w układzie

heterozygotycznym. Sytuacja zmienia się w przypadku chowu wsobnego – wtedy mutacje letalne

mogą pojawiać się w układzie homozygotycznym i prowadzić do eliminacji swoich nosicieli.

Mutacje spontaniczne: powstają głównie w rezultacie błędów replikacji, naprawy błędów w DNA lub

uszkodzeń DNA (typu dezaminacji i depurynacji).

Mutacje indukowane: powstają w rezultacie działanie określonymi substancjami jak np.

bromodeoksyurydyną, która jest analogiem tymidyny. Istnieją też czynniki modyfikujące nukleotydy

(np. alkilują) co sprawia, że mogą się zachowywać jak inne nukleotydy.

Rekombinacje

Możemy wyróżnić dwie kategorie rekombinacji:

•

Homologiczna – zachodzi pomiędzy sekwencjami, które charakteryzują się dużym

podobieństwem, lecz nie są identyczne.

•

Miejscowo-specyficzne – zachodzą pomiędzy miejscami zdefiniowanymi. Są rekombinacjami

niehomologicznymi (nieuprawnionymi) – wymagane jest to, aby zawierały konkretne odcinki

sekwencji.

•

Transpozycja – pewne elementy genomu mogą zmieniać swoje położenie. Następuje w

rezultacie tego, iż określony element jest przenoszony do innego regionu genomu z reguły

nie posiadającego zdefiniowanej sekwencji.

Rekombinacje homologiczne:

Model Holliday’a – cząsteczki biorące udział w zdarzeniu rekombinacyjnym charakteryzują się

podobieństwem sekwencyjnym. Pierwszym etapem jest tzw. nicking – nacinanie nici. W modelu

Holliday’a nacięcia te następują dokładnie naprzeciwko siebie w cząsteczkach partnerskich. Kolejnym

etapem jest inwazja nici: nić cząsteczki niebieskiej nawiązuje kontakt z nicią cząsteczki

pomarańczowej i odwrotnie. Po

inwazji nici następuje ligacja –

przywrócenie ciągłości obydwu nici

- mamy do czynienia z nićmi o

charakterze

rekombinantowym.

Następnie zachodzi tzw. migracja

miejsca skrzyżowania nici – coraz

większe

segmenty

cząsteczki

niebieskiej stają się elementami

cząsteczki pomarańczowej i vice

versa.

Tworzy

się

krzyżowa

struktura Holliday’a. Struktura ta

jest

rozkładana

poprzez

dwa

zdarzanie:

nacięcie

endonukleolityczne

którym

następuje ligacja. Rozpad struktury

Holliday’a może nastąpić dwojako:

w przypadku numer 1 nacięcia

endonuleolityczne

zachodzą

obrębie

nici

zrekombinowanej

(miejsce b), a następnie dochodzi

do ligacji. Efektem tego jest

powstanie cząsteczek niezrekombinowanych, zawierają jedynie krótki odcinek heterodupleksu. W

drugim scenariuszu może dojść do cięcia w obrębie nici nierekombinantowe (cięcie w płaszczyźnie a).

Efektem tego zajścia jest powstanie cząsteczek rekombinantowych. W tym wypadku także powstaje

niewielki heterodupleks.

Transpozony:

Wśród transpozonów możemy wydzielić klasy:

Transpozony klasy I: tzw. retrotranspozony – w ich ekspansji mamy etap odwrotnej transkrypcji.

Oryginalnie mamy w DNA kopie transpozonu, która ulega transkrypcji na RNA, które przepisywane

jest przez odwrotną transkryptazę na cDNA. To cDNA ulega wstawieniu do nowej lokalizacji

genomowej. Mamy do czynienia z transpozycją na zasadzie kopiuj-wklej: wyjściowa sekwencja

zostaje w pierwotnej lokalizacji oraz pojawia się nowa kopia w innym miejscu. W efekcie rośnie liczba

kopii tego ruchomego elementu genetycznego.

Transpozony klasy II: brak fazy RNA i odwrotnej transkrypcji. Transpozony te mogą przemieszczać się

na zasadzie transpozycji replikatywnej bądź niereplikatywnej. W transpozycji replikatywnej

kodowany jest tzw. kointegrat cząsteczek donora i akceptora transpozonu, który ulega rozkładowi do

cząsteczki donorowej zachowującej transpozon i akceptorowej, która go zyskuje. W przypadku

transpozycji niereplikatywnej dochodzi do wycięcia transpozonu z sekwencji donorowej i wstawiony

do sekwencji docelowej. W tym przypadku liczba kopii transpozonu pozostaje niezmienna

(transpozycja na zasadzie wytnij-wklej).

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 12

Kontrola genetyczna organogenezy kwiatu rzodkiewnika.

Organy kwiatu Arabidopsis tworzą cztery okółki: w pierwszym znajdują się działki kielicha, w

następnym płatki korony, potem: pręciki, a w

ostatnim owocolistki zrośnięte w słupek. Płeć

kwiatu zlokalizowana jest w jego centrum

(okółek 3 zaweira organy męskie, zaś 4: żeńskie).

narysu

kwiatowego

możemy

także

wywnioskować ilość poszczególnych organów.

