1
Rozdział 12
Białka
Krzysztof Siemianowicz
Dorota Polańska
Białka są zbudowane z łańcucha utworzonego przez aminokwasy. Stopnie
złożoności budowy białka są określane przez kolejną rzędowość (I-IV) jego
struktury.
Pierwszorzędowa
struktura białka określa sekwencję
aminokwasów. Geometryczne właściwości wiazań peptydowych i wynikająca
stąd konformacja łańcucha polipeptydowego warunkuje
drugorzędową
strukturę białka. Przestrzenne uformowanie pofałdowanego lub skręconego
łańcucha polipeptydowego bądź wzajemne usytuowanie kilku łańcuchów
warunkuje strukturę
trzeciorzędową
. Wpływają na nią głównie wiązania
wodorowe i di
siarczkowe. Niektóre białka mają budowę podjednostkową.
2
Wzajemny
układ
przestrzenny
podjednostek
określa
strukturę
czwartorzędową
.
Ze względu na swoją strukturę i właściwości fizykochemiczne białka dzielimy
na:
globularne
o kształcie kuli lub elipsoidy obrotowej. Stosunek długości
osi długiej do krótkiej cząsteczki białka nie przekracza 20. Białka
globularne zwykle są rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli.
Przykładem tej grupy białek są albumina i globuliny.
fibrylarne
(włókienkowe), dla których stosunek osiowy osiąga
wartość około 200. Są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie i
roztworach soli. Przykładem tej grupy białek są kolagen, elastyna i
keratyna.
Uwzględniając składniki tworzące białko można wśród białek globularnych
wyodrębnić:
białka proste
zbudowane tylko z aminokwasów,
białka złożone
(skoniugowane), które obok części białkowej
zawierają istotną dla swojej funkcji nieorganiczną lub organiczną
część niebiałkową.
Glikoproteiny
zawierają obok białka węglowodany obojętne (np.
galaktozę, mannozę, fruktozę), aminocukry (N-acetylogalaktozoaminę,
N-
acetyloglukozoaminę) lub kwasowe pochodne monocukrów (kwas
uronowy, kwas sjalowy).
Lipoproteiny
zawierają trójglicerydy, cholesterol,
estry cholesterolu i fosfolipidy. W
metaloproteinach
atom metalu jest
3
związany koordynacyjnie lub jonowo. W
fosfoproteinach
reszta kwasu
fosforowego jest połączona wiązaniem estrowym z resztą seryny lub
treoniny.
Nukleoproteiny
są zasocjowane z kwasami nukleinowymi (np. w
rybosomach).
Chromoproteiny
(np. hemoproteiny) zawierają barwny
związek jako grupę prostetyczną.
Funkcje białek
strukturalne
– pełnią je białka tkanki łącznej, a wewnątrzkomórkowo
białka mikrofilamentów
enzymatyczne
– enzymy katalizują większość reakcji chemicznych
zachodzących w organizmie
regulatorowe
– aktywatory i inhibitory enzymów regulują szereg
procesów
przekazywanie informacji
zewnątrzkomórkowo – hormony białkowe i cytokiny
wewnątrzkomórkowo – np. białka G
receptory komórkowe – warunkują odpowiedź komórki na określone
bodźce
transportowe
– transport zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy
związków trudno rozpuszczalnych w wodzie, przenoszenie elektronów w
łańcuchu oddechowym
magazynowe
– np. ferrytyna gromadzi jony żelaza
odpornościowe
odporność swoista – immunoglobuliny
odporność nieswoista – układ dopełniacza, interferony
krzepnięcie krwi
4
kurczliwość – białka włókien mięśniowych
funkcje buforowe
Wybrane właściwości fizykochemiczne białek
Charakter amfolityczny
W zależności od pH roztworu cząsteczki białka wykazują w środowisku
kwaśnym nadmiar ładunku dodatniego, a w środowisku zasadowym nadmiar
ładunku ujemnego. Punkt izoelektryczny białka określa takie pH, w którym
dane białko występuje w postaci jonu obojnaczego. Ładunki dodatnie i
ujemne się równoważą dając ładunek sumaryczny równy zeru.
Rozpuszczalność
Rozpuszcalność białek zależy od pH i siły jonowej roztworu, stałej
dielektrycznej rozpuszczalnika i od cech strukturalnych danego białka.
Wsalanie
– określone stężenie soli powstrzymuje asocjację lub agregację
cząsteczek białka i poprawia jego rozpuszczalność. Ten efekt dotyczy białek
o asymetrycznym rozkładzie ładunku w cząsteczce.
