AGROBIOTECHNOLOGIA

Tematyka wykładów

1. Wprowadzenie. Struktura i replikacja DNA, architektura genu, struktura i rodzaje

RNA, transkrypcja

2. Rola i budowa białek. Translacja.
3. Horyzontalne przekazywanie genów u bakterii (transformacja, koniugacja,

transdukcja)

4. Rekombinacja i klonowanie DNA, enzymy restrykcyjne
5. Wektory do klonowania DNA (podział wektorów). Klonowanie i subklonowanie

genu,

6. Metody wprowadzania DNA do komórki bakteryjnej
7. Biblioteki (banki) genowe – zasada i cel konstrukcji. Biblioteki genomowe i

ekspresyjne

8. Biotransformacje roślin, definicje, bezpośrednie wprowadzanie DNA do roślin
9. Uzyskiwanie roślin transgenicznych, kultury in vitro, znaczenie oraz celowość
10. Rozpoznawanie i identyfikacja organizmów transgenicznych, geny markerowe i

reporterowi, identyfikacja przez PCR analizę białek, charakterystyka transgenu.

11. Praca z GMO, perspektywy badań i zastosowań, reguły prawne

WYKŁAD 1

Cel i zadania przedmiotu:
- teoretyczne wprowadzenie oraz przedstawienie technik biologii molekularnej od
sklonowania genu z organizmu źródłowego do otrzymania organizmu transgenicznego.

Biotechnologia- to interdyscyplinarna dziedzina nauki, obejmująca różne kierunki
technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych. W szczególności
obejmuje procesy biosyntezy i biotransformacji przebiegające przy udziale drobnoustrojów,
kultur tkankowych (roślinnych i zwierzęcych) in vitro oraz enzymów, a także izolację tak
otrzymywanych bioproduktów.

Podstawowy cel współczesnej biotechnologii:
- modyfikacja mikroorganizmów oraz komórek roślinnych i zwierzęcych tak, aby procesy
życiowe nowych organizmów były szybsze, wydajniejsze, tańsze i dostarczały nowych
metabolitów.

Kolorowa biotechnologia:
-

zielona

– związana z rolnictwem, obejmująca stosowanie metod inżynierii genetycznej w

celu doskonalenia produkcji roślinnej i zwierzęcej
-

czerwona

– wykorzystywana w ochronie zdrowia (pozyskiwanie organów do przeszczepów

od zwierząt, pozyskiwanie biofarmaceutyków przy udziale mikroorganizmów)
- biała – wykorzystująca systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie
środowiska
-

fioletowa

– związana z zagadnieniami społecznymi i prawnymi

-

niebieska

– poświęcona problematyce wód (jezior, oceanów, mórz)

Pojęcie agrobiotechnologii odnajdujemy w trzech typach rolnictwa:
- tradycyjnego – dającego wysokie plony dzięki nawozom i środkom ochrony roślin
- ekologicznego – wykorzystującego środki pochodzenia biologicznego i mineralnego
nieprzetworzonych technologicznie, wykluczone stosowanie środków chemicznych i
inżynierii genetycznej
- typ wykorzystujący inżynierię genetyczną i inne osiągnięcia współczesnej biotechnologii

Biotechnologia w Polsce (2007)
- 50% - biotechnologia czerwona (ochrona zdrowia, diagnostyka)
- 35% - biotechnologia biała (m.in. fermentacja, biosynteza farmaceutyków, bioremediacja
terenów skażonych)
- 15% - biotechnologia zielona (m.in. produkty dla rolnictwa)

DNA – kwas dezoksyrybonukleinowy
- w skrócie DNA, wielkocząsteczkowy organiczny związek chemiczny należący do kwasó12.
nukleinowych. Pełni rolę nośnika informacji genetycznej organizmów żywych. Występuje w
jądrze komórkowym, mitochondriach, chloroplastach.

Doświadczenia Mendla (1865)
Mendel używał groszku, rośliny wyjątkowo udanej jako model genetyczny (łatwo odróżnialne
cechy jakościowe kodowane przez pojedyncze loci, różne cechy na różnych chromosomach,
łatwość hodowli, liczne potomstwo).

I prawo Mendla
Każda gameta wytwarzana przez organizm posiada tylko jeden gen z danej pary alleli
II prawo Mendla
Geny należące do jednej pary alleli są dziedziczone niezależnie od genów należących do
drugiej pary alleli

Poszukiwanie materiału genetycznego
- II poł. XIX w. Grzegorz Mendel
- chromosomowa teoria dziedziczności Tomasza Morgana (1920)
- transformacja bakterii F. Griffith (1928)
- doświadczenie Avery’ego i wsp. (1944)
- doświadczenie Hersheya i Chase’a (1952)
- opracowanie przestrzennego modelu struktury DNA przez Watsona i Cricka (1953)

Założenia Morgana:
- geny są umieszczone na chromosomach
- każdy chromosom ma wiele genów
- są chromosomy związane z płcią
- geny znajdujące się na jednym chromosomie są dziedziczone łącznie
- geny znajdujące się na różnych chromosomach są dziedziczone oddzielnie

Zostały sformułowane trzy prawa (wg Morgana):
- geny są ulokowane na chromosomach. Każdy allel z pary znajduje się na chromosomie
homologicznym, miejsce to nazywamy locus.
- rekombinacja ma miejsce miedzy homologicznymi chromosomami
- ilość rekombinacji pomiędzy allelami dwóch różnych genów jest proporcjonalna do
odległości między nimi na chromosomie
Doświadczenie Griffitha (1928)
- transformacja – zjawisko przekazywania genów jednej bakterii do drugiej
- F. Griffith dysponował dwoma szczepami bakterii, jeden szczep pozbawiony był otoczki
białkowej, drugi szczep – śmiertelny – zawierał otoczkę białkową
- Griffith infekował myszy szczepem pierwszym i drugim – po pierwszym myszy chorowały,
ale żyły – po drugim umierały
- drugi szczep denaturował, wprowadzał do myszy i one nie zdychały
- następnie wprowadzał mieszaninę zdenaturowanego szczepu śmiertelnego i szczepu
pierwszego, co doprowadziło do śmiertelności myszy
- w ciele myszy infekowanych mieszaniną bakterii znajdowały się komórki bakteryjne
zawierające otoczkę białkową (transformacja – przekazanie genów otoczki białkowej ze
szczepu śmiertelnego do szczepu łagodnego)

Doświadczenie Avery’ego i wsp. (1944)
- zjadliwe i i niezjadliwe kom. bakteryjnych zapalenia płuc
- ze szczepu śmiertelnego izolowali DNA, polisacharydy i białka i tymi 3 frakcjami
transformowali łagodny szczep bakteryjny
- transformowanymi komórkami infekowali myszy
- tylko komórki transformowane kwasem DNA nabierały właściwości uśmiercających
- ani białka ani polisacharydy nie zmieniały informacji genetycznej komórek bakteryjnych
WNIOSEK: jedynie frakcja zawierająca DNA może zmienić genetycznie właściwości
transformowanych komórek.

Doświadczenie Hersheya i Chasa’e (1952)
-do komórki bakterii wnika jedynie DNA i ono jest nośnikiem infekcji.
- bakteriofagi hodowane na dwóch różnych pożywkach, jedna pożywka – z radioaktywną
siarką, druga z radioaktywnym fosforem.
- infekcja komórek bakteryjnych bakteriofagami z tych dwóch różnych pożywek
- kapsyd odłącza się od kom. bakteryjnej, zostaje na zewnątrz, następnie próbowano oddzielić
komórki bakteryjne od otoczek białkowych poprzez wirowanie
- w doświadczeniu z radioaktywną siarką w pellecie (osad na dnie probówki) nie było
radioaktywności, natomiast w supernatancie była – siarka była wbudowana do kapsydu,
podczas infekcji siarka pozostawała na zewnątrz komórki
- fosfor radioaktywny był w osadzie komórek na dnie probówki (pellet), natomiast w
supernatancie go nie było – fosfor był wbudowany do kwasu nukleinowego, fosfor wchodził
do wnętrza komórek

Doświadczenie Watsona i Cricka (1953)
- opracowali przestrzenny model struktury DNA na podstawie rentgena

DNA:
- liniowy, nie rozgałęziony polimer
- monomery to nukleotydy
- dwa łańcuchy biegnące równolegle
- owijają się wokół własnej osi, tworząc prawoskrętną helisę
- koniec 5’ zakończony grupą fosforanową
- koniec 3’ zakończony grupą hydroksylową

DNA - budowa:
- fosforanowo – węglowodanowy łańcuch główny
- węglowodan
- reszta fosforanowa
- zasada azotowa (purynowe: adenina, guanina - dwupierścieniowe, pirymidyny: cytozyna,
uracyl (kw. rybonukleinowe), tymina - jednopierścieniowe)

Komplementarne pary zasad:
- tymina – adenina – podwójne wiązanie wodorowe
- cytozyna – guanina – potrójne wiązanie wodorowe

Cukier - pentozy:
- ryboza
- deoksyryboza

Nukleotyd:
- wiązanie glikozydowi (tymina – deoksyryboza)
- wiązanie estrowe (cukier – reszta kwasy fosfor.)
- podjednostka kwasów DNA i RNA

- w łańcuchu połączone są wiązaniem fosfodiestrowym (powstaje przy udziale grupy
fosforanowej na końcu 5’ i grupy hydroksylowej przy 3 węglu

Kwasy rybonukleinowe: RNA
- polimery kondensacyjne rybonukleotydów, występujące zarówno w jądrze komórkowym
jak i cytoplazmie. W komórce występuje wiele klas kwasów rybonukleinowych różniących
się pełnioną funkcją, a także masą cząsteczkową i strukturą. Wszystkie RNA są jednoniciowe.