Kwiat u Arabidopsis formuje się z tzw.

merystemu kwiatowego, który jest merystemem

bocznym

merystemu

generatywnego

(merystemu kwiatostanu). Ten zaś powstaje

przez konwersje merystemu wierzchołkowego

pędu. Poszczególne organy rozwijają się z

zawiązków, które pojawiają się kolejno w

obrębie merystemu kwiatowego odśrodkowo. W

dzikich kwiatach można przewidzieć rodzaj

organu patrząc na jego lokalizację, lecz u Arabidopsis pojawiały się mutanty, które charakteryzowały

się zmienioną lokalizacją poszczególnych organów. Najczęściej takie mutanty otrzymywano poprzez

działanie czynnikiem mutagennym. Ich analiza przyczyniła się do określenia mechanizmu

genetycznego leżącego u podstaw rozwoju kwiatów.

Mutanty Arabidopsis (homeotyczne):

•

Apetala 2 – ap2 (bezpłatkowy)

Okółek 1: działki kielicha

owocolistki lub struktury przypominające liście

Okółek 2: płatki korony

pręciki

Okółek 3: „pręciki”

Okółek 4: owocolistki

•

Pistilata („usłupkowiony”)

Okółek 1: działki kielicha

Okółek 2: płatki korony

działki kielicha

Okółek 3: pręciki

owocolistki

Okółek 4: owocolistki

TRANSFORMACJA

•

Apetala 3 – ap3 (mutant niealleliczny w stosunku do Pistilata, mutant w obrębie innego

locus)

Okółek 1: działki kielicha

Okółek 2: płatki korony

działki kielicha

Okółek 3: pręciki

pseudo-owocolistki (struktury przypominające owocolistki)

Okółek 4: owocolistki

•

Agamous – ag

Okółek 1: działki kielicha

Okółek 2: płatki korony

Okółek 3: pręciki

płatki korony

Okółek 4: owocolistki

działki kielicha + wewnętrzny kwiat

Powyższe mutacje można podzielić na kategorie:

•

Mutacje, które zmieniają okółki zewnętrzne (1 i 2): Apetala 2

•

Mutacje, które zmieniają okółki 2 i 3: Apetala 3 i Pistilata

•

Mutacje zmieniające okółki wewnętrzne 3 i 4: Agamous

Na podstawie tych mutacji sformułowano tzw. model ABC, który tłumaczył jak to się dzieje, iż w

określonych okółkach powstają właściwe im organy. Model ten dzieli merystem kwiatowy na

domeny:

Okółek 1

Okółek 2

Okółek 3

Okółek 4

Sepal

Petal

Stamen

Carpel

Pole A obejmuje okółki zewnętrze: 1 i 2. Pole B obejmuje okółki 2 i 3. Natomiast pole C obejmuje

okółki 3 i 4. O domenowości decyduje to jakie genu ulegają tam ekspresji (geny kontrolujące

organogenezę kwiatów). W obrębie domeny A mamy do czynienia z ekspresją genu apetala 2. W

związku z tym możemy mówić, że apetala 2 warunkuje aktywność A. Pole B to domena gdzie

ekspresji ulegają geny pistilata i apetala 3. Domena C to rejon merystemu gdzie mamy do czynienia z

ekspresją genu agomous (agamous zapewnia aktywność C). Jeżeli w jakimś rejonie kwiatu mamy do

czynienia z ekspresją genu reprezentującego aktywność A (u Arabidopsis jest to ap2) to wtedy w tym

rejonie merystemu kwiatowego powstaną zawiązki działek kielicha. Jeżeli zaś mamy w merystemie

kwiatowym do czynienia z ekspresją zarówno genu o aktywności A jak i B (mamy do czynienia z

zachodzeniem domen A i B na siebie) to wtedy w tym rejonie uformują się płatki korony. W

przypadku ekspresją wspólną aktywności B i C wtedy uformują się pręciki. Aktywność jedynie C

TRANSFORMACJA

prowadzi do rozwoju w tym miejscu owocolistków, a w konsekwencji do powstania po ich zrośnięciu

słupka.

Jeżeli brak aktywności A obserwuje się propagację aktywności C na cały merystem:

Okółek 1

Okółek 2

Okółek 3

Okółek 4

Carpel

Stamen

Carpel

Dlatego w pierwszym okółku będziemy spodziewać się owocolistków (Carpel), w drugim i trzecim

pręcików (Stamen), a w czwartym owocolistków.

W przypadku eliminacji aktywności B:

Okółek 1

Okółek 2

Okółek 3

Okółek 4

----

Sepal

Carpel

W okółku 1 i 2: działki kielicha (gdyż brakuje aktywności B). W okółku 3 także brak aktywności B, więc

tu rozwija się słupek i tak samo w okółku 4.

Eliminacja aktywności C: przy braku aktywności C obserwujemy propagację aktywności A na cały

merystem.

Okółek 1

Okółek 2

Okółek 3

Okółek 4

Sepal

Petal

Sepal

W związku z tym w pierwszym okółku pojawią się działki kielicha, w 2 płatki korony, w 3 znów płatki

korony (brak aktywności C), a w 4 powinniśmy obserwować działki kielicha, ale tak naprawdę

obserwujemy działki kielicha i wewnętrzny kwiat. Fenotyp Agamous nie do końca przystaje do

modelu, co wskazuje na to, iż gen agamous wykazuje dodatkowe funkcje poza kontrolą morfogenezy

w okółkach 3 i 4.

Z analizy tych mutantów widać pewną zależnościami A i C – aktywności te mają charakter

wykluczający się wzajemnie. A nie dopuszcza do ekspresji C w okółkach zewnętrznych, a C nie

dopuszcza do ekspresji A w okółkach wewnętrznych.