Wysalanie
– określone stężenie soli powoduje powstrzymanie hydratacji
białka i jego wytrącenie z roztworu.
Denaturacja
Są to określone zmiany wywołane czynnikami fizycznymi lub chemicznymi
prowadzące do utraty aktywności biologicznej i niektórych cech
5
fizykochemicznych białka. W trakcie denaturacji białka dochodzi do zerwania
wiązań wodorowych, hydrofobowych, a niekiedy także dwusiarczkowych.
Proces denaturacji nie zmienia struktury pierwszorzędowej białka. Jeśli w
trakcie denaturacji białka jego nowa konformacja nie została utrwalona
poprzez wytworzenie nowych w
iązań dwusiarczkowych, nowych wiązań
kowalencyjnych lub poprzez niespecyficzne utlenienie, to proces denaturacji
jest odwracalny
– możliwa jest renaturacja. W przeciwnym wypadku
denaturacja jest nieodwracalna.
Białka osocza
W osoczu krwi człowieka wykazano obecność około 300 różnych białek, z
których każde ma specyficzną dla siebie budowę i pełni jedną lub kilka
określonych funkcji. Stężenia poszczególnych białek osocza mogą się
zmieniać w różnych okresach życia i stanach fizjologicznych.
Funkcje bialek osocza
Regulacja ciśnienia koloidosomotycznego (onkotycznego).
Około 3-4
krotnie większe stężenie białka w przestrzeni wewnątrznaczyniowej w
stosunku do przestrzeni pozanaczyniowej zapobiega ucieczce wody ze
światła naczynia do przestrzeni pozanaczyniowej i zapewnia kontrolę
dystrybucji płynów przestrzeni pozakomórkowej. Zaburzenie tej funkcji staje
się widoczne, gdy pojawiają się obrzęki spowodowane obniżeniem stężenia
białka całkowitego w osoczu. Głównym białkiem pełniącym tę funkcję jest
albumina z racji
swego dominującego udziału procentowego w puli białek
osocza.
Funkcje
transportowe.
Albumina
stanowi
niespecyficzny
układ
transportujący hormony, bilirubinę, wolne kwasy tłuszczowe, jony metali,
6
witaminy oraz leki. Wiele leków, hormony, jony wapnia wykazują aktywność
biologiczną tylko w formie wolnej, w przeciwieństwie do formy związanej z
białkiem. Zmiany stężenia białka całkowitego oraz jego zdolności wiązania
poszczególnych leków, hormonów, bilirubiny i wapnia mogą mieć istotne
znaczenie
kliniczne.
Oprócz
albuminy
wyspecjalizowane
funkcje
tr
ansportowe pełnią inne białka. np. transferyna transportuje żelazo,
lipoproteiny transportują poszczególne lipidy (ich funkcje zostały
przedstawione w rozdziale „Lipoproteiny osocza”), TBG (Thyroxine Binding
Globulin
– globulina wiążąca tyroksynę) i TBA (Thyroxine Binding
PreAlbumine
– prealbumina wiążąca tyroksynę) transportują tyroksynę,
SHBG (Sex Hormone Binding Globulin
– globulina wiążąca hormony
płciowe) transportuje hormony płciowe, RBP (Retinol Binding Protein –
białko wiążące retinol) przenosi retinol.
Udział w krzepnięciu krwi
. Większość osoczowych czynników krzepnięcia
jest białkami.
Udział w fibrynolizie
. Enzymy fibrynolizy również są białkami.
Funkcje
enzymatyczne.
Oprócz
enzymów
proteolitycznych
zaangażowanych w procesy krzepnięcia i fibrynolizy, inne białka pełnią
funkcje enzymatyczne, np. ceruloplazmina katalizuje utlenienie żelaza z Fe
2+
do Fe
3+
, które następnie jest wiązane przez transferynę. W podziale
klinicznym enzymów są one określane jako enzymy sekrecyjne (opisane w
rozdziale pt. „Enzymy ważne klinicznie”).
Regulacja aktywności enzymów.
Układ krzepnięcia oraz układ aktywacji
dopełniacza
są
przykładami
kaskadowej
aktywacji
enzymów
proteolitycznych. PAI-1 i PAI-2 (Plasminogen Activator Inhibitor
– inhibitor
7
aktywatora plazminogenu) są elementami regulacji równowagi pomiędzy
procesami krzepnięcia i fibrynolizy.
Funkcje odpornościowe.