RNA:
- kodujące – 4% całości: pre – mRNA  mRNA
- niekodujący – 96%: rRNA, tRNA, tmRNA oraz różne inne rodzaje RNA, eukariotyczne:
snRNA, snoRNA, scrRNA

Rodzaje RNA:
- mRNA – informacyjny RNA, przenosi informację dotyczącą budowy białek z jądra na
rybosomy, u organizmów eukariotycznych dojrzewanie mRNA polega na: dołączaniu
czapeczki na końcu 5’, poliadenylacji końca 3’ (dołączanie ogona poliadenylowego),
wycinaniu intronów
- rRNA – rybosomowy RNA, wchodzi w skład rybosomów, najliczniejsza klasa RNA,
stanowi około 80% całego RNA, dojrzewanie polega na wielostopniowych procesach
rozrywania wiązań przez specyficzne nukleazy
- tRNA – transportujący RMA, podczas biosyntezy białka doprowadza do rybosomów
kolejne aminokwasy, tworzy strukturę wtórną tzw. „liść koniczyny”, dojrzewanie polega na
cięciu specyficznymi nukleazami i obróbce chemicznej
- snRNA – mały jądrowy RNA, bierze udział w splicingu genów oraz pełni funkcje
enzymatyczne (u eukariotycznych)
- snoRNA – mały jąderkowy RNA, bierze udział w dojrzewaniu pierwotnych transkryptów
RNA, w enzymatycznych modyfikacjach RNA (u eukariotycznych)
- scRNA – mały cytoplazmatyczny RNA, bierze udział w kierowaniu białek po ich syntezie,
tworzy z białkami rybonukleoproteiny (u eukariotycznych)
- tmRNA – transportująco – informacyjny RNA, wygląda jak tRNA przyłączony do mRNA,
dodaje krótkie etykietki peptydowe do białek, które zostały nieprawidłowo zsyntetyzowane,
naznaczając je do degradacji (u prokariotycznych)


Porównanie DNA i RNA
DNA

RNA

- nośnik informacji genetycznej

realizuje informację genetyczną

- jądro, mitochondria, plastydy

- cytozol, jądro, plastydy, mitochondria

- budowa pierwotna: A, T, G, C, 2-
deoksyryboza, gr. fosforanowa

- budowa pierwotna: A, U, C, G, ryboza, gr.
fosforanowa

- budowa wtórna: podwójna helisa, struktura
III i IV – rzędowa

budowa wtórna: jednoniciowe, struktura III
rzędowa

- białka histonowe

- nie ma połączeń z białkami (nie chodzi o
rRNA)

Właściwości chemiczne i fizyczne kwasów nukleinowych:
- hydroliza- rozpad kwasów nukleinowych na podstawowe składniki: zasadę azotową, cukier,
resztę kwasu fosforanowego pod wpływem silnych kwasów (nadchlorowy) i wysokiej
temperatury. Jest to proces nieodwracalny.
- denaturacja (topnienie) – zerwanie metodami chemicznymi lub fizycznymi oddziaływań
niekowalencyjnych, takich jak wiązania wodorowe między komplementarnymi parami zasad.
Proces odwracalny.
- renaturacja – powrót denaturowanej cząsteczki do stanu naturalnego (np. gdy gotujemy 15
min cząsteczki kwasu Dna, później zostawimy je w temp. pokojowej – one renaturują-

powolne ochładzanie, w przypadku szybkiego ochłodzenia np. na lodzie cząsteczki kwasy
pozostałyby w postaci jednoniciowej)
- hybrydyzacja – połączenie przez tworzenie par dwóch komplementarnych nukleotydów.
Dotyczy jednoniciowych cząsteczek DNA

Genom – całkowite DNA komórki, obejmuje wszystkie geny jak i odcinki międzygenowe.
Termin stosowany na kilka sposobów:
- jako haploidalny zestaw chromosomów (zarówno genów, jak i międzygenowych odcinków
DNA) jakiegoś organizmu
- jako główna, zasadnicza część materiału genetycznego jakiegoś organizmu
- jako zestaw genów w znacznym stopniu autonomiczny, naturalnie wyróżniający się, mający
odrębną lokalizację komórkową

Genomika- dziedzina biologii molekularnej i biologii teoretycznej zajmująca się analizą
genomu organizmów. Głównym celem genomiki jest poznanie sekwencji materiału
genetycznego oraz mapowanie, ale również określenie wszelkich zależności i interakcji
wewnątrz genomu.

Scharakteryzowanie danego genu wymaga określenia:
- jego położenia – genomika strukturalna
- struktury i ekspresji genu – genomika ekspresyjna
- funkcji genu – genomika funkcjonalna

W celu poznania funkcji danego genu prowadzi się badania na kilku poziomach:
- analiza ekspresji genów na poziomie mRNA- transkryptomika
- analiza proteomu – proteomika
- analiza metabolomu – metabolomika
- analiza fenotypów mutantów – fenomika


Organizacja genetyczna genomu E. coli:
- kodujące DNA stanowi ok. 90%
- praktycznie brak intronów
- brak genów nieciągłych
- niewielka liczba sekwencji powtarzających się
- obecność operonów (E. coli 600)

Operon składa się z:
- zespołu genów strukturalnych
- operatora
- promotora

Chromosom metafazowy:
- telomer - region końcowy każdej chromatydy wyznaczają końce chromosomów
- centromer - utrzymuje dwa chromosomy potomne po replikacji, jest miejscem wiązania
mikrotubul, które ciągną chromosomy do różnych biegunów w komórce

Kondensacja chromatyny:
- euchromatyna – mniej skondensowana, aktywna transkrypcyjnie, posiada nieaktywne
regiony
- heterochromatyna – mocno skondensowana, nieaktywna transkrypcyjnie, składa się między
innymi z sekwencji satelitarnego DNA leżącego pobliżu centromerów

Z czego składa się genom:
3 klasy sekwencji:
- unikalne- geny w jednej kopii – 25-40% genomu

- nisko- średnio powtarzalne (do 2 tys. razy) – 5-30% genomu; np. geny kodujące rRNA,
tRNA, białka histonowe
- wysoko powtarzalne (10tys.- 1mln razy) – 5-30% genomu; np. satelitarne DNA – od 2-30 pz
ułożonych tandemowo (mini i mikrosatelity)

Sekwencje charakterystyczne dla wszystkich eukariontów:
- geny i ich otoczenie (promotory, sekwencje terminacyjne i regulatorowe)
- sekwencje wzmacniające (enhancer) i wyciszające (silencer)
- sekwencje kodujące RNA
- transpozony i sekwencje inercyjne (mogą zmieniać położenie w genomie)
- pseudogeny (niedziałające kopie genów)
- MAR (matrix- associated region) – rejon oddziaływania z macierzą jądrową
- SAR (scaffold attachment region) – rejon połączenia z rusztowaniem
- centromery zbudowane z sekwencji powtórzonych
- telomery wyspecjalizowane, powtórzone sekwencje DNA

Powstanie genomów organellowych:
Hipoteza endosymbiotycznego pochodzenia – Lynn Margulis lata 70 XXw.
- pozostałości po bakteriach które bardzo dawno temu wniknęły do komórek i zostały
przekształcone w genom chloroplastowy (cyjanobakterie) bądź mitochondrialny (bakterie
purpurowe)
- niezależne genomy
- redukcja genów podczas ewolucji, „wędrówka” genów do jądra
- zostały geny niezbędne do przeprowadzania fotosyntezy i oddychania (kluczowe znaczenie
dla produkcji energii)

Genomy organellowe:
* Teoria endosymbiozy
- mitochondria i chloroplasty powstały z symbiotycznych bakterii
- struktura genomu podobna jak u bakterii
- system biosyntezy białek podobny jak u bakterii
- otoczenie dwiema błonami

Genom mitochondrialny – mtDNA
Cechy:
- małe, koliste, dwuniciowe cząsteczki
- geny biosyntezy białek i łańcucha oddechowego
- spora część genów przeniesiona do genomu jądrowego

Genom chloroplastowy – ctDNA
- ok. 10 tys. kopii na komórkę liścia tytoniu
- dwuniciowy, kolisty
- geny związane z fotosyntezą, tRNA, rRNA
- ok. 13% ctDNA to sekwencje niekodujące

Replikacja – synteza nowej kopii genomu, ma miejsce raz podczas cyklu komórkowego w
fazie S

Replikacja składa się z 3 etapów:
- inicjacji
- elongacji
- terminacji

Co jest potrzebne
- starter RNA – krótki odcinek RNA
- matryca DNA

- polimeraza DNA
- nukleotydy dNTP
- ligaza – enzymy łączące fragmenty powstałe na nici

Widełki replikacyjne – miejsce, w którym zachodzi rozdzielenie nici i synteza nowego DNA
Replikon – każdy odcinek DNA, który replikuje jako pojedyncza jednostka
Miejsce inicjacji replikacji – miejsce ori – ściśle określone miejsce lub miejsca DNA, w
którym rozpoczyna się proces replikacji
Starter – krótki fragment RNA
Nić wiodąca – nić DNA syntetyzowana w sposób ciągły od miejsca inicjacji (5’3’)
Nić opóźniona – (5’3’) w postaci tzw. fragmentów Okazaki

Enzymy i Białka wspomagające replikację:
- białka stabilizujące jednoniciową strukturę DNA – SSB – wykazują silne powinowactwo do
jednoniciowego DNA. Wiążą się ze szkieletem fosfocukrowym, pozostawiając wolne zasady
na zewnątrz.
- helikazy – rozdziela starą podwójną nić DNA umożliwiając przyłączenie się polimerazy
DNA do nici pojedynczych
-polimeraza DNA – odpowiedzialna jest za dokładanie komplementarnych zasad do starych
nici DNA, czyli powstawanie nowych
- topoizomeraza – likwiduje naprężenia powstające w rozplątywanej podwójnej nici DNA
poprzez nacinanie pojedynczych nici, co pozwala na ich przeplecenie się, a następnie
połączenie
-primaza RNA – tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA na spóźniającej się nici DNA,
które służą za startery do syntetyzowania fragmentów Okazaki.