W przypadku mutanta, u którego wyłączone zostały wszystkie aktywności (A, B i C) obserwować

będziemy zamiast kwiatów koncentrycznie ułożone organy przypominające liście. Fenotyp

podwójnego mutanta wskazuje na to, że organy kwiatowe (działki kielicha, płatki korony, pręciki i

owocolistki) powstały przez przekształcenia liści.

W rzeczywistości mRNA agamousa jest wykrywane w obrębie 2 wewnętrznych okółków, których

charakter agamous modyfikuje. U mutanta apetala 2 (brak aktywności A) – domena ekspresji

agamousa rozrasta się na cały merystem. Wzór ekspresji agamousa więc jest zgodny z założeniami

modelu ABC.

Ekspresję apetali 2 obserwujemy w komórkach merystemu generatywnego, w obrębie którego

formują się merystemy kwiatowe (posiada szerszą funkcję niż wynikałoby to z modelu ABC) i

obserwuje się jego ekspresję podczas rozwoju wszystkich 4 typów organów kwiatowych. Dystrybucja

mRNA apetali 2 nie jest zgodna z założeniami modelu ABC.

mRNA pistilata oprócz okółków, w których powinniśmy się spodziewać jego ekspresji (2 i 3) ulega

także ekspresji w okółku 4, ale tylko na początku. W późniejszych stadiach rozwoju kwiatu

wykrywamy go tylko w okółkach, które zmienia mutacja pistilata czyli 2 i 3. W tym przypadku także

możemy przyjąć, że wzór ekspresji zgadza się z modelem ABC.

Gen apetala 3 ulega ekspresji tam gdzie powinien wg modelu ABC, czyli w okółku 2 i 3.

Po zsekwencjonowaniu powyższych genów okazało się, że większość tych genów reprezentuje

rodzinę genów MADS-box. Są to geny zawierające kasetę MADS. MADS to skrót złożony z pierwszych

liter nazw białek reprezentujących tę rodzinę. MADS oznacza rejon w obrębie genu, który koduje

pewną domene (domenę MADS). Ma ona długość 56 aminokwasów i odpowiada za wiązanie tych

białek z DNA oraz ich dimeryzację. Białka MADS pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych. Są to

geny zarządzające ekspresją innych genów (genów odpowiedzialnych za formowanie poszczególnych

typów organów). W kasecie MADS znajduje się także motyw aminokwasowy rozpoznawany przez

kinazy białkowy zależne od kalmoduliny (białko regulatorowe czułe na poziom wapnia w komórce).

Niektóre białka MADS mają też tzw. kasetę K, znajduje się bliżej C-końca i odpowiada za interakcję z

innymi białkami.

Sekwencja konsensusowa (kaseta CARG), z która oddziałują białka MADS. Jest specyficzne miejsce w

rejonach regulatorowych genów efektorowych do którego wiążą się te białka.

Oczywiście wyżej wymienione geny to nie wszystkie, które biorą udział w tworzeniu kwiatów u

Arabidopsis, genów tych jest znacznie więcej. Jednym z nich jest gen o nazwie Superman,

charakteryzuje się tym, że potęguje cechy męskie (kosztem cech żeńskich). Gen Superman zapobiega

aktywności B w okółku 4.

Cytoplazmatyczna męska sterylność:

Badania u roślin kalafiora, w których cytoplazma została zamieniona na cytoplazmę gorczycy czarnej

poprzez skrzyżowanie kalafiora z gorczycą („mamusią” jest gorczyca), a następnie mieszańca zapyla

się pyłkiem kalafiora. Geny męskiej sterylności znajdują się na terenie mitochondriów. Rośliny są

sterylne jeżeli ma sterylną cytoplazmę i pewne geny jądrowe, które współpracują z tą cytoplazmą w

formie recesywnej. Jeżeli ma normalną cytoplazmę, albo choć jeden z tych alleli w formie

dominującej wtedy roślina nie jest sterylna.

Metoda pozwalająca na wyłapywanie polimorfizmów mitochondrialnych w kontekście poszukiwania

genów męskiej sterylności: metoda VAMP. Wykorzystuje się w niej biblioteki wektory utworzone dla

tych rozmaitych cytoplazm kalafiora i były one badane przy użyciu starterów dla sekwencji znanych,

które to startery były zakotwiczone w konserwatywnych rejonach genomów mitochondrialnych.

Podobną analizę można przeprowadzić metodą northern. Sondami w tym wypadku powinny być

polimorficzne sekwencje.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 13

Sygnalizacja komórkowa:

W sygnalizacji komórkowej centralną rolę pełnią białka błonowe (błony cytoplazmatycznej), które

przyjmują sygnały docierające do komórki takie jak:

•

Cząsteczki hydrofobowe, które mogą przez błonę dyfundować

•

Jony, które mogą przechodzić przez kanały jonowe

•

Ligandy, najczęściej białkowe, które kontaktują się z odpowiednimi receptorami:

Receptor sprzężony z białkiem G

Białka receptorowe o aktywności kinaz (mają zdolność fosforylacji białek docelowych)

Sygnały

docierające

powierzchni

komórek

często

nazywamy

mianem

sygnałów

pierwszorzędowych. Sygnały te następnie są transformowane na sygnały niesione poprzez

przekaźniki drugorzędowe (secondary messengers). W efekcie zadziałanie jednego z tych czynników

na komórkę pojawia się odpowiedź w postaci reakcji:

•

Fizjologicznej – np. zmiana potencjału błonowego

•

Kontroli ekspresji genów

Cząsteczki hydrofobowe z racji tego, iż mogą swobodnie przechodzić przez błonę komórkową nie

muszą oddziaływać z receptorami. Cząsteczkami sygnałowymi tego typu o największym znaczeniu są:

•

Hormony sterydowe

•

Tlenek azotu

•

Kwas arachidonowy

Substancje te są generowane w komórkach pod wpływem odpowiednich aktywności

enzymatycznych, a następnie dyfundują do komórek docelowych.