Immunoglobiliny stanowią układ odporności
swoistej, natomiast układ dopełniacza jest elementem odporności
nieswoistej.
Funkcje hormonalne.
Niektóre hormony produkowane przez przysadkę
mózgową oraz gonadotropina kosmówkowa mają budowę białkową.
Funkcje buforowe.
Dzięki swojej budowie białka osocza mają właściwosci
buforowe i odpowiadają za około 18% pojemności buforowej krwi.
Metody oznaczania białek osocza
Ponieważ białka osocza stanowią mieszaninę związków o różnych masach
czastecz
kowych, a ich proporcje mogą się istotnie zmieniać w różnych
stanach patologicznych, przyjęto nie podawać stężenia białka całkowitego w
jednostkac
h układu SI (w milimolach/litr), lecz w gramach/litr lub
gramach/decylitr
. Metody oznaczania stężenia białka polegają na
wykorzystaniu właściwości chemicznych lub fizycznych wspólnych dla
wszystkich białek osocza.
Metoda Kjeldahla
Jest metodą referencyjną przy standaryzacji innych metod ilościowego
oznaczania białka.
Polega na ilościowym oznaczeniu azotu w białku. W celu oznaczenia azotu
zawartego w białkach należy próbkę oczyścić z innych związków
zawierających azot pozabiałkowy (jego zawartość jest znacznie niższa niz
azotu białkowego).
8
W pierwszym etapie przeprowadza się mineralizację związków organicznych
(wśród nich ilościowo dominuje białko) kwasem siarkowym w obecności
katalizatora (jony miedziowe lub rtęciowe). Azot zawarty w tych związkach
przechodzi w siarczan amonowy.
azot organiczny + H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
Pod wpływem stężonego wodorotlenku sodowego w kolbie aparatu
destylacyjnego z powstałego siarczanu amonowego jest uwalniany
amoniak.
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH
Na
2
SO
4
+ 2 H
2
O + 2 NH
3
W odbieraln
iku powstały amoniak wiąże sie z kwasem siarkowym lub solnym
o znanym stężeniu.
2NH
3
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
Pozostałą cześć kwasu, która nie przereagowała z amoniakiem oznacza się
ilościowo poprzez miareczkowanie.
H
2
SO
4
+ 2NaOH
Na
2
SO
4
+ 2H
2
O
Następnie oblicza się ilość azotu w próbce, którą się przelicza na zawartość
białka. Średnia zawartość azotu w białkach surowicy wynosi 16%, czyli
9
współczynnik przeliczenia dla białek surowicy wynosi 6,25. Zawartość azotu
w poszczególnych oczyszczonych białkach jest różna: np. 12% dla mucyn i
30% dla protamin, dlatego oznaczając stężenia poszczególnych białek
należy uwzględnić różne współczynniki.
Metody kolorymetryczne
Najczęściej stosuje sie metodę biuretową i metodę Lowry’ego.
Metoda biuretowa
– jony miedziowe w środowisku zasadowym wiążą się
z wiązaniami peptydowymi tworząc kompleks o zabarwieniu fiołkowym. Ta
reakcja nosi nazwę reakcji Piotrowskiego na cześć swego odkrywcy.
Dodatnią reakcję dają związki posiadające co najmniej dwa wiązania
peptydowe. Oprócz białek są to również peptydy, amidy -aminokwasów i
inne związki. Najprostszym związkiem dającym tę reakcję jest biuret, produkt
kondensacji dwóch cząsteczek mocznika. Metody biuretowej nie należy
stosować do oznaczania białek w obecności soli amonowych i siarczanu
magnezu, ponieważ obie sole zaburzają ilościowe wiązanie jonów
miedziowych.
Metoda Lowry’ego i wsp.
– jest oparta na reakcji barwnej dawanej przez
dwa odczynniki. Białko reaguje z jonami miedziowymi w środowisku
zasadowym dając reakcję biuretową oraz dochodzi do redukcji odczynnika
fosforo-molibdenowego
(odczynnika
Folina-
Ciocalteau)
do
błękitu
molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan. Ze względu na
różny skład aminokwasowy i różną zawartość tyrozyny i tryptofanu
10
poszczególne białka mogą dawać różne natężenie barwy z odczynnikiem
Folina-
Ciocalteau, należy więc stosować odpowiednie wzorce białkowe.