Ograniczenia procesu replikacji:
- niezdolność polimeraza DNA do samodzielnego rozpoczynania syntezy DNA
- synteza wyłącznie w kierunku 5’3’
- konieczność rozplatania podwójnej helisy DNA

Aktywności enzymatyczne polimeraza DNA:
- polimeraza 5’-3’ – synteza nici DNA
- egzonukleaza 3’-5’ – usuwanie błędów
- egzonukleaza 5’-3’ – usuwanie starterów

Polimerazy

Polimeraza

funkcja

Bakteryjne

Polimeraza DNA I

replikacja i naprawa DNA

Polimeraza DNA II

naprawa DNA

Polimeraza DNA III

główny enzym replikacyjne

Eukariotyczne

Polimeraza DNA alfa

synteza starterów

Polimeraza DNA beta

naprawa DNA

Polimeraza DNA gamma

replikacja mtDNA

Polimeraza DNA delta

główny enzym replikacyjny

Polimeraza DNA epsilon

replikacja nici opóźnionej

Replikacja
1. inicjacja:
- do fragmentu oriC przyłącza się białko DnaA
- Podwójna helisa ulega rozdzieleniu (topnieniu), są to rejony bogate w A=T
- przyłączają się kolejne białka inicjacyjne: DnaB i DnaC, które tworzą kompleks
reinicjacyjny (prymosom)
- Białko DnaB jest helikazy – przerywa wiązania wodorowe

- Jednoniciowy fragment DNA jest stabilizowany przez białka SSB
2. synteza starterów:
- startery do replikacji DNA zbudowane są z RNA
- prymaza syntetyzuje RNA, zależna jest od Dna bo na jego matrycy syntetyzuje. Startery u
bakterii są syntetyzowane przez prymaza która syntetyzuje ok. 5nt, a potem syntezę łańcucha
przejmuje polimeraza DNA III.
U eukariontów są syntetyzowane przez polimeraza DNA alfa. Powstaje fragment 10nt, a
następnie jest wydłużany o kolejne 30nt. później dołącza się polimeraza DNA delta i
rozpoczyna właściwą replikację.
- synteza starterów na nici prowadzącej zachodzi tylko jeden raz, na nici opóźnionej jest
procesem powtarzalnym
3. Elongacja replikacji - zjawiska zachodzące podczas elongacji replikacji DNA
Cząsteczka macierzysta:
- rozplatanie podwójnej helisy przez topoizomerazy
- rozdzielanie nici DNA przez helikazy
- zabezpieczenie jednoniciowego DNA przez białka wiążące ssDNA
Nić wiodąca
- synteza primera przez prymazę
- synteza DNA nici wiodącej przez polimerazę DNA III
Nić opóźniona
- synteza primerów przez prymazę
- synteza DNA nici opóźnionej przez drugą polimeraza DNA III
- usunięcie starterów i uzupełnienie lub deoksyrybonukteotydami przez polimerazę DNA I
- łączenie fragmentów Okazaki przez ligazę
4. terminacji replikacji
Terminacji u bakterii jest regulowana przez:
- sekwencje terminatorowe
- wiążące się do nich białko przepuszcza polimerazę DNA tylko w jednym kierunku

Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR
- łańcuchowa reakcja polimerazy to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego
fragmentu DNA in vitro. Reakcja, która jest prowadzona w termocyklerach wymaga:
termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów,
jonów Mg

2+

oraz primerów.

Do reakcji PCR jest potrzebne:
- matryca DNA lub RNA
- startery (dwa różne)
- wolne nukleotydy (dNTP)
- polimeraza (najczęściej Taq Polimeraza)
- bufor, jony Mg

2+

, Mn

2+

Tak przygotowaną próbówkę wsadzamy do termocyklera (3 etapy w termocyklerze: 1.
denaturacja- wysoka temp. ok. 94oC - podwójna nić DNA ulega stopieniu – matryca
jednoniciowa; 2. obniżanie temperatury do -50-60oC – startery przyłączają się do
jednoniciowych fragmentów DNA na zasadzie hybrydyzacji; 3. następnie temp. 72oC –
polimeraza wydłuża startery) .

Startery – krótkie fragmenty oligonukleotydowe (16-24pz) komplementarne do matrycy
oskrzydlające fragment DNA, który chcemy amplifikować, najczęściej to ich sekwencja i
stężenie decyduje o powodzeniu reakcji
- powinny mieć wyrównaną ilość zasad G/C i A/T
- Tm 50-60oC (temperatura dysocjacji dupleksu starter – matryca oznaczona jako temperatura
topnienia Tm)
- nie powinny zbyt silnie wiązać się na końcu 3’ (unikać CCC lub GGG na końcu 3’):
- specyficzność końca 3’ decyduje o powodzeniu amplifikacji:
- nie powinny tworzyć wewnętrznych struktur 2-rzędowych

- nie mogą komplementować między sobą na końcu 3’
- stężenie 0,1-0,5mikroM (za dużo – pomyłki, za mało- mniej produktu)
- dNTP – wolne nukleotydy (ATP, GTP, CTP, TTP). W mieszaninie reakcyjnej każdego
dNTP zwykle po 200mikroM. Nierówna ilość dNTP redukuje wydajność i dokładność
amplifikacji. Optymalne stężenie dNTP zależy od długości amplifikowanego produktu,
stężenia MgCl

2

, stężenia starterów.

- dodajemy również MgCl

2+

– zwykle 0,5 do 5 mM. Tworzy kompleks z dNTP dając substrat

dla polimerazy. Podwyższając stężenie nukleotydów należy zwiększać stężenie jonów Mg

2+

.

Nukleotydy redukują pulę wolnych jonów Mg2+ wpływając w ten sposób na aktywność
polimerazy i hybrydyzację starterów. Za dużo jonów Mg

2+

zwiększa ilość niespecyficznych

produktów PCR i obniża wierność (zgodność) syntezy. Jeżeli próbka DNA zawiera EDTA
zawartość jonów Mg

2+

powinna proporcjonalnie wzrosnąć.

- kolejny odczynnik – polimeraza Taq – zwykle 0,5 – 2,5 unita.

Wewnętrzne struktury starterów:
- spinka do włosów
- self- dimer
- dimer w wyniku połączenia startera, który ma pracować na jednej nici z innym, który ma
pracować na drugiej nici.


Standardy programu PCR

WYKŁAD 2

Liczba zsyntetyzowanych fragmentów DNA rośnie wykładniczo jak 2n, gdzie n to liczba
cykli.
35 cykli przy jednej cząsteczce DNA
2

35

= 34 miliardy kopii

PCR – reakcja cykliczna
1. Denaturacja w 94°C:
Podczas denaturacji przez podgrzewanie dna zrywane są połączenia pomiędzy łańcuchami –
w wyniku czego cząsteczka DNA rozdziela się na 2 pojedyncze nici.
2. przyłączanie starterów w 50-65 °C (annealing)
mieszaninę chłodzi się do określonej temperatury, w której startery mogą utworzyć
dwuniciowe struktury hybrydowe z matrycą. Każdy ze starterów wiąże się tylko z jedną nicią
wyjściowego DNA.
3. Elongacja w 72 °C:
w tej temperaturze zachodzi optymalna polimeryzacja z wykorzystaniem zawartych w
mieszaninie reakcyjnej nukleotydów.
Polimeraza DNA kopiuje każdą jednoniciową matrycę przez wydłużanie każdego ze
starterów.
Po elongacji gotowa jest kompletna nowa cząsteczka DNA składająca się w połowie z nowej
a w połowie ze starej nici i proces może zacząć się od początku

ETAP

CZAS

°C

Początkowa

denaturacja

2-5 min

94

Denaturacja

30-60s

94

30-40 razy

Przyłączenie

starterów

30-60s

54

Wydłużenie

starterów

Zależy od długości

produktu amplifikacji

72

Ostatnie wydłużenie

5-10 min

72

Schładzanie

b/o

4

Enzymy restrykcyjne:
- podstawowe narzędzie inżynierii genetycznej
- zaliczane do nukleaz
- enzymy produkowane naturalnie przez wiele gatunków bakterii jako mechanizm obronny
(restrykcyjno – modyfikacyjny)
- miejsca ich cięcia są specyficzne
- bakteria zabezpiecza swoje DNA etylując je. Dokonują tego metylazy rozpoznające te same
miejsca co odpowiadające im endonukleazy.
- enzymy tną DNA w specyficznych miejscach połączeń A, G, C i T – należą do grupy
endonukleazy, klasy hydrolaz. Przecinają wiązania fosfodiestrowe.
- rozpoznają i przecinają krótkie palindromowe sekwencje (4-8nt) DNA. Sekwencja
palindromowa oznacza taką sekwencję DNA, dla której sekwencja komplementarna jest
identyczna (od końca 5’ do 3’)
- przecięcie w identycznym miejscu obu nici powoduje powstanie tępych końców DNA, inne
symetryczne przecięcia prowadzą do powstania dwóch odpowiadających sobie końców
lepkich.

Podział według sekwencji rozpoznawanej (enzymy restrykcyjne)
- czwórkowe – rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w
dowolnym DNA takich miejsc jest dużo – co 256pz. Restryktazy takie mogą strawić DNA na
bardzo małe fragmenty
- szóstkowe – rozpoznają sekwencję DNA złożoną z 6 nukleotydów. Dowolne miejsce
restrykcyjne złożone jest z 6 nukleotydów występuje statystycznie co ok. 4096 pz w DNA, w
którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe
- ósemkowe – stosowane niezbyt często; tną DNA bardzo rzadko

Nomenklatura enzymów restrykcyjnych:
- nazewnictwo opiera się na literowych skrótach
- pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii
- druga i trzecie od gatunku
- następna litera oznacza szczep lub typ
- numery rzymskie oznaczają kolejne enzymy z danego szczepu lub typu

E

co

R

I

Escherichia

coli

R- szczep

I- pierwszy enzym z tego szczepu

BamHI- pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus amyloliquefaciens szczepu H.

Neoschizomery
- enzymy restrykcyjne rozpoznające tę samą sekwencję DNA a przecinające DNA w
odmiennych miejscach (np. SmaI i XmaI)

Izoschizomery:
- enzymy pochodzące z różnych organizmów bakteryjnych, ale rozpoznające tą samą
sekwencję i przecinające ją identycznie. (np. SphI i BbuI)

Jednostki enzymów restrykcyjnych:
* jednostka enzymu restrykcyjnego to taka ilość enzymu, która trawi kompletnie 1 mikrogram
DNA faga lambda (50kb) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37oC
* warunki reakcji :
- jony Mg2+ (kofaktor)
- bufor o wymaganym stężeniu NaCl i pH

- 37oC lub inna
Dodatkowo może być detergent – Tryton – X- 100 redukuje napięcia powierzchniowe, BSA –
albumina z grasicy cielęcej – zwiększa ogólne stężenie białka.
* przerywanie reakcji:
- niekonieczne
- 20 min. 65oC-80oC
- EDTA pH=8,0 (10mM)
- ekstrakcja fenolem

Warunki trawienia a niespecyficzna aktywność (aktywność starowa- star activity):
- jeżeli przeprowadza się trawienie w warunkach znacznie odbiegających od optymalnych dla
danego enzymu, to często zdarza się że obserwujemy niespecyficzne cięcia.
- enzym rozpoznaje sekwencje różniące się do sekwencji specyficznej (kanonicznej), np. o
jedną zasadę
- w przypadku EcoRI, dla którego sekwencją kanoniczną jest GAATTC, takie zmienione
przecinane sekwencje to np.

C

AATTC, GAATT

G

, G

T

ATTC itp.