Za tworzenie tlenku azotu odpowiada konkretna synteza, a substratem jest arginina:

L-arginina –(NOS)

L-cytrulina + NO

Tlenek azotu może działać poprzez stymulacje cyklazy guanylnowej, która to przeprowadza syntezę

cyklicznego GMP. Cykliczny GMP reguluje aktywność szeregu enzymów i kanałów jonowych.

Kwas arachidonowy generowany jest przez rozpad fosfolipidów przez enzym zwany PLA2 –

fosfolipazę A2. Działa on aktywująco na enzymy o charakterze kinaz.

Hormony sterydowe: np. hormony kory nadnerczy – odbywa się poprzez oddziaływanie tychże

hormonów z odpowiednimi receptorami. Receptor hormonu sterydowego wraz z szeregiem

koaktywatorów stymuluje transkrypcję docelowych genów. Jednym z czynników koaktywujących są

tzw. acetylotransferazy histonowe (acetylacja histonów jest związana z aktywnym stanem

chromatyny).

Kanały jonowe: możemy je podzielić ze względu na to jakie jony obsługują:

•

Wapniowe

•

Sodowe

•

Potasowe

•

I inne

Możemy także stworzyć podział ze względu na tzw. gating czyli sposób otwierania kanałów:

•

Kanały zależne od potencjału

•

Kanały zależne od przyłączenia określonego ligandu

Kanał wapniowy znajdujący się w błonie cytoplazmatycznej aktywowany jest zmianą potencjału.

Kanał wapniowy w błonie retikulum endoplazmatycznego regulowany jest przyłączeniem liganda,

a konkretnie IP

(inozytolo trójfosforan). W wyniku zarówno aktywacji pierwszego jak i drugiego

kanału zwiększeniu ulega cytoplazmatyczne stężenie wapnia. Na terenie cytoplazmy znajduje się cały

szereg enzymów, których aktywność jest zależna od obecności wapnia, zatem wapń jest

przekaźnikiem 2-rzędowym, regulującym aktywność enzymów od niego zależnych.

Receptory sprzężone z białkiem G:

Białka G można podzielić na dwie kategorie:

•

Białka o charakterze heterotrimeru. Z takimi białkami mamy do czynienia w przypadku

receptorów sprzężonych z białkiem G. W jego skład wchodzą podjednostki α, β i γ. Są to

białka wiążące GTP.

•

Monomeryczne białka G (małe) – nie są sprzężone z receptorami

Struktura receptora:

Receptory są to białka integralne wykazujące obecność 7 domen

transmembranowych. Część N-terminalna znajduje się po stronie

zewnętrznej, natomiast C-koniec jest po stronie cytoplazmatycznej.

Stan nieaktywny receptora występuje wtedy gdy brak jest

odpowiedniego liganda. Wtedy wszystkie podjednostki białka G są

połączone ze sobą, a ponadto związaną z podjednostką α cząsteczkę

GDP.

Przyłączenie

liganda

wywołuje

zmiany

konformacyjne

w receptorze, które to przenoszą się na białko G, które z kolei dokonuje

wymiany GDP na GTP. W momencie związania GTP wzajemne

powinowactwo podjednostek białka G spada. W rezultacie białko G

rozpadają się na monomer α oraz dimer β-γ, które to cząsteczki działają

aktywująco na białka efektorowe. Powrót do stanu pierwotnego

odbywa się poprzez hydrolizę GTP do GDP i ortofosforanu. Wśród

białek efektorowych są: cyklaza adenylowa, kanały jonowe, fosfolipazy.

Fosfolipaza C (PLC): dokonuje hydrolizy lipidu błonowego PIP

(fosatydyloinozytol-4,5-difosforan). W rezultacie tej hydrolizy pojawiają

się dwa związki: trifosfoinozytol (IP

) i diacyloglicerol (DAG). IP

działa

stymulująco na otwarcie kanałów wapniowych znajdujących się

w retikulum endoplazmatycznym, w rezultacie czego z retikulum do cytoplazmy uwalniany jest

wapni, który łączy się z białkiem zwanym aloluminą (?). Ów kompleks działa na kinazy białkowe, które

z kolei fosforyzują białka docelowe. Natomiast diacyloglicerol działa bezpośrednio na kinazę białkową

C aktywując ją.

Receptory o aktywności kinaz: są to błonowe białka integralne z jedną domeną transmembranową.

Po stronie zewnątrzkomórkowej mają koniec N, a po stronie cytoplazmatycznej mają domenę C-

terminalną. Domena cytoplazmatyczna odpowiada za aktywność kinazową. Uaktywnienie receptora

następuje pod wpływem liganda. Pojawienie się takiego liganda w pobliżu komórki powoduje

dimeryzację takiego receptora (dwie cząsteczki receptora wiążą ligand). Prowadzi to do fizycznego

zbliżenia domen enzymatycznych (kinazowych) po stronie cytoplazmatycznej. Zbliżenie to prowadzi

do tzw. autofosforylacji, czyli każda z tych domen enzymatycznych fosforyluje drugą cząsteczkę

białka. Do takiego ufosforylowanego białka mogą się wiązać inne białka, które w rezultacie także

ulegają fosforylacji i mogą np. działać aktywująco na transkrypcję po przeniesieniu do jądra

komórkowego. Mogą też aktywować kinazy białkowe.