Inne związki reagujące z odczynnikiem Folina-Ciocalteau (fenole i ich
pochodne, kwas moczowy, puryny, pirymidyny) powodują zwiększenie
natężenia barwy. Siarczan cynku i siarczan amonowy (w stężeniu powyżej
0,1%), zobojętniony kwas trójchlorooctowy i nadchlorowy, aceton, mocznik
(w stężeniu powyżej 1%) oraz etanol i eter (w stężeniu powyżej 5%) oraz
zanieczyszenie DNA w oznaczanej próbce zmniejszają natężenie barwy.
Bufory fosforanowe o stężeniu wyższym niż 0,1 M powodują zmętnienie
prób. Metoda Lowry’ego jest znacznie czulsza od metody biuretowej i
umożliwia oznaczanie białka w zakresie stężeń 10-100 mg/l.
Metody turbidymetryczne (zmętnieniowe)
Do tej grupy metod należy metoda Extona. Kwas sulfosalicylowy i siarczan
sodowy powodują wytrącenie białka z roztworu. Powstałe zmętnienie
oznacza się mierząc absorbancję. Ta metoda jest zwykle stosowana do
oznaczania stężenia białka w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym.
Elektroforeza białek
Elektroforeza białek wykorzystuje różnice w wędrówce białek w polu
elektrycznym umożliwiając ich rozdział na frakcje. Najprostszym nośnikiem,
na którym można dokonać rozdziału elektroforetycznego białek surowicy jest
bi
buła. Wadą tego nośnika jest długi czas przeprowadzania elektroforezy
(ok. 16 godzin) i czasochłonna ocena zawartości procentowej
11
poszczególnych frakcji białkowych polegająca na ich elucji i oznaczaniu
kolorymetrycznym. Najczęściej dokonuje się rozdziału elektroforetycznego
na octanie celulozy lub agarozie. Stosowany bufor ma zwykle pH 8,6.
Większość białek w tych warunkach posiada ładunek ujemny i wędruje w
kierunku anody. Szybkość wędrówki białka w polu elektrycznym zależy od
ładunku elektrycznego cząsteczki białka, napięcia, wielkości cząsteczki
białka, pH i siły jonowej buforu oraz rodzaju nośnika. Standardowo w
rozdziale elektroforetycznym białek surowicy otrzymuje się frakcję albuminy i
4 frakcje globulinowe: 1, 2, i . W rozdziale elektroforetyczn
ym białek
osocza pomiędzy frakcją i globulin jest obecna frakcja zawierająca
fibrynogen. Aby uniknąć trudności interpretacyjnych spowodowanych tym
faktem zaleca się do elektroforezy białek używać surowicy zamiast osocza.
Po dokonaniu rozdziału w polu elektrycznym frakcje białkowe wybarwia się
czernią amidową lub innym barwnikiem łączącym się z białkiem. Po
utrwaleniu i odpłukaniu nadmiaru barwnika dokonuje się odczytu
densytometrycznego. Współczesne densytometry automatycznie wyliczają
zawartość procentową poszczególnych frakcji białkowych. Znając stężenie
białka całkowitego w danej próbce surowicy i zawartość procentową
poszczególnych frakcji białkowych można wyliczyć stężenie każdej z nich.
Albumina
jest białkiem globularnym o masie cząsteczkowej 66 kDa. Jest
wytwarzana w wątrobie i ma okres półtrwania w osoczu około 14 dni. U
poszczególnych osób zwykle występuje jeden rodzaj albuminy. Bardzo
rzadko występuje bisalbuminemia polegająca na występowaniu we krwi
dwóch rodzajów albuminy o różnym składzie aminokwasowym i różnej
ruchliwości elektroforetycznej. Bisalbuminemia jest dziedziczna i nie
powoduje konsekwencji klinicznych.
12
Frakcje globulinowe zawierają różne białka o identycznej lub podobnej
ruchliwości elektroforetycznej.
1-globuliny
– w tej frakcji występują:
1
-inhibitor proteaz,
1
-
kwaśna
glikoproteina (AAG, orozomukoid), -lipoproteiny (HDL).
2-globuliny
– w tej frakcji wystepują:
2
-makroglobulina, haptoglobina,
ceruloplazmina i niektóre immunoglobuliny.
-globuliny
– dodanie do buforu mleczanu wapnia pozwala rozdzielić tę
frakcję na
1
- i
2
-
globuliny, jednakże nie ma to istotnego znaczenia
klinicznego. Frakcja ta zawiera: transferynę, -lipoproteiny (LDL), składnik
C3 dopełniacza i niektóre immunoglobuliny.
-globuliny
– w tej frakcji występuje większość immunoglobulin i białko
C-reaktywne (CRP).
