Medycyna Wet. 2006, 62 (5)

557

Praca oryginalna

Original paper

Zainteresowanie zjawiskiem mineralizacji tkanki

kostnej jest w obecnej chwili niewielkie. Natomiast

schorzenia metaboliczne organizmu czy te¿ aparatu

ruchu wywo³uj¹ce zmiany w koœciach s¹ przedmio-

tem licznych badañ naukowych. W wyniku braku ro-

zumienia podstawowych zjawisk mineralizacji koœci

proponuje siê ró¿ne metody ich leczenia, które nie maj¹

istotnego prze³o¿enia na procesy czynnoœciowo-mor-

fologiczne.

Proces mineralizacji zale¿y od wielu czynników

hormonalnych, witamin czy te¿ niezbêdnych pierwiast-

ków. Zwi¹zane z tym nieprawid³owoœci w ¿ywieniu,

fizjologii wch³aniania czy wydalania doœæ ³atwo mo¿e

je zaburzyæ. Wed³ug jednych autorów jest to proces

fizykochemiczny (9), wed³ug innych w znacznej mie-

rze uzale¿niony i kontrolowany przez komórki tkanki

kostnej na drodze dwóch niezale¿nych dzia³añ (6, 8,

10). Pierwszym jest inicjacja procesu mineralizacji

poprzez wydzielenie pêcherzyków macierzy, drugim

szeroko pojêta kontrola sk³adu macierzy miêdzyko-

mórkowej (w tym p³ynu œródtkankowego) i wp³ywa-

nie w ten sposób bezpoœrednio lub poœrednio na wzrost

kryszta³ów w obszarze kontrolowanym przez grupê

osteocytów, dziêki czemu stale wzrasta gêstoœæ koœci,

a¿ do œmierci komórek, kiedy indukowany jest lokal-

nie proces przebudowy tkanki kostnej. Poniewa¿ jest

on kontrolowany przez hormony i witaminy, a jego

efektem jest wzrost lub spadek poziomu jonów wap-

nia we krwi, uwa¿a siê, ¿e jest to g³ówny proces zwi¹za-

ny z homeostaz¹ tego pierwiastka w organizmie (6-8).

Fenomen mineralizacji wydaje siê ju¿ poznany, po-

zostaje jednak nie do koñca wyjaœniony zakres wp³y-

wu poszczególnych czynników na sk³ad mineralny

macierzy oraz jej stopieñ wysycenia. Do dziœ nie wia-

domo, czy mo¿e dochodziæ w warunkach in vivo do

„wyp³ukania”, a nastêpnie do remineralizacji macie-

rzy miêdzykomórkowej tkanki kostnej. Niektórzy au-

torzy uwa¿aj¹, ¿e takie odwapnianie koœci ma miejs-

ce stale w organizmie, co w konsekwencji doprowa-

dza do zwyrodnieñ, w tym do osteoporozy i osteope-

nii (2, 4, 7, 8, 10).

Inicjacja mineralizacji jest zwi¹zana z wytworze-

niem przez komórki tzw. „pêcherzyków macierzy”,

które s¹ ma³ymi (0,1-0,2 µm), pozakomórkowymi pê-

cherzykami wybiórczo umieszczonymi w macierzy

miêdzykomórkowej spotykanych w p³ytce wzrostu

chrz¹stki nasadowej koœci d³ugich, rozwijaj¹cej siê

koœci oraz kostninie (1, 3, 10). Pêcherzyki te zawiera-

j¹ liczne enzymy (fosfataza zasadowa, ATP-aza zasa-

dowa oraz pirofosfataza), bia³ka oraz lipidy, które od-

dzia³ywuj¹c miêdzy sob¹ doprowadzaj¹ do rozpoczê-

cia mineralizacji. Inicjacja mineralizacji rozpoczyna

siê na wewnêtrznej powierzchni pêcherzyków, gdzie

powstaj¹ pierwsze kryszta³y hydroksyapatytu w kszta³-

cie cienkich igie³ek, które rosn¹c powoli, zmieniaj¹

kszta³t pêcherzyków macierzy, aby w konsekwencji

doprowadziæ do ich rozerwania. B³ona zewnêtrzna

pêcherzyków jest biologicznie aktywna, co oznacza,

¿e ma ona zdolnoœæ do wybiórczego rozpoznania

miejsca zakotwiczenia w macierzy miêdzykomórko-

wej (1, 3).