Transpozony i ich znaczenie:

Transpozony możemy rozpatrywać jako szczególnego rodzaju mutageny, które mogą się

wbudowywać do sekwencji kodującej genu lub do sekwencji regulatorowych i może mieć to wpływ

na ekspresję tego genu w dwojaki sposób: poprzez unieczynnienie genu (jego nokaut) lub może

osłabić jego ekspresję (szczególnie gdy wstawienie transpozonu nastąpi w sekwencji regulatorowej).

Mutacje powodowane przez transpozony mają często skłonność do tzw. rewersji, które zachodzą

w rezultacie wycięcia transpozonu z jego nowej lokalizacji. Jeżeli to wycięcie nastąpi nieprecyzyjnie to

także może samo w sobie mieć efekt mutacji.

Bardzo wiele cech fenotypowych ma związek z aktywnością transpozonów. Np. okazało się, że biała

barwa kwiatu groszku, który badał Mendel, ma związek ze wstawieniem transpozonu w obręb

sekwencji genu odpowiadającego za produkcję barwnika. Mutacje transpozonowe często wywołują

różne choroby. Należą do nich m.in.: hemofilia (poprzez unieczynnienie genów kodujących czynniki

krzepnięcia), ostry niedobór odporności sprzężony z chromosomem X, dystrofia mięśniowa

Duchenne’a.

Kolejnym znaczeniem transpozonów jest promocja zdarzeń rekombinacji homologicznej.

Poszczególne kopie transpozonów to nic innego jak odcinki homologicznych sekwencji, które mogą ze

sobą rekombinować. W następstwie transpozycji mogą pojawić się: duplikacje, translokacje, delecję

i inwersje.

Transpozony przenoszące się poprzez transpozycję replikatywną odpowiadają za rozrost

objętościowy genomu (dotyczy to głównie retrotranspozonów).

Transpozony można wykorzystać do klonowania genów. Metoda z ich wykorzystywaniem to tzw.

transpozone tagging. Transpozon jest często sekwencją znaną badaczom, można go wtedy

wykorzystać jako swoistą etykietę do powielenia sekwencji, w obręb której ów transpozon się

wbudował.

Biorąc na przykład gen odpowiadający za barwę pomidora, załóżmy, że u tej rośliny występuje

transpozon, którego aktywność możemy sprowokować. Aktywność transpozonową można wywołać

stresem (np. wystawić na działanie chłodu). W efekcie potomstwie takich roślin możemy odnaleźć

mutanty, które tego barwnika nie produkują. Taki mutant ma kopię transpozonu wstawioną w obręb

genu kodującego barwnik. Dlatego, iż znamy sekwencję transpozonu możemy użyć jej jako sondy lub

jako miejsce w obrębie którego kotwiczymy startery do PCR.

Kolejnym zastosowaniem transpozonów może być wykorzystanie ich w charakterze markerów. Jeśli

w populacji istnieją osobniki, które mają w swym genomie transpozony i te transpozony

charakteryzują się aktywnością to będziemy odnajdywali polimorfizm miejsc insercji. W obrębie

pewnych loci u części osobników będziemy obserwowali wbudowanie transpozonu, a u części nie.

Markery te posiadają tę wadę, że często insercje transpozonowe nie są stabilne, tzw. obserwujemy

wycinanie transpozonów z ich pierwotnych miejsc.

Rekombinacja miejscowo-specyficzna:

U faga λ można wyróżnić dwa typy rozwojów. Jednym z nich jest typ lizygeniczny: fag λ ulega

integracji z chromosomem E. coli. Miejsce tej integracji jest ściśle określone: w genomie bakterii

miejsce to nazywane jest attB, zaś w genomie faga: attP. Są to krótkie sekwencje

(kilkunastonukleotydowe), które to rozpoznawane są przez odpowiednie białka. Do procesu

integracji, czyli utworzenia stadium profaga, potrzebne jest białko katalizujące ten proces: integraza.

Do procesu odwrotnego prócz integrazy potrzebny jest także inny czynnik fagowy: xis (białko

wycinające). Obydwa procesy (integracji i wycięcia) wymagają też współdziałania białka bakteryjnego

IHF (integration host factor).

Kolejnym przykładem rekombinacji miejscowo-specyficznej może być rekombinacja, która odpowiada

za różnorodność przeciwciał w naszym ustroju.

Przeciwciała:

Przeciwciała są to białka (a właściwie glikoproteiny), które pojawiają się w ustroju w odpowiedzi na

antygeny, z którymi tworzą kompleksy usuwane przez fagocytozę. Przeciwciała produkowane są

przez limfocyty. Rysunek obok przedstawia w zasadzie jednostkę strukturalną. Właściwe przeciwciało

może składać się z jednej lub z większej ilości

takich cząsteczek. Każda taka jednostka złożona

jest z czterech łańcuchów polipeptydowych:

z dwóch łańcuchów ciężkich, oraz z dwóch

lekkich. Poszczególne łańcuchy są połączone ze

sobą

mostkami

disiarczkowymi.