Jak sprawdzić czy enzymy restrykcyjne zadziałały:
- należy pocięte DNA poddać elektroforezie, czyli rozdzielić w żelu agarozowym poddanym
działaniu pola elektrycznego. Im mniejsze odcinki tym szybciej wędrują w żelu

Lokalizacja genów
Budowa genu u eukariontów
Sekwencje regulatorowe – odpowiadają za rozpoczęcie transkrypcji, mogą być oddalone od
genu o kilka tys par zasad
Początek rozplatania TATA-box – tu przyłącza się polimeraza dna
Początek transkrypcji
Wiązanie rybosomy ATG – start
Egzon
Intron – sekwencja niekodująca
Egzon – sekwencja kodująca
STOP – koniec syntezy RNA w tym miejscu powinien się zakończyć
Terminator

Gen eukariotyczny składa się z następujących elementów:
- promotora, sekwencji regulatorowych
- miejsc inicjacji i terminacji transkrypcji (start, stop)
- właściwej sekwencji kodującej
Promotor – położona na końcu 5’ genu sekwencja nukleotydowa, z którą wiąże się
polimeraza RNA w czasie inicjacji transkrypcji
Enhancery to sekwencja wzmacniające aktywność promotorów. Do enhancerów wiążą się
aktywatory. Silencer to przeciwieństwo, do nich przyłączają się inhibitory.

Promotor rozpoznawany przez δ

70

składa się z 40-60 pz.

Sekwencja -35 znajduje się w odległości 35 pz od miejsca startu, jest to pierwszy region
rozpoznawany przez polimeraza RNA;
Sekwencja -10 (nukleotydów przed miejscem startu) znajduje siew odległości 10 pz od
miejsca startu, zwana jest kasetą Pribnowa (TATA-box), umożliwia przejście promotor-
polimeraza RNA ze stanu zamkniętego w otwarty;
Miejsce startu transkrypcji – w 90% wszystkich genów jest puryna G lub A, a po obu stronach
miejsca startu często znajdują siec i T, sekwencja ta ma wpływ na inicjację transkrypcji.

Przepływ informacji genetycznej
Trzy procesy przekazywania informacji
- replikacja (DNA-DNA)
- transkrypcja (DNA-RNA)

-t ranslacja (RNA – białko)

Replikacja DNA > transkrypcja > RNA > translacja > białko

Ekspresja genu – seria zdarzeń prowadzących do uwolnienia informacji genetycznej niesionej
przez gen i uczynienia jej dostępną dla komórki.

Transkrypcja – jest to enzymatyczna synteza RNA na matrycy DNA. Jest to pierwszy etap
procesu ekspresji genów, który ostatecznie prowadzi do syntezy białka kodowanego przez
gen. Transkrypcja katalizowana jest przez polimerazę RNA, wymaga obecności matrycy
dsDNA, rybonukleotydów (ATP, GTP, CTP, UTP), jonów magnezu lub manganu
Nić kodująca (nić sensowna) – nić dna, która jest transkrybowana
Nić matrycowa (nić antysensowna) – jest matrycą dla RNA

5’ GCGAAATATGCCGATTAGCGGCCATATC 3’ nić kodująca DNA
3’ CGCTTTATACGGCTAATCGCCGGTATATG 5’ nić matrycowa DNA
5” GCGAAAUAUGCCGAUUAGCGGCCAUAUC 3’ mRNA

Transkrypcja
Przebieg procesu transkrypcji – główne punkty
Synteza RNA na matryc DNA dokonywana jest przez polimerazę RNA
Początek i koniec transkrypcji regulują sekwencje DNA i wiążące się do nich białka
Synteza RNA zachodzi od końca 5’ do 3’
Transkrypcja składa się z trzech etapów:
- Inicjacji – polimeraza RNA wiąże się z dsDNA w miejscu paromotorowym, DNA ulega
lokalnemu rozpleceniu i polimeraza RNA rozpoczyna inicjację transkrypcji
- Elongacji – polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż DNA i zgodnie z jego sekwencja
syntezuje łańcuch RNA
- Terminacji – polimeraza RNA rozpoznaje sekwencję terminacyjną, co powoduje przerwanie
wbudowywania rybonukleotydów.

Holoenzym bakteryjnej polimeraza RNA
Podjednostki polimeraza bakteryjnej
α – składanie enzymu beta – podjednostka katalityczna
β‘ – wiązanie z DNA
ω – utrzymywanie aktywności enzymu
δ – rozpoznawanie promotora

Regulacja inicjacji transkrypcji u bakterii na przykładzie operonu laktozowego
lacZ – β-galaktozydaza (enzym hydrolizujący laktozę0
lacY – permeaza (enzym transportujący laktozę do bakterii)
lacA – acetylaza (enzym modyfikujący laktozę)
Cząsteczką regulatorową dla operonu laktozowego jest substrat szlaku biochemicznego –
laktoza.
Laktoza jest induktorem, symuluje transkrypcję genów struktury operonu laktozowego.

Regulacja inicjacji transkrypcji u bakterii na przykładzie operonu tryptofanowego
Cząsteczka regulatorową dla operonu tryptofanowego jest produkt szlaku metabolicznego –
tryptofan, a nie substrat jak w przypadku operonu laktozowego.
Tryptofan działa jak korepresor i inhibuje swoją własną syntezę.

Eukariotyczna polimeraza RNA
U Eucaryota są trzy główne jądrowe polimerazy RNA
- polimeraza I – rybosomalne RNA
- polimeraza II geny kodujące białka
- polimeraza III – geny tRNA i 5S rRNA

Polimeraza I
Rybosomalne RNA
- strukturalne składniki rybosomów
- kodowane przez zespoły genów tworzące jąderka
- potrzebne w ogromnych ilościach

Polimeraza II
Transkrypcja genów kodujących białka
- zdecydowana większość genów koduje białka
- jej aktywność ma związek z regulacją ekspresji genów

Polimeraza III
Transkrypcja genów 5S rRNA i tRNA
- 5S rRNA – rRNA produkowany niezależnie poza jąderkiem
- tRNA – cząsteczki biorące udział w syntezie białek
- promotory często w obrębie transkryptu

Transportowanie RNA
RNA wydostaje się na zewnątrz jądra na drodze aktywnego transportu poprzez kanały w
błonie jądrowej. W transporcie uczestniczą białka karioferyny.

Żadna polimeraza RNA u eukariota nie potrafi łączyć się z DNA sama, wszystkie wymagają
do tego dodatkowych czynników, zwanych czynnikami transkrypcyjnymi.
Czynniki te oznacza się symbolem TF (ang. transcription factor), liczba I, II lub III mówi, z
którą polimerazą czynnik ten współdziała, duża litera (A, B, C itd.) określa dany czynnik.

Promotory dla polimeraza RNA organizmów eukariotycznych

1. promotory polimeraza RNA I składa się z promotora podstawowego, obejmującego

miejsce startu transkrypcji i położonego miedzy nukleotydami – 45 a +20 oraz
elementu kontrolnego położonego powyżej genu – UCE (ang. upstream control
element), który zwiększa wydajność transkrypcji.

2. Promotory polimeraza RNA II są bardzo różnorodne, występują w odległości do kilku

tysięcy pz powyżej miejsca startu transkrypcji. Promotor skład się z dwóch
segmentów: blok -25, zwanego sekwencja TATA, oraz sekwencji inicjatorowej – ihr

3. Promotory polimeraza RNA III znajdują się wewnątrz genów. Promotor podstawowy

skład się z dwóch bloków i obejmuje przeważnie 50-100 pz.

Czynnik transkrypcyjny jest białkiem wiążącym DNA na obszarze promotora bądź
sekwencji wzmacniającej w specyficznym miejscu lub regionie, gdzie reguluje proces
transkrypcji.
Czynniki transkrypcyjne

mogą być selektywnie aktywowane, bądź dezaktywowane przez

inne białka.

Ogółem czynnik transkrypcje
TBP (ang. TATA binding protein):
- uczestniczy w inicjacji transkrypcji wszystkich trzech polimeraz
- monomeryczne białko o masie cząsteczkowej 22-30 kDa
- posiadają bardzo konserwatywną domenę C-końcową, domena N-końcowa charakteryzuje
się wysoką zmiennością pod względem dl. i sekwencji
- struktura przestrzenna TBP przypomina symetryczne siodło
- TBP oddziałuje z DNA w obrębie małego rowka, wnętrze siodła wiąże się z DNA w rejonie
kasety TATA. Zewnętrzna powierzchnia białka jest dostępna dla innych czynników
transkrypcyjnych.
- związanie TBP z DNA w charakterystyczny sposób – zginając DNA do wnętrza siodła i
rozplatając je

Eukariotyczne czynniki transkrypcyjne
Czynniki transkrypcyjne zbudowane są z:
- domeny wiążącej DNA, która odpowiada za specyficzne wiązanie ze ściśle określonym
miejscem w DNA na jej podstawie klasyfikuje się czynniki trankrypcyjne na domeny typu:
helisa-zwrot-helisa, palce cynkowe, domeny zasadowe (zasocjowane z jedną z dwóch domen
dimeryzacyjnych: suwakiem leucytowym, helisa-pętla-helisa)
- domeny aktywującej transkrypcję, która bezpośrednio odpowiada za aktywację
transkrypcji, służy do interakcji z innymi elementami aparatu transkrypcyjnego wśród nich
wyróżniamy: domeny kwaśne, domeny bogate w glutaminę, domeny bogate w prolinę
- domeny warunkujące dimeryzację (czynnik nieobowiązkowy) odpowiadają za
dimeryzację należą do nich: suwaki leucytowe, helisa-pętla-helisa, które łączą się z DNA
tylko w postaci dimerów
- domeny wiązania ligandów (również nieobowiązkowa) umożliwiają regulacje aktywności
czynników transkrypcyjnych przez związanie małych cząsteczek pomocniczych

Transkrypcja podobna jak u E. coli ale:
- jednostka transkrypcyjna policistronowa (bakterie), monocistronowa – eukarioty
- rożna długość transkryptu
- stabilność kompleksu transkrypcyjnego warunkowana czynnikami elongacyjnymi
- nukleosomy
- transport: bakterie niepotrzebny, eukarioty niezbędny
- okres półtrwania mRNA: bakterii <5 minut, eukarioty > 4 godzin
- dojrzewanie pierwotnego transkryptu: poliadenylacja – terminacja, dołączanie czapeczki
(mRNA), wycinanie intronów, redagowanie RNA.