Pierwsza faza jest wiêc procesem z³o¿onym inter-

akcji pomiêdzy cz¹steczkami wi¹¿¹cymi wapñ a en-

zymami bior¹cych udzia³ w przemianach fosforu zlo-

kalizowanych w okolicy b³ony pêcherzyków macie-

rzy. Faza druga rozpoczyna siê w momencie kontaktu

Mineralizacja tkanki kostnej

PIOTR KUROPKA, JAN KURYSZKO, SYLWIA MAZURKIEWICZ-£YCZEWSKA

Zak³ad Histologii i Embriologii, Katedra Anatomii i Histologii Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej, AR Wroc³aw,

ul. Ko¿uchowska 5, 51-631 Wroc³aw

Kuropka P., Kuryszko J., Mazurkiewicz-£yczewska S.

Bone mineralization

Summary

The study looked at various different authors’ opinions on the process of bone mineralization. Its aim was

to induce the mineralization of decalcified bones in-vitro. The study used dog, sheep as well as human bones

which were subjected to decalcification after a preliminary analysis of their composition of elements using

a scanning electron microscope equipped with an X-ray probe. Following this, re-mineralization was attempted

by submersion in a replete solution of calcium phosphate and free vaporization of the water in a temperature

of 35°C. This resulted in attaining crystals which were not hydrocsyapatite on the bone’s surface. The study

indicated that simple chemical phenomena cannot be the main factor causing bone mineralization.

Keywords: bones, mineralization

Medycyna Wet. 2006, 62 (5)

558

nowo powsta³ego kryszta³u na p³yn œródtkankowy. Sta-

je siê on wówczas j¹drem krystalizacji, wokó³ którego

na jego powierzchni rozpoczyna siê wzrost kryszta³u

poprzez wytr¹canie kolejnych warstw jonów wapnia

i fosforu.

Mineralizacja jest wiêc procesem fizykochemicz-

nym, w znacznym stopniu uzale¿nionym od sk³adu

p³ynu œródtkankowego, w tym bia³ek kolagenowych

oraz niekolagenowych. O roli, jak¹ odgrywaj¹ te bia³-

ka, niech œwiadczy fakt, ¿e osteokalcyna, bia³ko wy-

dzielane przez osteoblasty w póŸnej fazie ró¿nicowa-

nia, wi¹¿¹c siê z wapniem na powierzchni hydroksy-

apatytu, hamuje wzrost kryszta³u, jednoczeœnie staj¹c

siê czynnikiem chemotaktycznym dla osteoklastów (2,

5, 6).

Przedstawiony mechanizm wskazuje, ¿e ostateczny

sk³ad oraz stopieñ mineralizacji jest uzale¿niony od

komórek pozostaj¹cych w tkance kostnej, bêd¹c jed-

noczeœnie odbiciem stanu metabolicznego ca³ego or-

ganizmu. Powracaj¹ce dyskusje dotycz¹ce metaboliz-

mu wapnia, w których pomijane b¹dŸ te¿ nadmiernie

eksponowane s¹ zjawiska zachodz¹ce w koœciach,

doniesienia o zjawisku nadmiernej mineralizacji bla-

szek kostnych po œmierci komórek kostnych oraz licz-

ne w³asne obserwacje sk³oni³y nas do przeprowadze-

nia licznych badañ porównawczych z zakresu minera-

lizacji tkanki kostnej u zwierz¹t wraz z prób¹ wywo-

³ania zjawiska remineralizacji w³ókien kolagenowych

w warunkach in vitro.