Wśród

przeciwciał wydziela się 5 klas:

•

Klasa przeciwciała zależy od tego jaki ma typ

łańcucha ciężkiego i w związku z tym determinuje też ile jednostek składa się na całe przeciwciało.

Immunoglobuliny G składają się tylko z jednej podjednostki. W takiej cząsteczce przeciwciała możemy

Fragment FC

Fragment FAB

wyróżnić pewne domeny, takie jak np. cztery domeny FAB (Fragment of antigene binding) – miejsca

wiązania antygenu. W jej skład wchodzi łańcuch lekki i część łańcucha ciężkiego. W skład takiej

cząsteczki wchodzi także jedna domena FC (fragment krystalizujący). Tworzony jest jedynie przez

część łańcucha ciężkiego i znajduję się „u podstawy” przeciwciała. Pomiędzy tymi domenami istnieje

coś w rodzaju zawiasu. Ich połączenie charakteryzuje się pewną elastycznością. Sprawia to, że

cząsteczka przeciwciała może dostosowywać się w pewnych granicach do powierzchni antygenu.

BIOLOGIA MOLEKULARNA – WYKŁAD 14

Przeciwciała – ciąg dalszy…

Cząsteczkę przeciwciała tworzą łańcuchy ciężkie i lekkie

(zaznaczone na rysunku). Łańcuchy są połączone ze

sobą za pomocą mostków di siarczkowych. W

stabilizacji struktury przeciwciała biorą także udział

wiązania niekowalencyjne.

Wielkość łańcucha ciężkiego to 55kDa, natomiast

lekkiego 25kDa. Łańcuch lekki jest złożony z 220 reszt

aminokwasowych, które tworzą dwa regiony: zmienny

i stały (zajmują mniej więcej jednakowy region

łańcucha). Region zmienny znajduje się przy końcu N,

stały zaś przy C-końcu. W ustroju mamy łańcuchy

lekkie, które są produktami różnych genów (różnych

loci) i znajduje to odzwierciedlenie w typach łańcucha

lekkiego κ oraz λ. Łańcuch ciężki złożony jest z 440 reszt aminokwasowych i tworzy go jeden region

zmienny oraz trzy regiony stałe (w przypadku immunoglobuliny G). Łańcuch ciężki kodowany jest

przez jeden locus (dwa allele na chromosomach homologicznych – ojcowski i mateczny). W

strukturze przeciwciała części zmienne, zarówno łańcucha ciężkiego jak i lekkiego, łączą się ze sobą

formując miejsce wiązania antygenu. Te rejony odpowiadają za rozmaitość miejsc wiązania antygenu,

jakie w ustroju występują. Zmienność sekwencji jest nierównomiernie rozłożona w obrębie części

zmiennych – koncentruje się głównie w rejonach CDR (Regiony Determinujące Komplementarność).

Organizacja loci kodujących łańcuch ciężki:

Locus kodujący łańcuch ciężki ma strukturę modułową, złożony jest z segmentów. Od końca 5’ mamy

50 do 100 regionów

zwanych zmiennymy (Veriable) w skrócie V. Za nimi wstępuje 12 regionów D

(diversity – różnorodności). Następnie możemy wyróżnić 4 regiony J (joining – odpowiadające za

łączenie). Poniżej znajdują się regiony kodujące regiony stałe łańcucha ciężkiego – C.

Poszczególne typy regionów C determinują rodzaj części stałych łańcucha ciężkiego, a przy okazji

determinują wagę przeciwciała. Region C składa się z określonych rejonów: mamy jeden rejon μ –

jeżeli ten rejon utworzy dojrzały gen przeciwciała to wtedy przeciwciało będzie należało do klasy IgM,

Liczba regionów w obrębie locus podana jest dla locus myszy. Poszczególne gatunki różnią się ilością

poszczególnych regionów.

następnie mamy region δ – jeżeli on wejdzie w skład dojrzałego genu to będzie produkowane

przeciwciało klasy IgD. Następnie mamy 4 regiony γ – trafienie jednego z nich do dojrzałego genu

powoduje formowanie przeciwciała IgG (przeciwciał klasy G możemy wyróżnić 4 typy, w zależności

od tego który rejon γ trafi do dojrzałego genu). Następnie znajduje się region ε – jego obecność w

dojrzałym genie tworzy przeciwciało IgE. Na końcu znajduje się region α i determinuje od

powstawanie przeciwciał klasy A. [Poniższy rysunek różni się nieco od opisu].

•

Region V koduje najbardziej N-temrinalną część łańcucha z dwoma pierwszymi regionami

nadzmiennymi.

•

Region D koduje część trzeciego regionu nadzmiennego

•

Region J koduje pozostałą część trzeciego regionu nadzmiennego.

•

Regiony C kodują część stałą łańcucha ciężkiego.

Cały powyższy opis dotyczy genu w formie wyjściowej – genu, który jeszcze nie produkuje

funkcjonalnego łańcucha ciężkiego. Powstanie takiego dojrzałego genu wiąże się z zajściem pewnych

zdarzeń rekombinacyjnych. Pierwsze zdarzenie rekombinacyjne łączy konkretny region D z wybranym

regionem J. Jest to tzw. DJ joining.

Gen po DJ joining ulega kolejnemu zdarzeniu rekombinacyjnemu, które łączy powstały wcześniej

region DJ z którymś z regionów V. Proces ten określamy mianem VDJ joining:

Produktem tych dwóch rekombinacji jest gen funkcjonalny, który może już produkować łańcuch

ciężki immunoglobuliny.

