Instrukcja do ćwiczenia 2

BADANIE WŁASNOŚCI BIAŁEK

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

●

Budowa, podział i własności amfoteryczne aminokwasów

●

Właściwości białek, białka jako polielektrolity, wpływ pH na ładunek białek i ich rozpuszczalność, właściwości

amfoteryczne. Wiązanie wody i wpływ soli na rozpuszczalność białek

●

Główne frakcje białek osocza – skład, własności i funkcje.

1. Oznaczanie punktu izoelektrycznego (pI) kazeiny

Zasada: Białka są amfoterycznymi polielektrolitami. Ładunek cząsteczki białka zależy od stężenia jonów wodorowych w

środowisku i jego wartość zmienia się wraz ze zmianą pH. Wartość pH, w którym cząsteczka białka zawiera tę samą liczbę
zjonizowanych grup dodatnich i ujemnych, odpowiada punktowi izoelektrycznemu (pI) białka, wówczas jego sumaryczny
ładunek równy jest zero. Białko w tym punkcie nie wędruje w polu elektrycznym, ma najniższą rozpuszczalność i najmniejszą
lepkość, najłatwiej je wtedy wytrącić lub wykrystalizować. Białka w pI wykazują również najmniejsze ciśnienie osmotyczne,
najsłabiej pęcznieją i nie reagują z anionami ani z kationami.

Punkty izoelektryczne (pI) przykładowych białek

Pepsyna 1,0
Albumina osocza 4,8
Insulina 5,3

Globuliny osocza 5,0-7,0
Hemoglobina 6,8
Mioglobina 7,0

Histony 10-11
Trypsyna 10,5
Cytochrom c 10,6

Wykonanie:
10 probówek (wysokich) w statywie opisz nr od 1 do 10 i wprowadź do nich kolejno roztwory wg instrukcji w tabeli 1:

Numer probówki

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Roztwór

Dodana ilość (ml)

H

2

O

1,5M CH

3

COOH - tylko do 1

probówki, dalej kolejne rozcieńczanie:
przenosząc 5 ml z poprzedniej do
następnej probówki, po wymieszaniu

0,5% kazeina w 0,1M
CH

3

COONa (wymieszać)

5,5

4,5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5

5

1

5 ml

wylać

Stopień wytrącenia, po 20 min.
(w skali od 0 do +5)

Obliczona wartość pH

Zmierzona wartość pH

Ustal pI kazeiny, zinterpretuj uzyskane wyniki.

2. Hydratacja i wysalanie białek

Zasada: Rozpuszczalność białek zależy od zdolności cząsteczek do hydratacji czyli oddziaływania między polarnymi grupami

białka a dipolami wody. Na rozpuszczalność białek wpływa też obecność soli (małych stężeń) oraz wartość pH roztworu. Przez
hydratację zatem należy rozumieć otaczanie się cząsteczek białka płaszczem wodnym. Woda hydratacyjna, nieodłączna część
cząsteczki białka, wpływa na właściwości strukturalne i funkcjonalne białka. Cząsteczka białka wiąże dipole wody przez polarne
grupy hydrofilne łańcuchów bocznych aminokwasów oraz atomy N i O wiązań peptydowych. Białko rozpuszczone w niewielkiej
ilości wody wchłania ją i tworzy galaretowaty żel, w którego przestrzeniach gromadzą się cząsteczki H

2

O. Niewielkie ilości soli

nieorganicznych zwiększają rozpuszczalność białek – jest to wsalanie. Przypuszczalnie jony soli zobojętniają zjonizowane grupy
białek odpowiedzialne za przyciąganie między cząsteczkami. Jeśli jednak stężenie soli będzie wzrastać, korzystny wpływ jonów
soli na rozpuszczalność ustaje i przy dużym stężeniu soli białka rozpuszczalne w wodzie wytrącają się z roztworu, a proces ten
nazywa się wysalaniem białek. W celu wysalania stosuje się sole, których jony łatwo tworzą wodziany i pozbawiają białka
płaszcza wodnego, sprzyja to ich asocjacji w większe agregaty o zmniejszonej rozpuszczalności, dlatego agregaty białkowe
wypadają z roztworu. Stężenie soli potrzebne do wysalania białek zależy od ich właściwości oraz pH środowiska. Najłatwiej
wysolić białko w jego punkcie izoelektrycznym, ponieważ cząsteczki na zewnątrz obojętne łatwo asocjują w większe agregaty
wypadające z roztworu. Do wysalania najczęściej stosuje się (NH

4

)

2

SO

4

, Na

2

SO

4

, MgSO

4

. Wysalanie białek jest procesem

odwracalnym, usunięcie soli, np. przez dializę, sprawia, że wytrącone białko ponownie rozpuszcza się i wykazuje swe biologiczne
właściwości. Wysalanie stosuje się do wstępnego frakcjonowania białek, również osocza. Z osocza wytrąca się fibrynogen przy
25% nasyceniu siarczanem amonu, większość globulin osocza wytrąca się przy 50% nasyceniu siarczanem amonu, natomiast
albuminy i dobrze rozpuszczalne globuliny wysalane są dopiero przy 80% nasyceniu siarczanem amonu.