Rodzaje dojrzewania RNA
- „dojrzewanie” (obróbka) RNA jest to proces, w którym pierwotne cząsteczki RNA ulegają
zmianom. Najczęstsze typu zmian obejmują:
- usunięcie nukleotydów przez Endo- i egzonukleazy
- dodatnie nukleotydów do końca 5’ lub 3’ pierwotnego transkryptu lub produktów jego
rozcięcia
- modyfikacje pewnych nukleotydów w obrębie zasady azotowej lub w części cukrowej

Dojrzewanie mRNA rozpoczyna się w trakcie jego syntezy i polega na:
- dołączeniu 7-metyloguanozyny (czapeczki) do końca 5’
- poliadenylacja końca 3’, składaniu transkryptu
- wycinaniu intronów (splicing)
- redagowaniu transkryptu – zmianie właściwości kodującego mRNA

Szlak zależny od deadenylacji

szlak niezależny od deadenylacji

Prawidłowy mRNA

mutacje

Nieprawidłowy splicingu

Przedwczesny kodon stop

Brak kodonu stop

Zablokowanie rybosomy

WYKŁAD 3

Inicjacja translacji u bakterii
W procesie inicjacji uczestniczą czynniki białkowe (IF), które stabilizują proces

1. mała podjednostka rybosomy 30S przyłącza się do miejsca wiązania na mRNA

(sekwencja Shine-Dalgarno)

2. przyłącza się inicjatorowi tRNA
3. przyłącza się duża podjednostka rybosomu 50S

Inicjacja translacji u eukariotów

1.składanie kompleksu preincjacyjnego , w skład którego wchodzą podjednostka 40S,
inicjatory tRNA

i

Met

, czynnik białkowy (lelF2)

2.kompleks reinicjacyjny łączy się z mRNA z końcem 5’ (z czapeczką). Dołączają niekolejne
czynniki białkowe
3.kompleks reinicjacyjny skanuje mRNA wzdłuż, że do momentu napotkania kodonu
inicjacyjnego, który znajduje się w sekwencji Kozak. Następuje dołączenie dużej
podjednostki Rybusom (80S)

Elongacja translacji
Cykl elongacyjny składa się z trzech etapów:
- dostarczenie aminoacylo-tRNA
- tworzenia wiązań peptydowych
- translokacji

Miejsce P (peptydylowe) zajęte jest przez inicjatorowi tRNA, naładowany metioniną lub N-
formylometioniną.
Miejsce A (akceptorowe) zajmuje odpowiednie aminoacylo-tRNA, umiejscowione przez
czynnik elongacyjny. Czynniki te należą do kalus białek G i wiążą one cząsteczkę GTP.
Późniejsza hydroliza GTP pozwoli na tworzenie wiązania peptydowego miedzy
aminokwasami

Następuje połączenie dwóch aminokwasów wiązaniem peptydowym. Energia potrzebna na
wytworzenie wiązania pochodzi z hydrolizy GTP. Reakcje katalizuje enzym
peptydylotransferaza, która odłącza aminokwas od inicjatorowego tRNA i przenosi na
aminokwas znajdujący się w pozycji A
Następuje translokacja.
Rybosom przesuwa się przez trzy kolejne nukleotydy, następny kodon wchodzi w miejsce A.
Dipeptydylo-tRNA odpowiadający dwóm pierwszym kodonom zostaje „przesunie” w miejsce
P. Wolny tRNA (deacylowany) zostaje usunięty z rybosomu * u bakterii deacylowany tRNA
przesuwa siew miejsce E – miejsce wyjścia)


W miejsce A przyłącza się kolejny aminoacylo-tRNA. Z udziałem peptydylotransferazy
powstaje kolejne wiązanie peptydowe itd.

Terminacja translacji
Proces syntezy białka kończy się w momencie napotkania jednego z kodonów stop (UAA,
UAG, UGA) wówczas w miejsce A nie wchodzi cząsteczka tRNA.
W miejsce A przyłącza się czynnik uwalniający (ang. tease factor) – RF. U bakterii proces
terminacji nie wymaga energii, natomiast u eukariotów potrzebna jest energia uwalniana z
hydrolizy GTP.

Czynniki uwalniające powodują, że peptydyylortrafsferaza przenosi polipeptydu a cząsteczkę
wody, a nie na aminoacylowy tRNA i w ten sposób uwalnia nowe białko
Kiedy białko zostanie odłączone od rybosomu następuje oddysocjowanie poszczególnych
elementów od rybosomu tzw. deacylowanego tRNA, czynnika uwalniającego, podjednostek
rybosomy oraz mRNA

Białka – cząsteczki chemiczne spełniające różne funkcje
- zbudowane są z 20 aminokwasów

Co określa funkcję białka:
- funkcję białka określa jego struktura

Co określa strukturę białka:
- strukturę białka określa jego sekwencja aminokwasowa

Każde białko ma strukturę trójwymiarową:
- struktura pierwszorzędowa- kolejność aminokwasów stabilizowana przez wiązania
peptydowe
- struktura drugorzędowa – łańcuchy polipeptydowe są poskręcane w helisy lub też inne
regularne struktury np. harmonijki, które są utrzymywane przez wiązania wodorowe
- struktura trzeciorzędowa- ponowne skręcenie lub pofałdowanie już skręconego białka, jest
stabilizowana przez wiązania wodorowe, kowalencyjne, oddziaływania hydrofobowe.
- struktura czwartorzędowa – tą strukturę posiadają niektóre białka zbudowane z kilki
łańcuchów polipeptydowych, stabilizowana przez wiązania wodorowe, oddziaływania
hydrofobowe, mostki dwusiarczkowe. W zależności od pełnionej funkcji białka ze strukturą
4-rzędową mogą rozpadać się na składowe polipeptydy lub zmieniać swoje podjednostki.


Potranslacyjna obróbka białek:
- polipeptyd uwolniony z rybosomu jest nieaktywny i zanim będzie mógł spełniać swoje
funkcje musi zostać poddany obróbce

Są cztery typy mechanizmów obróbki potranslacyjnej:
- fałdowanie się białka
- proteolityczne rozszczepienie białka
- modyfikacje chemiczne
- wycinanie intein

Fałdowanie się białek:
- polipeptyd musi szybko przyjąć prawidłową strukturę przestrzenną. Fałdowanie odbywa się
poprzez chowanie się do środka hydrofobowych odcinków białka a eksponowanie na
zewnątrz odcinków hydrofilowych.
In vivo, białka „opiekuńcze” zabezpieczają przejściowo rejony hydrofobowe białek przed
niepoprawnym sfałdowaniem.
Fałdowanie białka proces fizykochemiczny, w którym łańcuch polipeptydowi przybiera
strukturę docelową, umożliwiając pełnienie określonej funkcji.
Błędne sfałdowanie białka:
- obecni znanych jest ok. 50 chorób wywołanych błędnym sfałdowaniem białek – choroba
Alzheimera, Parkinsona


Obróbka proteolityczna białka:
- aktywacja białka poprzez wycięcie niepotrzebnego fragmentu łańcucha polipeptydowego
końca N lub C (np. melityna, insulina)
- usunięcie sekwencji literowych (fragmentów łańcucha, które kierują białko do
odpowiedniego przedziału komórkowego)
- w przypadku poliprotein pocięcie na fragmenty, aktywuje każdy z otrzymanych fragmentów
(np. hormony peptydowe u kręgowców)
- usuwanie pierwszego aminokwasu (metioniny lub formylometioniny), występują u prawie
50% wszystkich białek

Modyfikacje chemiczne:
- potranslacyjnym modyfikacjom chemicznym podlega 15 z 20 aminokwasów. Wyjątki –
alanina, walina, leucyna, izoleucyna i metionina. Do najczęstszych zmian zaliczamy:

- fosforylację

- defosforylację

- karboksylację

- acetylację

- hydroksylację

- acylację

- metylację

- glikozylację

- prenylację

fosforylacja – dołączanie grupy fosforanowej do aminokwasów; gr. P z ATP na atom tlenu
Ser, Thr lub Tyr, białko zyskuje dwa ładunki ujemne, enzym kinazy; białko może być w ten
sposób chronione przed strawieniem

defosforylacja – usunięcie reszty P przez specyficzne enzymy – fosfatazy.

karboksylacja – np. glutaminianu do Y-karboksyglutaminianu w protrombinie co zwiększa
wiązanie jonów Ca2+; reakcja katalizowana przez system enzymatyczny zależny od wit. K;
aktywna trombina przekształca fibrynogen w fibrynę; karboksylacja lizyny w białku zwiększa
jej podatność na proteolizę.

acetylacja – dołączenie gr. acetylowej do gr. NH2 lizyny, reakcja odwracalna, enzym
acetylotransferaza; acetylację lizyny w histonach rdzeniowych towarzyszy aktywnej
transkrypcji chromatyny.

deacetylacja – usunięcie reszty octanu z białka odbywa się przy udziale deacetylazy

hydroksylacja – dołączenie gr. OH do Lys i Pro, enzym dioksygenazy; askorbinian
utrzymuje w niezmienionym stanie jon żelazowy znajdujący się w CA enzymu.

acylacja – dołączanie gr. acylowej do polipeptydu; mirystylacja – przeniesienie reszty kwasu
mirystynowego C14; palmitylacja – przeniesienie reszty kwasu palmitynowego C16; donorem
grupy acylowej jest mirystoilo CoA lub palmityno CoA

metylacja – dołączenie gr. CH3 do aminokwasu

glikozylacja – polega na przeniesieniu drzewka cukrowego z dolicholu na białko, zachodzi w
RE, enzym transferaza glikozylowa (np. białka błonowe)
Dolichol to poliizopropenoidowy alkohol pierwszorzędowy z nasyconą resztą izoprenowi, dł.
łańcucha 14-24 reszt izoprenowych.

prenylacja – przyłączanie do białek pochodnych izoprenowych takich jak jednostka
frenazylowa C15 lub geranylogeranylowa C20


Wycinanie intein:
- inteiny to sekwencje w białku, które są odpowiednikami intronów w mRNA; mają długość
300-600 aminokwasów; wewnątrz inteiny znajdują się aminokwasy, które biorą udział w
procesie wycinania; po wycięciu intein eksteiny muszą być ze sobą połączone.

Gdzie występują inteiny:
- eukarionty
- bakterie
- Archaea

Funkcje białek:
- enzymatyczna – katalizowanie reakcji chemicznych
- sygnalizacyjna – detekcja hormonów i neuroprzekaźników
- transportowa – transport substancji (np. hemoglobina, transferryna)
- magazynowa – magazynowanie substancji i materiałów odżywczych (ferrytyna)

- strukturalna – budowa tkanek łącznych (kolagen, kreatyna)
- motoryczna – ruch mięśni (aktyna, miozyna)
- odżywianie – źródło aminokwasów w czasie wzrostu potomstwa
- odpornościowa – przeciwciała
- regulacyjna – czynniki regulujące ekspresję genów i rozwój

Białka są bezpośrednimi wykonawcami większości procesów życiowych.