Powyższe rekombinacje są rekombinacjami miejscowo-specyficznymi, dlatego, że w rekombinacji

biorą udział krótkie zdefiniowane sekwencje zwane RSS (Sekwencje Sygnału Rekombinacyjnego),

które znajdują się w otoczeniu tych rekombinujących segmentów. Te sekwencje rozpoznają

specyficzne białka zwane RAG1 i RAG2, które katalizują proces rekombinacji. Istotnym produktem

rekombinacji jest tzw. złącze kodujące, czyli zmodyfikowany przez rekombinacje locus dla łańcucha

ciężkiego (rekombinacja VDJ). Produktem rekombinacji jest także sekwencja oddzielająca dany

segment V od segmentu DJ. Sekwencja ta zostaje usunięta, rekombinacja więc prowadzi do delecji

tego fragmentu nazywanego złączem sygnałowym. Rekombinacje te zachodzą na poziomie DNA. Ich

produktem jest dojrzały gen ulegający transkrypcji. Powstaje transkrypt pierwotny ulegający obróbce

z wycięciem intronu i powstaje mRNA, którego translacja prowadzi do powstania łańcucha ciężkiego.

Różne klasy przeciwciał (inne niż IgM) będą produkowane wtedy gdy dojdzie do jeszcze jednej

rekombinacji określanej mianem class-switching (przełączanie klas). W tym przypadku segment VDJ

w wyniku rekombinacji zostaje podpięty pod inny niż Cμ region kodujący część stałą:

Przełączanie klas zmienia klasę przeciwciała determinowaną przez typ części stałej łańcucha

ciężkiego, jednakowoż ta rekombinacja nie zmienia specyficzności produkowanego przeciwciała,

dlatego, że część zmienna pozostaje taka sama.

Źródła zmienności przeciwciał w ustroju:

•

Rekombinacja, która układa w jedną całość cegiełki (regiony locus kodującego łańcuch ciężki)

w rozmaitych konfiguracjach.

•

Różnorodność złączy: w czasie rekombinacji złącza pomiędzy tymi segmentami mogą być

modyfikowane i mimo tego produkowane są funkcjonalne białka we wszystkich ramkach

odczytu.

•

Mutacje pojawiające się w obrębie segmentów kodujących w obrębie kodującym część

zmienną łańcucha ciężkiego czy lekkiego.

•

Dobór łańcuchów ciężkich i lekkich. U myszy np. może powstać 800 typów łańcucha typu κ, 5

typu λ, 7200 typów łańcucha ciężkiego. To wszystko daje razem ok. 6 mln możliwych domen

wiążących antygen w kompletnej cząsteczce przeciwciała.

Te wszystkie zmiany zachodzą w limfocytach B przed kontaktem z antygenem, mamy więc

preegzystencję zmienności genetycznej w komórkach układu immunologicznego. Niektóre komórki

typu B stykają się z antygenem, w odpowiedzi na to zdarzenie następuje ich proliferacja. Klony

komórki zetkniętej z antygenem produkują dany rodzaj przeciwciała. W czasie proliferacji komórek B

działa enzym zwany AID (dezaminaza indukowana przez aktywację). Dezaminaza ta działa podobnie

jak enzymy odpowiedzialne za redagowanie RNA. Tutaj następuje redagowanie odcinków DNA, które

kodują regiony nadzmienne – prowadzi przekształcenie nukleotydów cytydynowych w urydynowe.

Tego typu konwersje są korygowane i ta korekta jest nieprecyzyjna i prowadzi do powstawania

mutacji w obrębie rejonów kodujących części zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich. Zmiany te często

prowadzą do powstania subklonów komórek typu B, które charakteryzują się jeszcze lepszym

dopasowaniem do antygenów niż przeciwciała produkowane przez komórki pierwotne. Proces ten

nazywany jest dojrzewaniem powinowactwa (do powierzchni antygenu).

Część zdarzeń rekombinacyjnych, mimo elastyczności systemu, prowadzi jednak do powstania

niefunkcjonalnych genów. Jeśli mamy do czynienia z udaną rekombinacją to ona hamuje następne.

Jeżeli więc w przypadku 2 loci w komórce diploidalnej, które kodują łańcuch ciężki (od ojca i matki)

udana rekombinacja zajdzie w obrębie jednego z nich to zdarzenie to hamuje rekombinacje drugiego

locus na chromosomie homologicznych. Mamy tu do czynienia z tzw. wyłączeniem allelicznym, czyli

faktem, iż dana komórka produkuje tylko jeden typ przeciwciał o danej specyficzności. Jeżeli

zdarzenia rekombinacyjne prowadzą do stanu niefunkcjonalnego genu dojrzałego, wtedy

uruchamiane są rekombinacje na drugim chromosomie i istnieje szansa, że zakończy się to sukcesem.

Podobnie jest z łańcuchami lekkimi. Najpierw zachodzi rekombinacja w jednym z locus kodującym

łańcuch lekki typu κ. Jeżeli powstały allel jest niefunkcjonalny to rekombinacji ulega drugie locus.

Polimerazy DNA:

1) Polimeraza I E.coli

Aktywność:

•

Polimeraza 5’ ⇒3’

•

Egzonukleaza 3’⇒5’ (funkcja korekcyjna)

•

Egzonukleaza 5’⇒3’ (usuwanie starterów przed fragmentami Okazaki)

Zastosowanie:

•

synteza drugiej nici cDNA,

•

znakowanie DNA metodą translacji nacięć ( Nick-translation).