Na podstawie rozdziału elektroforetycznego bialek surowicy można
stwierdzić w sytuacjach patologicznych:
dysproteinemię
polegającą na zmanie stosunków ilościowych pomiędzy
poszczególnymi frakcjami białkowymi. Należy pamiętać, ze zmiana
zawartości procentowej danej frakcji białkowej nie musi oznaczać zmiany jej
stężenia,
paraproteinemię
, czyli pojawienie się dodatkowego pasma (frakcji), które
prawidłowo nie występuje, np. białka monoklonalnego (białko M)
produkowanego przez komórki nowotworowe wywodzące się z układu
immunologicznego. Występująca w surowicy hemoglobina (prawidłowo
występuje w ilościach śladowych) pochodząca z hemolizy erytrocytów może
dać obraz paraproteinemii.
13
Białka ostrej fazy
Jest to grupa białek osocza, których stężenie w różnym stopniu wzrasta w
odpowiedzi na proces zapalny, uraz tkanek, oparzenia, martwicę tkanek
oraz nowotwory
. Stany te określamy mianem ostrej fazy. Mediatory stanu
zapalnego (interleukina 6 i interleukina 1) produkowane i uwalniane do
krążenia w miejscu, gdzie toczy się proces zapalny docierają do wątroby i
indukują w hepatocytach produkcję białek ostrej fazy. Są one glikoproteinami
zawierającymi kwas sialowy. Ich stężenie w osoczu zaczyna rosnąć już po
upływie 2-5 godzin od wystąpienia stanu określonego mianem ostrej fazy.
Ich stężenie może rosnąć w niewielkim stopniu, np. ceruloplazminy około
dwukrotnie, aż do ponad 1000-krotnego wzrostu, jak w przypadku białka
C-
reaktywnego. Wiele z białek ostrej fazy to inhibitory proteaz mające
ograniczyć proteolityczne uszkodzenie tkanek do miejsca toczącego się
procesu
. W odpowiedzi na proces ostrej fazy stężenie niektórych białek
osocza ulega obniżeniu. Te białka określamy jako ujemne (negatywne)
białka ostrej fazy w odróżnieniu od pozostałych, czyli dodatnich
(pozytywnych) białek ostrej fazy. Najważniejszym negatywnym białkiem
ostrej fazy jest transferyna. Inne przykłady tej grupy to białko wiążące retinol
(RBP) i prealbumina. Niektórzy autorzy zaliczają albuminę do grupy
ujemnych białek ostrej fazy ponieważ spada jej zawartosć procentowa w
surowicy.
Białko C-reaktywne (CRP)
Jest pentamerem zbudowanym z identycznych podjednostek. Nazwa
pochodzi od zdolności wiązania się z polisacharydem C ściany komórkowej
bakterii Pneumococcus pneumoniae
. Białko C-reaktywne wiąże się z
wieloma składnikami obcych lub uszkodzonych własnych komórek i aktywuje
14
klasyczną drogę aktywacji dopełniacza. Aktywuje makrofagi i podobnie jak
przeciwciała rozpoczyna procesy opsonizacji, fagocytozy i lizy obcych
komórek. Stężenie CRP w osoczu wzrasta w czasie zakażeń bakteryjnych,
rozległych urazów, oparzeń, martwicy tkanek (np. zawału serca) i chorób
nowotworowych. Wzrost stężenia CRP rozpoczyna się po 12-24 godzinach
od wystąpienia procesu ostrej fazy. Maksymalne stężenie białka
C-
reaktywnego obserwuje się po około 48 godzinach, a normalizacja
następuje po około 2-3 tygodniach. Przy oznaczaniu stężenia w osoczu
białka C-reaktywnego metodami rutynowymi wzrost jego stężenia powyżej
górnego zakresu normy (10 mg/l) wskazuje na proces ostrej fazy.
Ostatnio coraz większe znaczenie zyskuje oznaczanie stężenia białka
C-
reatywnego metodami wysokiej czułości (hs-CRP, high sensitivity CRP).
Badanie to pozwala wykryć niewielki wzrost stężenia w osoczu, który w
badaniu metodami tradycyjnymi mieści się jeszcze w zakresie normy dla
stanów ostrej fazy. Stężenie białka C-reaktywnego (hs-CRP) powyżej 2 mg/l
jest jednym z najczulszych wskaźników wzrostu ryzyka wystąpienia choroby
niedokrwiennej serca i zawału serca. Oznaczanie poziomu białka
C-reaktywnego (hs-
CRP) ma duże znaczenie u osób z wieloma czynnikami
ryzyka choroby niedokrwiennej serca (opisanymi w rozdziale pt.