Wykonanie:
Przygotuj 4 probówki wirówkowe opisane nr od 1 do 4, o składzie podanym w tabeli 2:

Nr probówki

1

2

3

4

Surowica rozc. 5x

(NH

4

)

2

SO

4

nasycony roztwór

2,1 ml

0,9 ml

(30%)

2,1 ml

2,1 ml

(50%)

-

-

-

-

Próby wymieszać, obejrzeć i ocenić stopień wytrącenia bialek (+). Po 5 min.

odwirować przy 3000obr./min. przez 10 min. Zdekantować supernatant, osad osuszyć.
Supernatant z probówki 1
Supernatant z probówki 2
(NH

4

)

2

SO

4

in subst.

-

-

-

-

-

-

1 ml

-

0,6 g

-

1 ml

0,6 g

Próby wymieszać, obejrzeć i ocenić stopień wytrącenia bialek (+). Po 10 min.

odwirować przy 3000obr./min. przez 10 min. Zdekantować supernatant, osad osuszyć.
Próby osadów

osad

osad

osad

osad

H

2

O destylowana

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

Stopień rozpuszczalności białek w
skali od 0 do 5 (+)

Zinterpretuj uzyskane wyniki.

3. Denaturacja białek

Zasada: Denaturacja polega na zniszczeniu struktury drugo-, trzecio- lub czwartorzędowej białka, czyli natywnej konformacji,

czego konsekwencją jest utrata specyficznych biologicznych aktywności białek. Denaturacja białek zachodzi pod wpływem
różnych czynników, zarówno chemicznych jak i fizycznych. Zjawisko to pojawia się pod wpływem wysokiej temperatury,
mocnych kwasów lub zasad nieorganicznych, niektórych kwasów organicznych, rozpuszczalników organicznych, takich jak:
alkohol lub aceton w temperaturze pokojowej i wyższej oraz kationów metali ciężkich.

Denaturacja białek oligomerycznych oraz zmodyfikowanych potranslacyjnie jest praktycznie nieodwracalna. Proces ten może

być odwracalny dla białek niezmodyfikowanych, zbudowanych z pojedynczego polipeptydu takich jak rybonukleaza, która może
ulegać renaturacji po usunięciu czynnika denaturującego, włącznie z odzyskaniem aktywności biologicznej.

Wykonanie:
Przygotuj 4 probówki wirówkowe opisane nr od 1 do 4, o składzie podanym w tabeli 3:

Nr probówki

1

2

3

4

Surowica rozc. 5x
Mleko rozc. 5x
Owoalbumina
1% CH

3

COOH

1 ml

-
-

1 kropla

-

1 ml

-

1 kropla

-

1 ml

-
-

-
-

1 ml

-

Próby wymieszać i wstawić do łaźni wodnej i ogrzać do wrzenia po czym obejrzeć próby,

porównać je i zinterpretować wyniki

Stopień zmętnienia (+/-)

Do próby 1 dodać niewielką ilość NaCl in subst., wyjaśnić zmianę. Próby 1, 2, 4

odwirować przy 3000obr./min. przez 5 min. Zdekantować supernatanty (wylewając je do

zlewu). Do osuszonych osadów wprowadzić po 4 ml H

2

O dest. Próby dokładnie

wymieszać bagietką, obserwując rozpuszczanie osadów. Zinterpretować uzyskane wyniki.

Stopień rozpuszczalności osadów
białek w skali od 0 do 5 (+)

Opracowanie wyników:

1. Podaj wartość wyznaczonego punktu izoelektrycznego kazeiny oraz krótko wyjaśnij na czym opiera się oznaczenie i przedstaw
wnioski wynikające z doświadczenia na podstawie którego pI został wyznaczony.
2. Scharakteryzuj ocenianą ilość wytrąconych białek osocza poddanych wysoleniu (na podstawie ilości znaków +), scharakteryzuj
skład poszczególnych frakcji (probówki 1, 2, 3, 4) pod względem rodzaju białek i ich rozpuszczalności w H

2

O.

3. Porównaj rozpuszczalność białek osocza poddanych wysoleniu i denaturacji i zinterpretuj uzyskane wyniki.

Polecana literatura:
1. Chemia medyczna pod redakcją Iwony Żak, ŚAM Katowice 2001, Rozdziały 13-15.
2. Praktikum z chemii medycznej pod redakcją Iwony Żak, ŚAM Katowice 2001, Rozdział 12.
3. Biochemia Harpera, Murray RR i wsp. PZWL Rozdział: Białka osocza, str. 770-793.