Nick-translation: DNA traktuje się DNAzą I w obecności magnezu. Wprowadza to do nici DNA tzw.

nicks (nacięcia). Nie mylić z gaps (lukami) – sytuacją gdzie brakuje nukleotydów. Jeżeli do preparatu z

nacięciami dodamy polimerazę I wraz z substratami, z których jeden jest wyznakowany to końce 3’ w

obrębie nacięcia będzie wykorzystywany przez polimerazę I jako miejsce rozbudowywania.

Jednocześnie koniec 5’ będzie symultanicznie trawiony. W rezultacie tego działania przerwa ulega

przesunięcia (translacji). Wraz z translacją nacięcia rośnie segment DNA syntetyzowanego przy użyciu

znakowanego prekursora.

2) Fragment Klenowa polimerazy I E.coli:

Na bazie polimerazy I można uzyskać tzw. fragment Klenowa polimerazy I E.coli (część enzymu która

wykazuje funkcje polimerazy i korekcyjną nie ma aktywności Egzonukleaza 5’⇒3’, uzyskuje się ją

przez usunięcie proteolityczne fragmentu polimerazy (normalnej), albo na drodze rekombinacyjnej,

do wektora wprowadza się fragment a nie cały gen, robi się to bo Egzonukleaza 5’⇒3’ niszczy

startery co jest niekorzystne, może też usuwać grupę 5’ fosforanową utrudniając ligację), historyczne

był wykorzystywany w PCR, ale nie jest termostabilny, więc dziś się go nie używa.

Aktywność:

•

Polimeraza 5’⇒3’

•

Egzonukleaza 3’⇒5’ (funkcja korekcyjna).

Zastosowanie:

•

wypełnianie i znakowanie schowanych końcówek 3’ dsDNA,

tępienie końców przed ligacją

znakowanie przy końcu 3’

•

syntetaz drugiej nici cDNA,

•

sekwencjonowanie DNA metodą dideoksypochodnych (obecnie rzadko stosowane),

•

miejscowo-specyficzna mutageneza z wykorzystaniem syntetycznych oligonukleotydów, z
reguły polega to na wprowadzeniu fragmentu DNA, który chcemy zmutować do wektora i
zadaniu tej mutacji w postaci oligonukleotydu. Wprowadzony oligonukleotyd poddaje się
annealingowi z wyjściowym DNA. Następnie działamy fragmentem Klenowa, który
syntetyzuje drugą nić począwszy od końca 3’. Takie cząsteczki wprowadza się do bakterii i
otrzymuje się klony.

•

znakowanie DNA metodą przypadkowych starterów (random priming) metoda alternatywna

do metody translacji nacięć. Używa się heksametrów zawierających wyznakowane

nukleotydy. Trzeba mieć DNA, które chcemy oznakować – wprowadzamy je do probówki i

poddajemy denaturacji. Losowe startery są to z reguły krótkie startery o sekwencji dobranej

losowo. Dodaje się je do denaturowanego DNA. Nici DNA równomiernie są pokryte po

annealingu tymi starterami. Po dodaniu fragmentów Klenowa startery są wydłużane – te

syntetyzowane sekwencje w przypadku dodania znakowanego prekursora do mieszaniny

będą miały charakter sondy.

3) Polimeraza Taq, izolowana z Thermous aqraticus.

Aktywność

•

Polimeraza 5’⇒3’

•

Egzonukleaza 5’⇒3’ (słaba)

Zastosowanie:

•

Amplifikacja DNA (PCR)

5’

3’

•

Znakowanie DNA radioizotopami, digoksygeniną i biotyną

•

Sekwencjonowanie DNA

Uwaga: Okres półtrwania w 95 wynosi ponad 40 C min, frekwencja błędów wynosi 2.2*10

nukleotyd na cykl. Wykorzystuje się też aktywność egonukleazową w procesie Real Time PCR =

kinetic PCR = quantitative PCR technika ta, pozwala określić ile kopi docelowej sekwencji jest w

matrycy. Wadą tej polimerazy jest brak funkcji korekcyjnej. Dlatego czasem nie można jej

wykorzystywać. Np. przy produkcji białek rekombinantowych, inną wadą jest słaba procesywność.

Generuje produkty które na końcu 3’ ma nukleotydy adeninowe. Przy klonowaniu ekspresyjnym jest

to ważne. Polimeraza Taq nie prowadzi do niespecyficznej germinacji, gdyż działanie w wysokiej

temperaturze ogranicza powstawanie struktur 2-rzędowych. Wysoka temperatura syntezy pozwala

także na utrzymanie stanu denaturacji DNA.

4) Polimeraza Pfu Izolowana z hypertermofilnej archebakterii Pycoccoccus furiosus.

Aktywność

•

Polimeraza 5’⇒3’

•

Egzonukleaza 3’⇒5’ (funkcja korekcyjna)

Zastosowanie

•

Wysoko-wierne reakcjie PCR i wydłużanie starterów

Uwagi: zachowuje 95% aktywności po 2h inkubacji w 95 C frekwencja błędów wynosi 2.6*10

nukleotyd na cykl, generuje tępo zakończone produkty.

Czasem stosuje się 2 polimerazy naraz: Taq + Pfu: np. przy powielaniu długich odcinków DNA – long

PCR. Do long PCR stosuje się także specjalny bufor reakcyjny.