„Lipoproteiny osocza”), u których są prawidłowe wyniki oznaczeń
parametrów lipidowych. Ostanio znacznie wzrasta rola oznaczania hs-CRP
w monitorowaniu osób z chorobą niedokrwienną serca. Wynik oznaczenia
hs-
CRP powyżej 10 mg/l wskazuje na toczący się proces zapalny lub inną
przyczynę stanu ostrej fazy i wymaga ponownego oznaczenia po ustąpieniu
przyczyny ostrej fazy.
15
1
-inhibitor proteaz
Dawniej określany mianem
1
-
antytrypsyny. Hamuje aktywność proteaz.
Odpowiada za około 90% aktywności antytrypsynowej osocza. Jego główną
funkcją jest hamowanie aktywności elastazy granulocytarnej uwalnianej
podczas
fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste. Hamuje także
aktywność elastazy trzustkowej, trypsyny, chymotrypsyny, reniny, trombiny i
plazminy. W stanach zapalnych stężenie
1
-
inhibitora proteaz rośnie około
4-
krotnie osiągajac maksimum po 2-4 dniach.
Gene
tycznie uwarunkowany brak lub niedobór
1
-inhibitora proteaz
powoduje zwiększoną aktywność proteaz, a w szczególności elastazy
prowadząc do uszkodzenia wątroby i płuc. To zaburzenie jest przyczyną
genetycznie uwarunkowanej rozedmy płuc i rozstrzeni oskrzeli.
Ceruloplazmina
Jest późnym białkiem ostrej fazy. Jest syntetyzowana w wątrobie. Około 90-
95% miedzi w osoczu jest połączone z ceruloplazminą. Pełni funkcje
antyoksydacyjne chroniąc tkanki w stanach ostrej fazy. Katalizuje utlenienie
jonu żelazawego do jonu żelazowego umożliwiając jego wiązanie się z
transferyną. Wzrost poziomu ceruloplazminy obserwuje się w stanach
zapalnych, procesach martwiczych i przy stosowaniu estrogenów. Obniżenie
stężenia ceruloplazminy w osoczu występuje w chorobie Wilsona.
Haptoglobina
Jest tetramerem zbudowanym z 2 rodzajów podjednostek ( i ). W stanach
ostrej fazy jej stężenie zwiększa się wielokrotnie, wzrost stężenia
rozpoczyna się w ciągu 48 godzin, a normalizacja po około 9 dniach.
Haptoglobina wiąże się nieodwracalnie z hemoglobiną występujacą w
16
surowicy. Kompleks haptoglobina-hemoglobina jest szybko wychwytywany
przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego, gdzie oba białka są
rozkładane do aminokwasów. Wychwyt hemoglobiny przez haptoglobinę
zapobiega jej przedostawan
iu sie do kanalików nerkowych, gdzie mogłaby
spowodować ich uszkodzenie oraz zapobiega utracie żelaza. Ponieważ
kompleks haptoglobina-
hemoglobina ma krótszy okres półtrwania w osoczu
ni
ż sama haptoglobina, w przypadku hemolizy stężenie haptoglobiny ulega
z
mniejszeniu. Z tego powodu stężenie haptoglobiny w osoczu może nie
wzrastać, gdy ostrej fazie towarzyszy hemoliza.
1
-
kwaśna glikoproteina (AAG)
To białko ostrej fazy nosi również nazwę orozomukoid. W osoczu wiąże i
transportuje progesteron. W stanach zapa
lnych obserwuje się powolny
wzrost stężenia orozomukoidu (około 5 dni), który zwykle nie przekracza
200% górnej granicy normy.
2
-makroglobulina
Jest drugim ważnym inhibitorem proteaz. Wiąże się nieodwracalnie z
proteazami w kompleksy, które są wychwytywane przez układ siateczkowo-
śródbłonkowy. W większości chorób zmiany stężenia
2
-m
akroglobuliny są
niewielkie, co ogranicza jej znaczenie diagnostyczne. Ze względu na dużą
masę cząsteczkową (80 kDa) nie przechodzi do przestrzeni
pozanaczyniowej. W zespole n
erczycowym stężenie
2
-makroglobuliny
może wzrastać kilkukrotnie. Utrata z moczem białek o niskiej masie
cząsteczkowej powoduje nieselektywny wzrost syntezy białek w wątrobie, w
tym także
2
-m
akroglobuliny, która nie jest wydalana z moczem. W
17
elektroforezi
e białek surowicy obserwuje sie wtedy zwiększenie frakcji
2
.