Miejsce syntezy i przeznaczenie białek:
* rybosomy wolne - białka pozostają w cytoplazmie lub są włączane do organelli
Są to:
- rozpuszczalne białka cytozol (enzymy glikolizy)
- białka zewnętrznej powierzchni błon komórkowych
- białka mitochondriów i chloroplastów kodowane przez jądrowy DNA
- białka macierzy peroksysomów i glioksysomów
* rybosomy związane z reticulum endoplazmatycznym – białka kierowane są do wnętrza
reticulum i aparatu Golgiego, gdzie podlegają przekształceniom potranslacyjnym, a następnie
wydzielane są na zewnątrz komórki, wbudowywane w błony komórkowe lub transportowane
do lizosomów
Są to:
- białka integralne błony komórkowej
- białka błon wewnątrzkomórkowych, w tym białka ER
- białka wydzielane przez komórkę (białka sekrecyjne)
- enzymy lizosomowe
- enzymy aparatu Golgiego

Co się dzieje z białkiem po biosyntezie:
- białka uwalniane są bezpośrednio do cytoplazmy i same trafiają do docelowych miejsc
Lub
- jeszcze podczas translacji białka są transportowane do siateczki śródplazmatycznej i potem
trafiają do specjalnych pęcherzyków, które niosą białka do odpowiednich miejsc.

GENETYKA BAKTERII

Wiadomości wstępne
- podstawą hodowli bakterii jest możliwość uzyskania kultur klonalnych, czyli potomków
jednej komórki. Uzyskuje się je jako posiew redukcyjny lub seryjne rozcieńczenie i
naniesienie na płytki (szalki) agarowe.
- bakterie typu dzikiego nazywamy prototrofami, potrafią one rosnąć na podłożach
zawierających jedynie związki nieorganiczne i jedno źródło węgla organicznego (np.
glukozę). Markerami genetycznymi są często geny zmutowane, uniemożliwiające wykonanie
pewnych funkcji.
- takimi markerami genetycznymi są np. auksotrofy, czyli szczepy niezdolne do syntezy
niektórych związków, które muszą być dodane do podłoży, np. szczep Ade

-

(Ade minus)

wymaga dodatku adeniny do wzrostu.
- jako marker używana kest także niezdolność do rozkładu niektórych związków, np. szczep
Lac

-

(Lac minus) nie potrafi rosnąć gdy jedynym źródłem węgla jest laktoza.

- markerem może też być wrażliwość lub oporność na różne substancje, np. streptomycynę,
czyli odpowiednio STR

S

lub STR

R

(R- odporne, S- wrażliwe).

Zalety bakterii w eksperymentach genetycznych:
- są haploidalne, nie ma maskowania genów
- nowe pokolenia są tworzone co 20 min.
- łatwo wyhodować olbrzymie ilości

- poszczególni osobnicy tych licznych populacji są genetycznie identyczni – tworzą naturalne
klony

3 główne typy przenoszenia informacji genetycznej u bakterii:
- transformacja – bakteria pobiera DNA ze środowiska zewnętrznego (Griffith, 1928)
- koniugacja – przeniesienie DNA od dawcy do biorcy, wymaga bezpośredniego kontaktu obu
komórek (Lederberg, Tatum, 1946)
- transdukcja – DNA przenoszone jest z komórki dawcy do biorcy za pośrednictwem faga
(Lederberg, Zinder, 1951)

Transformacja u bakterii:
- transformacja to pobranie ze środowiska nagiego DNA i zmiana fenotypu na skutek
wbudowania i odczytania zawartej tam informacji genetycznej
- wiele bakterii np. Haemophilus, Bacillus, mogą ulegać transformacji spontanicznie, a nawet
pobierać DNA aktywnie ze środowiska
- Escherichia nie transformuje naturalnie, ale można sztucznie osłabić jej ścianę komórkową
pomagając w przejściu DNA, wykorzystuje to inżynieria genetyczna.

Koniugacja
- czasowe połączenie komórek bakteryjnych
- wymaga by komórka dawcy jest nosicielem plazmidu F, bądź to w formie autonomicznej
(komórka F+) bądź w formie zintegrowanej z chromosomem (komórka Hfr); wytwarzanie
pilusa płciowego
- komórka biorcy musi być F-; posiada ona na powierzchni specyficzne receptory dla pilusa
płciowego

Transdukcja u bakterii
- wirusy bakteryjne to bakteriofagi lub fagi. Mają własne geny umożliwiające replikację ich
DNA lub RNA oraz produkcję powłok białkowych, ale mogą się rozmnażać tylko wewnątrz
komórek bakteryjnych wykorzystując ich metabolizm.
- fagi lityczne – namnażają się intensywnie po wejściu do komórek i doprowadzają do jej
rozpadu czyli lizy komórki
- fagi lizogeniczne – mogą wbudować swój DNA do chromosomu bakterii i w tej ukrytej
formie profaga dzielić się wraz z nim, zanim nastąpi produkcja fagów potomnych i rozpad
komórki.

Koniugacja, transformacja i transdukcja to trzy drogi horyzontalnego transferu gnów
pomiędzy różnymi bakteriami i pomiędzy ich genomowymi pasożytami a zapewne też
pomiędzy gospodarzami bakterii.

Enzymy pozwalające na manipulację DNA:
- organizmy muszą właściwie utrzymać swój DNA czyli namnażać go, ciąć i sklejać.
Dokonują tego przy pomocy wyspecjalizowanych enzymów: polimeraz, nukleaz, ligaz

Polimerazy DNA:
- enzymy budujące DNA z pojedynczych nukleotydów
- potrzebują wzorca – matrycy, czyli istniejącej już nici DNA lub RNA
- zależne od matrycy RNA nazywane są też odwrotnymi transkryptazami (są u retrowirusów)
- potrzebny jest starter

Nukleazy
- enzymy tnące DNA w środku (endonukleazy) lub z końców (egzonukleazy)
Ligazy
- łączą końce DNA, z dwóch nici dają jedną nić, z jednej nici dają nić kolistą.

Ligazy DNA:

- katalizują formowanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem hydroksylowym 3’ a
końcem 5’

Funkcje i zastosowanie ligaz:
- in vivo: udział w replikacji i reperacji DNA
- in vitro: tworzenie nowych układów DNA i łączenie ich z wektorami

Typy ligaz:
- zależne od ATP: ligaza DNA faga T4 (podstawowa)
- zależne od NAD+: ligaza DNA E. coli (nie liguje RNA, łączy tępe końce tylko w obecności
PEGu lub Ficollu)

Ligazy DNA:
- w komórce dochodzi do pęknięć nici i wtedy ligazy odtwarzają wiązanie fosforanu z cukrem
- w probówce wykorzystuje się je do połączenia dwóch dowolnych nici w jedną
Łatwiej jest złączyć lepkie końce DNA bo wiązania wodorowe „ przytrzymują” nici DNA
które chcemy zligować.
Dlatego niekiedy warto najpierw doczepić (ligować) krótkie odcinki łącznikowe zawierające
sekwencje palindromowe a potem je przeciąć restrykcyjnie i otrzymać lepkie końce.

Zalecane warunki reakcji:

 optymalna temperatura ligacji:

- 16oC przez noc najwyższa efektywność (tępe)
- RT – temp. pokojowa 30min.- 2h – do szybkiego klonowania (lepkie)
- 4oC przez 24h (lepkie)

Inaktywacja ligazy:
- 10-15min. 65oC może zwiększyć wyjściową ilość transformantów nawet 100x

Lista enzymów modyfikujących niezbędnych do klonowania:
- zestaw enzymów restrykcyjnych
- fragment Klenowa polimerazy DNA I- tworzenie tępych końców przez wypełnianie
cofniętych końców 3’
- polimeraza DNA T4- tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych końców 3’
lub wypełnianie cofniętych końców 3’
- alkaliczna fosfataza – usuwanie grup fosforanowych z końców 5’
- kinaza polinukleotydowe T4 – fosforylacja końców 5’
- termostabilnej polimerazy – synteza DNA
- nukleaza mung bean i nukleaza S1 – tworzenie tępych końców przez usuwanie
jednoniciowych lepkich końców
- RNAzaA i RNAzaH – degradacja RNA

Fragment Klenowa:
- jest dużym fragmentem polimerazy DNA I;
- posiada aktywność polimeryzacyjną 5’3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’5’
(aktywność naprawcza). Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5’3’ wymagana
jest obecność jednoniciowej matrycy oraz startera.
- niezbędnym kofaktorem reakcji są jony Mg2+
- wykorzystanie: wypełniania 5’ lepkich końcóe powstałych po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi. Synteza zachodzi w kierunku 5’ -> 3’ do momentu, aż wystający lepki koniec
zostanie wypełniony całkowicie.

Polimeraza DNA bakteriofaga T4
- posiada aktywność polimeryzacyjną 5’3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’5’; nie
posiada aktywności egzonukleolitycznej 5’3’

- wykorzystywana do: wytępiania 3’ lepkich końców, które powstały po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi zostawiającymi wystające końce 3’. Aktywność egzonukleolityczna w
stosunku do dwuniciowego DNA blokowana jest przez aktywność polomeryzacyjna 5’-> 3’.
- wypełniania 5’ lepkich końców. Aktywność polimeryzacyjna 5’ -> 3’ wymaga obecności
matrycy, startera, dNTP oraz jonów Mg2+

Alkaliczna fosfataza jest enzymem odpowiedzialnym za usuwanie reszt 5’ fosforanowych z
DNA, RNA oraz nukleotydów.
Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest defosforylacją. Enzym tan wykazuje
najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym.
Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, które odróżnia między innymi
możliwość inaktywacji.

Schemat klonowania powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym inseratu do
defosforylowanego wektora
Wektor niepoddany działaniu alkalicznej fosfatazy może ulegać ponownej cyrkularyzacji, co
prowadzi do otrzymania dużej ilości „pustych” wektorów. Defosforylowany wektor nie może
ulec cyrkularyzacji, bez inseratu.

Polinukleotydowa kineza bakteriofagi T4
Katalizuje przeniesienie y-fosforanu z ATP na 5’ OH (nukleotyd po defosforylacji) koniec
jedno- lub dwuniciowego DNA, RNA lub oligonukletydów.

Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji:
-podstawiania – w tej reakcji y-fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy
nukleotyd nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5’. Reakcja ta jest odwracalna.
-wymiany – w reakcji tej nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5’-fosforan z
ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforyzowany przez przeniesienie
y-fosforanu z ATP. Ponadto enzym posiada aktywność 3’ fosfatazy.