Materia³ i metody

Badania wykonywano w Pracowni Mikroskopii Elektro-

nowej przy pomocy skaningowego mikroskopu elektrono-

wego (SEM) Zeiss 435VP wyposa¿onego w mikrosondê

rentgenowsk¹. Materia³ do badañ (18 sztuk) pochodzi³

z trzonów koœci d³ugich (udowej i piszczelowej) zdrowych

psów, owiec oraz cz³owieka w ró¿nym wieku pozosta³ych

w Zak³adzie po innych badaniach, które po wczeœniejszej

mikroanalizie rentgenowskiej by³y odwapniane w werse-

nianie dwusodowym (EDTA), a nastêpnie zanurzane w roz-

tworze nasyconym fosforanu wapnia, który by³ poddany

powolnemu odparowywaniu wody w temperaturze 35°C.

Nastêpnie materia³ by³ suszony w punkcie krytycznym

i analizowany w SEM. Obiekty wykazuj¹ce budowê kry-

staliczn¹ analizowano przy pomocy mikrosondy rentgenow-

skiej. Wykonany maping pierwiastków mia³ na celu zobra-

zowanie rozk³adu przede wszystkim wapnia, fosforu oraz

wêgla. Analizowano dodatkowo iloœciowy sk³ad pierwiast-

ków w próbkach i okreœlano w³aœciwe dla gatunku stosun-

ki wapnia do fosforu (Ca/P).

Wyniki i omówienie

Dysponuj¹c relatywnie niewielk¹ iloœci¹ materia³u

o du¿ym zró¿nicowaniu, trudno by³o przeprowadziæ

dok³adne badania mineralizacji koœci cz³owieka oraz

zwierz¹t, analizuj¹c je pod k¹tem wieku, p³ci czy te¿

sposobu od¿ywiania. Materia³ od ludzi pochodzi³ od

osób w wieku 60-70 lat, od psów – 2-17 lat, a od owiec

– tylko od samic w wieku 3 lat. Istotne jest, ¿e we

wszystkich próbkach obserwowane kryszta³y powsta-

³e w wyniku remineralizacji zachodz¹cej na powierzch-

ni odmineralizowanych w³ókien kolagenowch tkanki

kostnej nie by³y hydroksyapatytami. Najczêœciej by³y

to kalcyty oraz syderyty (ryc. 3, 4). Uwa¿amy, ¿e sy-

deryty powsta³y w najwiêkszym stopniu jako artefak-

ty, gdy¿ ¿elazo w tych warunkach musia³o pochodziæ

ze zhemolizowanych erytrocytów. Kalcyty natomiast

notowano niemal w ka¿dym przypadku. Du¿e i ma³e

kryszta³y tych minera³ów uk³ada³y siê na powierzch-

ni koœci pomiêdzy w³óknami kolagenowymi poszcze-

gólnych blaszek kostnych. Ich rozmiary waha³y siê od

10 do 150 µm. Wykonany maping nie wykaza³ istot-

nego powi¹zania atomów wapnia i fosforu w próbkach.

Interesuj¹cy jest fakt, ¿e równie¿ w koœciach nie pod-

danych ¿adnej obróbce nie uda³o siê stwierdziæ upo-

rz¹dkowanego rozmieszczenia wapnia i fosforu typo-

wego dla kryszta³ów hydroksyapatytu. Wykonana

wczeœniej analiza sk³adu pierwiastkowego wykaza³a,

¿e we wszystkich przypadkach dominuj¹cymi pier-

wiastkami by³y: C, O, Ca, P oraz niewielkie iloœci Mg,

Ryc. 1. Przyk³adowy wykres sk³adu pierwiastkowego koœci

psa przy u¿yciu mikrosondy rentgenowskiej

Ryc. 2. Wykres sk³adu pierwiastków koœci po odwapnieniu

Medycyna Wet. 2006, 62 (5)