Obecność
2
-m
akroglobuliny w moczu świadczy o przedostaniu się pełnej
krwi do moczu.
Fibrynogen
Pełni funkcje w układzie krzepnięcia. Jest pozytywnym białkiem ostrej fazy.
W stanach zapalnych po
początkowym niewielkim spadku spowodowanym
wzmożonym zużyciem, jego stężenie znacznie wzrasta, nawet do 15 g/l.
18
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Ćwiczenie 1.
Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka całkowitego w
surowicy metodą biuretową
Zasada metody
Białka i peptydy zawierające co najmniej dwa wiązania peptydowe reagują w
zasadowym roztworze z jonami miedzi w tak zwanej reakcji biuretowej z
wytworzeniem fioletowego kompleksu barwnego.
Materiał
surowica
Odczynniki
stężony odczynnik biuretowy (60 mmol/l CuSO
4
, 160 mmol/l winian sodowo-
potasowy),
roboczy odczynnik biuretowy (pięciokrotnie rozcieńczony stężony odczynnik
biuretowy),
wzorce białka o stężeniu 20, 40, 60, 80 g/l
19
Wykonanie
6
probówek chemicznych opisać jako: próba odczynnikowa, próba badana
i 4 próby wzorcowe. Następnie odmierzyć według schematu:
Składnik próby (ml)
Próba
Badana
(B)
Wzorcowa
(W)
Odczynnikowa
(O)
Surowica
0,05
-
-
Woda destylowana
-
-
0,05
Wzorce białka o stężeniu:
-
0,05
-
20 g/l
40 g/l
60 g/l
80 g/l
Roboczy odczynnik biuretowy
1,5
1,5
1,5
Zawartość probówek dokładnie wymieszać i po upływie 30 minut zmierzyć
ekstynkcję próby badanej oraz wzorcowej względem próby odczynnikowej
przy długości fali 540 nm. Sporządzić wykres zależności absorbancji od
stężenia białka i odczytać z niego stężenie białka w próbie badanej.
20
ĆWICZENIE 2.
Ilościowe oznaczanie białka metodą Extona
Zasada metody
Białko wytrąca się przez dodanie kwasu sulfosalicylowego w obecności
siarczanu sodowego. Intensywność powstałego zmętnienia określa się
metodą turbidymetryczną.
Materiał badany
p
łyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz
Odczynniki
0,
9% roztwór chlorku sodu.
w
zorcowy roztwór białka o stężeniu 1,5 g/l.
o
dczynnik sulfosalicylowy: odważyć 50 g kwasu sulfosalicylowego C
7
H
6
O
6
S
x 2H
2
O i 160 g siarczanu sodu krystalicznego Na
2
SO
4
x 10 H
2
O, a
następnie
rozpuścić w wodzie destylowanej. Uzupełnić do objętości 1 l.
21
Wykonanie
Do probówek chemicznych odmierzyć wg schematu:
Składnik próby (ml)
Próba
badana
(B)
wzorcowa
(W)
odczynnikowa
(0)
PMR* lub mocz
0,2
-
-
wzorcowy roztwór białka
-
0,2
-
0,9% NaCl
-
-
0,2
odczynnik sulfosalicylowy
1,5
1,5
1,5
*PMR -
płyn mózgowo-rdzeniowy
Zawartość probówek dokładnie wymieszać i zmierzyć absorbancję próby
badanej oraz wzorcowej wobec próby odczynnikowej przy długości fali 445
nm. Optymalny czas pomiaru absorbancji wynosi 4-10 minut po dodaniu
odczynnika sulfosalicylowego.
Obliczenia
Stężenie białka całkowitego w g/l, oblicza się wg wzoru:
W
B
A
A
C
5
,
1
A
B
– absorbancja próby badanej
A
W
– absorbancja próby wzorcowej
22
ĆWICZENIE 3.
Izolowanie i oznaczanie stężenia fibrynogenu w osoczu metodą
tyrozynową
Zasada metody
Fibrynogen zawarty w osoczu szczawianowym lub cytrynianowym
przekształca się we włóknik pod działaniem chlorku wapnia lub trombiny.
Oznaczen
ie stężenia fibrynogenu przeprowadza się kolorymetrycznie wg
metody Quicka poprzez pomiar zawartości tyrozyny w fibrynogenie (10,8 mg
fibrynogenu zawiera 1mg tyrozyny).