Termostabilne polimerazy DNA
- przeprowadzają zależną od matrycy syntezę DNA z triosfonukleozydów w kierunku 5’3’.
- do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą 3’-OH oraz jony Mg2+
- maksymalna aktywność katalityczna w temperaturze 75-80oC
- w 37oC osiągają jedynie ok. 10% aktywności maksymalnej

Rybonukleaza A
źródłem jest trzustka wołowa. Jest to bardzo aktywna i stabilna. Większość preparatów jest
zanieczyszczona DNazami, które mogą być inaktywowane przez gotowanie w 100oC przez
15min.
Właściwości: Endorybonukleaza, przecinająca fosfodiestrowe wiązanie 3’ przy pirymidynach
w RAN. Nie wykazuje żadnej aktywności w stosunku do DNA.
Zastosowanie:
-usuwanie RNA z preparatów DNA
-mapowanie punktowych mutacji w DNA i RNA



WYKŁAD 5

Wektor to cząsteczka DNA (np. wirus, plazmid), która służy do wprowadzenia obcego
materiału genetycznego di innego gospodarza. Wektor, w którym umieszcze się DNA,
nazywany jest rekombinowanym DNA.

Plazmidy są to autonomiczne, pozachromosomowe elementy genetyczne. Charakterystyczną
ich cechą jest: fizyczna odrębność od chromosomu, zdolność do trwałego utrzymywania i
replikowania się w komórce.
Cechy przenoszone przez plazmidy:
- odporności na antybiotyki
- odporności na jony metali ciężkich
- produkcje antybiotyków i bakteriocyn
- katabolizm toksycznych związków
- chorobotwórczość bakterii
- interakcje z roślinami
- zdolność do koniugacji

Wektory plazmidowe zawierają następujące, podstawowe elementy:
-Ori – miejsce inicjacji replikacji. Miejsce inicjacji replikacji jest specyficzne dla danej
komórki gospodarza.
- Marker I – znajdujący się na wektorze gen pozwalający odróżnić bakterie posiadające
plazmid od takich, które go nie zawierają
-Marker II – ten marker pozwala odróżnić bakterie, które pobrały plazmid bez wstawki, od
takich, które otrzymały plazmid zrekombinowany, czyli zawierający wstawkę.

Schemat klonowania fragmentu DNA na plazmidzie:
1.trawienie (restryktaza)
2.ligacja
3.transformacja bakterii i selekcja
4.selekcja pojedynczego klonu

ad.1. DNA trawi się ER.
-ligacja z wektorem
-transformacja komórek bakterii
-selekcja i identyfikacja zrekombinowanych wektorów
DNA poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym (niekoniecznie). Tym samym enzymem
restrykcyjnym lub enzymem zostawiającym identyczne lepkie końce przecina się wektor
(ważne żeby końce wektora pasowały do końców inseratu).

2. przeprowadza się ligację wektora z fragmentami donorowego DNA. Usunięcie grupy
fosforanowej na końcach 5’ liniowego plazmidu aby zapobiec cyrkularyzacji wektora. Enzym
fosfataza.

3. transformacja, czyli wprowadzenie DNA do komórek bakterii.
Transformacja jest procesem wprowadzenia DNA do komórki.
Komórki bakteryjne muszą być kompetentne.
Bakterie naturalnie kompetentne np. bacillus subtillis.
Większość bakterii musi osiągnąć stan kompetencji. Są poddawane działaniu czynników
chemicznych lub fizycznych np. escherichia coli.

Metody transformacji:
1.metoda chemiczna (Heat shock) – metoda transformacji komórek bakteryjnych
podlegająca trawieniu bakterii zimnym CaCl2 na lodzie i szybkim podgrzaniu do 42°C.
2.elektroporacja – metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca na odwracalnej
destabilizacji błony komórkowej z wytworzeniem w niej porów, zachodzącej pod wpływem
pola elektrycznego o wysokim napięciu.

- po transformacji bakterie wysiewa się na odpowiednie podłoże selekcyjne, czyli
przeprowadza się selekcję.
Transformaty rosnące na podłożu selekcyjnym będą zawierały: pusty wektor albo wektor ze
wstawką, czyli zrekombinowany.

Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów – podwójna odporność na antybiotyki
Plazmid z dwoma opornościami na antybiotyk → klonowanie w obrębie jednego z genów
odporności → transformacja bakterii + wysiew na pożywkę selekcyjną z ampicyliną →
robienie repliki na pożywkę z tetracykliną → klonowanie bakteryjne, które wyrosły zawierają
nierekombinowany plazmid
Do analizy bierze się komórki bakteryjne, które rosły na pożywce z ampicyliną a nie
rosły na pożywce z tetracykliną.

Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów – alfa – komplementacja

Beta-galaktozydaza
1.plazmid (N-koniec genu lacZ kodujący 148 AA)
2.bakterie (C-koniec genu lacZ)

-osobno są nieaktywne
-plazmid zostanie wprowadzony do bakterii to aktywny enzym rozkłada substrat X-Gal:
niebieskie kolonie
-zrekombinowany plazmid zostanie wprowadzony do bakterii (nieaktywny gen lacZ) to
kolonie białe

Biblioteki (banki) DNA
Biblioteka DNA stanowi zbiór fragmentów DNA danego organizmu włączonych do
cząsteczek wektorów i wprowadzonych do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska
transformacji. Wyróżniamy dwa rodzaje bibliotek: genomowe i cDNA.

Biblioteki DNA
Cel tworzenia: przechowywanie DNA, aby móc je w przyszłości badać i wykorzystywać do
różnych celów. Biblioteki umożliwiają dostęp do różnych sekwencji DNA. W jednej
probówce zebrany jest cały genom.
Biblioteka genomowa – jest reprezentacją całego DNA danego organizmu. Fragmentacji
poddaje się genomowe DNA, które następnie łączy się z cząsteczkami określonego wektora.
Każda cząsteczka wektora zawiera jeden wbudowany fragment DNA.
Przygotowanie biblioteki obejmuje następujące etapy:
-izolacja genomowego DNA
-trawienie DNA enzymem restrykcyjnym
-klonowanie fragmentów DNA do wektora
-transformacja bakterii

Biblioteka cDNA – zawiera fragmenty cDNA powstałe na matrycy mRNA w wyniku
odwrotnej transkrypcji. Jest to reprezentacja tylko aktywnych genów występujących w
tkance, z której został wyizolowany mRNA.
Biblioteka cDNA:
-izolacja mRNA
-synteza cDNA
-klonowanie do wektora
-transformacja do bakterii
Co to jest GMO?
Organizmy modyfikowane genetycznie – GMO. Są to organizmy, które zawierają w swoim
genomie obce geny, pochodzące z innego organizmu.
Zakres manipulacji genetycznej:
- zmiana aktywności genów występujących w danym organizmie np. pomidor ze zmniejszoną
aktywnością genu odpowiedzialnego za dojrzewanie i mięknięcie
- wprowadzenie do organizmu dodatkowego jego własnego genu np. dodatkowe geny
odpowiedzialne za produkcję mleka u krów i owiec, co zwiększa ich mleczność

- wprowadzenie do organizmu nowego genu – połączenie: genów roślinnych z roślinnymi,
genów zwierzęcych ze zwierzęcymi i genów roślinnych ze zwierzęcymi lub ludzkimi

Strategia postępowania przy modyfikacji genetycznej roślin

Wytypowanie cechy przeznaczonej do modyfikacji

Ustalenie szlaku przemian biochemicznych związanych z daną cechą

Określenie enzymów katalizujących kluczowe ogniwa szlaku metabolicznego

Identyfikacja genów kodujących główne enzymy kontrolujące dany szlak metaboliczny

Przeprowadzenie modyfikacji genetycznej

Analiza ekspresji nowej cechy

Potwierdzenie przydatności technologicznej nowego surowca

Badania związane z biotechnologią – ryzykiem i bezpieczeństwem konsumentów

Charakterystyka wprowadzanych konstrukcji genowych
Konstrukcja genowa powinna zawierać:
-gen lub fragment genu
- promotor (najczęściej 35S z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV)- jest to promotor
konstytutywny ulegający ekspresji we wszystkich tkankach, organach)
- terminator (najczęściej nos z genu kodującego syntezę nopali nową u Agrobacterium
tumefaciens)
- gen selekcyjny (np. oporność na antybiotyki lub herbicydy)
- gen reporterowy (wizualizujący np. gen uidA, GFP, gen lucyferazy)

Konstrukcja genowa

promotor

Gen selekcyjny
(markerowi)

Gen struktury

Gen reporterowy
(wizualizacyjny)

terminator

Co to są rośliny transgeniczne?
Roślina transgeniczna zawiera w swych komórkach włączony do chromosomów gen obcego
organizmu (innej rośliny, bakterii, zwierzęcia) lub zmodyfikowany własny gen.
Transformacja genetyczna – proces przenoszenia obcych fragmentów DNA do genomu
biorcy oraz integracja z tym genomem.
Wprowadzone fragmenty DNA ulegają ekspresji w genomie gospodarza przez co możemy
uzyskać rośliny o nowych lub ulepszonych cechach.


Transformacja roślin
- rośliny należą do najłatwiej transformowalnych wśród organizmów wyższych
- do ich transformacji używane są metody fizyczne i biologiczne
- do niedawna rośliny były jedynymi transgenicznymi organizmami dopuszczonymi do
powszechnego użytku

Transformacja komórek roślinnych
Genetyczna transformacja roślin polega na wprowadzeniu do komórki roślinnej egzogennego
DNA, a następnie jego integrację z genomem roślinnym.

Komórki przeznaczone do transformacji powinny być:

- kompetentne (zdolne do transformacji)
- totipotentne (zdolne do regeneracji całych organizmów)

Metody otrzymywania transgenicznych roślin
- wektorowe – wykorzystanie bakterii Agrobacterium tumefaciens. Plazmid Ti posiada
naturalną zdolność wbudowywania swojego DNA do genomu roślin.
Transfekcja – proces wprowadzenia obcego DNA lub RNA do komórki.

Infekcja Agrobacterium tumefaciens
Zranione komórki wydzielają związki (pochodne fenolu np. acetosyringon), które stymulują
geny vir w bakteriach. Następuje aktywacja genów odpowiedzialnych za infekcję rośliny
dwuliściennej. Gdy Agrobacterium zaatakuje roślinę tworzy się guz. Zachodzą
niekontrolowane podziały komórkowe.