559

Zn, Na, Fe (ryc. 1). Uzyskane t¹ metod¹ relacje sto-

sunku wapnia do fosforu (Ca/P) wykaza³y, ¿e najni¿-

szym œrednim wskaŸnikiem charakteryzowa³y siê koœ-

ci psów – 1,3, cz³owieka – 1,41, a najwy¿szym owcy

– oko³o 1,49, przy czym w koœciach cz³owieka wystê-

powa³y najwiêksze zró¿nicowania, zarówno w mikro-

obszarach, jak i porównuj¹c koœci w ró¿nym wieku

oraz p³ci. U zwierz¹t brak ww. fluktuacji mo¿e byæ

spowodowany relatywnie krótkim czasem ¿ycia, gdy¿

nawet u relatywnie starego psa (17 lat) czas zwi¹zany

z zaistnieniem istotnych zmian w koœciach mo¿e byæ

zbyt krótki w porównaniu z cz³owiekiem. W koœciach

poddanych procesowi remineralizacji, poza obszara-

mi wystêpowania kalcytów, dominuj¹cym pierwiast-

kiem, obok wêgla i tlenu pozosta³ fosfor, którego za-

wartoœæ w koœciach kilkukrotnie przewy¿sza³a zawar-

toϾ wapnia (ryc. 2).

Reasumujac, przeprowadzone badania metod¹ od-

parowywania wody z nasyconego roztworu fosforanu

wapnia w obecnoœci odmineralizowanej koœci nie

mo¿na doprowadziæ do remineralizacji macierzy tkanki

kostnej, co sugeruje, ¿e proste zjawiska fizykochemicz-

ne nie mog¹ byæ g³ówn¹ przyczyn¹ fenomenu prze-

mian wapnia w koœciach. Jednoczeœnie nie mo¿na

wykluczyæ, ¿e w tak prostym eksperymencie zabrak³o

kilku istotnych czynników, takich jak regulacja pH czy

te¿ wymuszony przep³yw p³ynów spowodowany na-

prê¿eniami czynnoœciowymi, na jakie jest nara¿ona

koœæ w trakcie pe³nienia swojej funkcji.

Piœmiennictwo

1.Bonucci E.: Electron microscope studies of the early stage of the calcifica-

tion process: role of matrix vesicles. Prog. Clin. Biol. Res. 1989, 295, 109-114.

2.Glimcher M. J.: The structure of mineral component of bone and the mecha-

nism of calcification, [w:] Coe F. L., Favus M. J.: Disorders of bone and

mineral metabolism. Raven Press, New York 1992.

3.Harada K., Oida S., Saski S.: Chondrogenesis and osteogenesis of bone mar-

row-derived cells by bone – inductive factor. Bone 1988, 9, 177-183.

4.Kokot F., Ficek R.: Regulacja gospodarki wapniowej. Nowe aspekty pato-

fizjologiczne. Pol. Arch. Med. Wewn. 2000, 104, 621-630.

Ryc. 4. Skaningogram odwapnionej koœci owcy po próbie

wywo³anej remineralizacji. Widoczne na powierzchni koœci

kalcyty powsta³y po wolnym odparowaniu wody z zawiesiny

fosforanu wapnia. SEM 2300 ×

Ryc. 3. Skaningogram odwapnionej koœci cz³owieka. Widocz-

ny fragment naczynia oraz w³ókna kolagenowe. SEM pow.

1000 ×

5.Lindholm T. S., Nilsson O. S., Lindholm T. C.: Extraskeletal and intraskeletal

new bone formation induced by demineralized bone matrix combined with

bone marrow cells. Clin. Orthop. 1982, 171, 251-255.

6.Mundy R. G., Martin T. J. (ed.): Physiology and pharmacology of bone. Sprin-

ger Verlag. Berlin, Heildelberg, New York 1993.

7.Murray J., Gagel R. F., Christakos S., Kleerekoper M., Shane E., Langman C.,

Stewart A., Whyte M.: Primer on the metabolic bone diseases and disorders

of mineral metabolism; Lippincott-Raven, Philadelphia, New York 1993.

8.Parfitt A. M.: Morphologic basis for bone mineral measurements: transient

and steady state effects of treatment in osteoporosis. Miner. Electrolyte Me-

tab. 1980, 4, 273-287.

9.Pawlikowski M.: Kryszta³y w organizmie cz³owieka. Secesja. Kraków 1993.

10.Scherft J. P., Groot C. G.: The electron microscopic structure of the osteo-

blast. Ultrastructure of skeletal tissues. Bone and cartilage in health and

disease. Kulwer Akademic Publishers Boston-Dordrecht-London 1990.

Adres autora: dr Piotr Kuropka, ul. Ko¿uchowska 5, 51-631 Wroc³aw