Materiał badany
osocze
Odczynniki
0,025 mol/l roztwór CaCl
2
: 2,777 g bezwodnego CaCl
2
r
ozpuścić i uzupełnić
wodą destylowaną do objętości 1000 ml
r
oztwór buforowy: 9 g NaCl, 0,8 g KH
2
PO
4
, 1,12 g Na
2
HPO
4
, 0,2 g CaCl
2
–
rozpuścić i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1000 ml
0,9% roztwór NaCl
5% roztwór NaOH
w
zorcowy roztwór tyrozyny: 40 mg tyrozyny rozpuścić w 100 ml 1/3 M H
2
SO
4
(18,2 ml stężonego kwasu uzupełnić wodą do objętości 1000 ml)
12,5% roztwór węglanu sodowego
r
ozcieńczony odczynnik Folina-Ciocalteau
23
r
oztwór trombiny, zawierający 50-100 jednostek tego enzymu w 1 ml
(ampułka 100 j. rozpuszczona w 4 ml soli fizjologicznej)
Wykonanie
1. Izolowanie fibrynogenu
Do 0,5 ml osocza
(przed pobraniem wstrząsnąć) dodać 4,5 ml buforu
fosforanowego (pH 6,5) i 5 ml CaCl
2
(lub 0,2 ml roztworu trombiny). Do
prob
ówki włożyć bagietkę, zamieszać zawartość i odstawić na ok. 30-60
min. Po tym czasie powstały włóknik nawinąć na bagietkę i ostrożnie wyjąć.
Bagietkę ze skrzepem fibryny przepłukać przez dwukrotne zanurzenie w
probówce zawierającej 0,9% NaCl a następnie, używając paseczka bibuły,
zsunąć na wysokość 1 cm od dolnego końca bagietki. W przypadku
kłopotów z wykrzepianiem, probówkę ogrzewać w łaźni wodnej w temp.
37ºC.
2. Oznaczanie stężenia fibrynogenu
Umieścić bagietkę w 20 cm probówce zawierającej 1,0 ml 5 % NaOH.
Probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i inkubować do momentu
ca
łkowitego rozpuszczenia skrzepu włóknika (10-20 min). W osobnej
probówce ogrzewać 1,0 ml 5 % roztworu NaOH jako próbę ślepą. Dodać do
oby
dwu probówek (badanej i ślepej) po 9 ml wody destylowanej.
Wymieszać, z każdej pobrać po 0,5 ml roztworu i dodać po 1,5 ml 12,5 %
roztworu Na
2
CO
3
oraz 0,2
ml rozcieńczonego odczynnika Folina
i natychmiast wymie
szać, energicznie wstrząsając. Po 20 minutach odczytać
ekstynkcję próby badanej wobec ślepej przy długości fali 720 nm.
24
3. Wykonanie wykresu kalibracyjnego
Wzorcowy roztwór tyrozyny o stężeniu 400 g/ml rozcieńczyć wg poniższej
tabelki
Numer
próbki
Wzorcowy
roztwór tyrozyny
(ml)
Woda
destylowana
(ml)
g tyrozyny
w 1 ml roztworu
1
0,10
3,90
10
2
0,30
3,70
30
3
0,50
3,50
50
Z każdej próbki odmierzyć po 0,5 ml roztworu, dodać po 1,5 ml 12,5%
Na
2
CO
3
oraz 0,2
ml rozcieńczonego odczynnika Folina intensywnie
wstrząsając. Próba ślepa zawiera 0,5 ml wody destylowanej, 1,5 ml 12,5%
roztworu Na
2
CO
3
oraz 0,2
ml rozcieńczonego odczynnika Folina.
Po 20 minutach odczytać ekstynkcję prób wzorcowych wobec próby ślepej
przy długości fali 720 nm. Sporządzić wykres kalibracyjny zależności
ekstynkcji od stężenia tyrozyny.
Obliczanie wyników
Stężenie fibrynogenu w mg/dl osocza oblicza się ze wzoru:
T
T
C
24
1000
9
,
0
200
10
8
,
10
25
gdzie:
T
– ilość tyrozyny w badanej próbce, odczytana z wykresu
kalibracyjnego
10,8
– równoważnik tyrozyny dla fibrynogenu
10
– wynika z 10 krotnego rozcieńczenia próbki
200
– wynika z przeliczenia stężenia na 100 ml osocza
0,9
– rozcieńczenie krwi cytrynianem
1000
– wynika z przeliczenia g/mg