Budowa plazmidu Ti:
-LB – lewa sekwencja graniczna poprawia efektywność transformacji
-RB- prawa sekwencja graniczna wymagana do rozpoznania i przeniesienia T-DNA
*T-DNA- rozwój guza, synteza opin, katabolizm opin, automatyczna replikacja, region
wirulencji

Odcinki graniczne: prawy i lewy odpowiadają za wycinanie i integrację odcinka T – DNA
T – DNA: geny odpowiedzialne za syntezę auksyn i cytokinin, geny warunkujące syntezę

Opin
Region wirulencji: geny odpowiedzialne za wycinanie T – DNA


Etapy procesu transformacji:
- bakterie przyczepiają się do komórek roślinnych – do 200 bakterii może się przyczepić do 1
komórki roślinnej
- przeniesienie DNA do komórki roślinnej – kilka obszarów T –DNA może być przeniesione
do 1 komórki roślinnej

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium

1. Inokulacja
2. Odpłukanie bakterii
3. Umieszczenie eksplantantów na pożywce stymulującej regenerację
4. Selekcja
5. Regeneracja roślin

Metody bezwektorowe
Bezpośrednia transformacja protoplastów
- elektroporacja – chwilowa dezintegracja błony komórkowej za pomocą pola elektrycznego
podczas inkubacji komórek z egzogennym DNA
- transformacja indukowana chemicznie - chwilowa dezintegracja błony komórkowej
następuje pod wpływem środków chemicznych. Najczęściej stosowany jest PEG (glikol
polietylenowy)

Mikrowstrzeliwanie – wstrzeliwanie do komórek kulek ze złota lub wolframu opłaszczonych
DNA, które chcemy wprowadzić

Schemat działania aparatu do transformacji metodą mikrowstrzeliwania

Metodyka transformacji
- przygotowanie mikronośników
- przygotowanie tkanki roślinnej

- strzał (prędkość pocisku kilkaset m/s)
- selekcja i regeneracja

1 strzał to:
-500 µg pocisków,
-1 µg DNA
-1 pocisk: 0,01 – 0,1 pg

Lipofekcja – spłaszczanie egzogennego DNA lipidami, które spontanicznie wnikają przez
błonę komórkową do cytoplazmy

Mikroiniekcja – wprowadzenie fragmentu DNA za pomocą mikropipety

Po wprowadzeniu nowego genu do komórki roślinnej kolejnym etapem jest selekcja. Należy
wyeliminować komórki, które nie uległy transformacji.
-Najczęściej razem z trans genem wprowadza się gen oporności na antybiotyk.
-Komórki typu dzikiego obumierają na pożywce z antybiotykiem.

Rozpoznanie i identyfikacja roślin transgenicznych
W genom rośliny zostaje wbudowana tylko część konstrukcji genowej zawarta wewnątrz
krótkich fragmentów T-DNA, składa się ona z:
- promotora
- sekwencji kodującej
- terminatora
- markera selekcyjnego, reporterowego
Kontrolę jakościową i ilościową:
- PCR – analiza kwasów nukleinowych
- immunodetekcja – analiza produktów białkowych

Opracowano metody detekcji dla:
- pomidora – z obniżonym poziomem poligalakturonazy
- ziemniaka – z drożdżową inwertazą
- soi, kukurydzy tytoniu, bawełny – z odpornością na choroby wirusowe

Cele modyfikacji roślin GMO:
Zmodyfikowane zostało większość roślin mających znaczenie dla człowieka. Cele
modyfikacji to:
- odporność na herbicydy – chemiczne środki ochrony roślin (soja, rzepak)
- odporność na szkodniki – modyfikacja Bt (np. kukurydza, bawełna)
- odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne
- odporność na niekorzystne warunki środowiska (zasolenie gleby, mróz, susza, metale
ciężkie)
- poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych (pomidor Flar Savr, Golden Rice,
szczepionki w warzywach)


Delta – endotoksyna (Bt)
- najczęściej stosowaną toksyną jest delta – endotoksyna (Bt) z bakterii Bacillus thuringensis
- B. thuringensis występuje naturalnie w glebie, wodzie i powietrzu. Jeden z
najbezpieczniejszych znanych insektycydów.
- odkryta w 1911r jako patogen moli mącznych w prowincji Thuringia w Niemczech
- zastosowanie jako komercyjnego pestycydu rozpoczęło się w 1938r we Francji, potem w
latach 50-tych w USA
- pierwotnie używana tylko jako środek przeciwko Lepidiptera

Działanie Bt:

- delta- toksyna jest produkowana w postaci protoksyny. Do aktywacji wymaga wysokiego
pH – ok. 9,5 – pH
- u larw z rodziny Lepidopterae w środkowym odcinku jelita pierwotnego występuje pH ok.
9,5 oraz odpowiednie proteazy
- po rozpuszczeniu w wysokim pH, protoksyna ulega rozcięciu w specyficznym miejscu.
Powstaje aktywna toksyna
- forma ta wiąże się do receptorów na komórkach jelita tworząc pory w błonie komórek jelita
i powodując wypływ jonów – destabilizacja i śmierć owada
-jelito ulega zniszczeniu poprzez Lizę komórek jelita, następuje obumarcie larwy

Sposoby pobierania toksyny przez organizmy:
-bezpośrednie zjadanie części rośliny
-zjadanie owadów, które zjadły wcześniej tą roślinę

Pomidor Flar Savr
- pierwsze GMO wprowadzone do obrotu
- dopuszczony do sprzedaży tylko w USA w 1994r
- wprowadzony odwrócony gen poligalakturonazy (PG) w orientacji antysensownej (w
konstrukcji genowej był gen kodujący poligalatkuronazę, ale został wprowadzony obrócony o
180o)
- RNA powstałe po transkrypcji odwróconego genu łączyło się komplementarnie z mRNA
prawidłowego genu PG
- rybosom nie mógł się przyłączyć – brak syntezy białka

Złoty ryż
- 20 razy więcej beta- karotenu
- wprowadzono dwa geny: syntezę fitoenu (psy) i desaturazę karotenu (crtl)
- zwiększona zawartość żelaza – wprowadzono gen ferrytyny (przyswajanie żelaza)

Potencjalny negatywny wpływ na środowisko:
- wpływ na organizmy niedocelowe: potencjalnym zagrożeniem mogą być odmiany typu Bt
odporne na szkodniki; stosuje się odpowiednio zmienione białka Cry tak, aby działały w
przewodach pokarmowych konkretnych owadów
- presja selekcyjna – pojawienie się super chwastów i super patogenów. Należy często
zmieniać środki ochrony roślin oraz stosować płodozmian, zmniejszając w ten sposób presję
selekcyjną.
- czy nowe geny mogą być przenoszone na inne rośliny? Wprowadzone do roślin uprawnych
nowe geny mogą przenosić się przez krzyżowanie na inne rośliny uprawne i gatunki blisko
spokrewnione występujące w przyrodzie. W takim wypadku mogą powstać w przyrodzie
rośliny (często nazywane super chwastami) tolerujące np. herbicydy

Żywność GM
co jest znakowane:
- żywność
- składniki żywności
- dodatki do żywności
- pasza
- dodatki do paszy
- substancje smakowe

Zwierzęta modyfikowane genetycznie:
Terminem transgeniczne zwierzę określa się takie zwierzę, które w swoim genomie posiada
egzogenny DNA w postaci
- losowo zintegrowanego fragmentu DNA
- zmodyfikowanego własnego genu w wyniku wprowadzenia egzogennego DNA (technologia
knock-out)

- wprowadzonej całej jednostki genetycznej, np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC
lub sztucznego chromosomu drożdżowego YAC

Metody otrzymywanie zwierząt GM:
- mikroinekcja DNA do zygoty
- modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES (Embryonic Stem Cells)
- transplantacja jąder komórkowych
- transfer DNA przy pomocy wirusów

Mikroinekcja:
- przeżywa 50% zarodków
- rodzi się ok., 30% przetransferowanych myszy, z czego 15% posiada zintegrowany transgen
- z 1000 zarodków – 22 sztuki

Modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych
Embryonic Stem Cells (ES) – komórki uzyskane z węzła zarodkowego blastocysty. Można je
hodować in vitro przez dłuższy czas i ponownie wprowadzać do blastocysty po uprzednim
wprowadzeniu transgenu.
- otrzymujemy często organizmy chimeryczne – organizmy te zawierają komórki genetycznie
zmodyfikowane i nie modyfikowane

Transplantacja jąder komórkowych:
- polega na usunięciu jądra komórkowego z niezapłodnionego oocytu (komórki jajowej) i
wszczepieniu jądra z innej komórki – pochodzącej z organizmu jaki chcemy klonować. Jądro
można pobierać z komórek zarodka, z komórek hodowanych in vitro, a także z dorosłych
osobników.

Transfer DNA przy pomocy wirusów
- po wprowadzeniu obcego genu do genomu retrowirusa infekuje się nim komórki
embrionalne we wczesnym etapie rozwoju. Uzyskane embriony z transgenem wprowadza się
do matki zastępczej i otrzymujemy najczęściej potomstwo mozaikowe. Tą metodą można
wprowadzać niewielkie fragmenty DNA

- infekcje jednokomórkowych zarodków

- infekcje pierwotnych komórek zarodkowych ES

Knock-out genu
- celem jest usunięcie określonego genu pozostawiając pozostałe geny nienaruszone, aby móc
określić konsekwencje dla organizmu pozbawionego tylko jednego badanego genu

Cechy produkcyjne zwierząt transgenicznych:
Modyfikacje genetyczne mogą poprawiać niektóre cechy produkcyjne zwierząt gospodarskich
takich jak:
-tempo wzrostu i produkcja mięsa
- wydajność i jakość mleka
- ilość i jakość wełny
- odporność na choroby
- szybsze lub kontrolowane rozmnażanie
- lepsze wykorzystanie paszy

Celowość modyfikacji zwierząt:
Wykorzystanie zwierząt jako bioreaktorów:
Modyfikowane przede wszystkim krowy, owce, kozy – wytwarzane białka wydzielane z
mlekiem np. produkcja antytrombiny (czynnik odpowiedzialny za krzepliwość krwi),
antytrypsyny (leczenie rozedmy płuc), erytropoetyny (leczenie anemii), laktoferytyny
(niedobór żelaza)
Większa wydajność mleczna

Dodatkowe kopie genów kodujących beta i kappa- kazeinę
odporność na choroby
Wytwarzanie przez zwierzęta swoistych immunoglobulin, co zwiększa odporność na choroby,
np. kury odporne na wirus ptasiej grypy – prace prowadzone w Chinach; krowy odporne na
choroby powodowane przez priony np. BSE zwaną chorobą szalonych krów.

Modyfikowane świnie jako dawcy narządów
TG 1154 ma wbudowany gen, który może znieść immunologiczną barierę międzygatunkową
pomiędzy świnią i człowiekiem.

Do celów naukowych:
Badanie funkcji genów, terapia genowa, układy modelowe chorób ludzkich, np. zablokowanie
funkcjonowania badanego genu u myszy, a następnie obserwacja cech fenotypowych
osobnika w celu poznania funkcji badanego genu.