1

Rozdział 12

Białka

Krzysztof Siemianowicz

Dorota Polańska

Białka są zbudowane z łańcucha utworzonego przez aminokwasy. Stopnie

złożoności budowy białka są określane przez kolejną rzędowość (I-IV) jego

struktury.

Pierwszorzędowa

struktura

białka

określa

sekwencję

aminokwasów. Geometryczne właściwości wiazań peptydowych i wynikająca

stąd konformacja łańcucha polipeptydowego warunkuje

drugorzędową

strukturę białka. Przestrzenne uformowanie pofałdowanego lub skręconego

łańcucha polipeptydowego bądź wzajemne usytuowanie kilku łańcuchów

warunkuje strukturę

trzeciorzędową

. Wpływają na nią głównie wiązania

2

wodorowe i di

siarczkowe. Niektóre białka mają budowę podjednostkową.

Wzajemny

układ

przestrzenny

podjednostek

określa

strukturę

czwartorzędową

.

Ze względu na swoją strukturę i właściwości fizykochemiczne białka dzielimy

na:



globularne

o kształcie kuli lub elipsoidy obrotowej. Stosunek długości

osi długiej do krótkiej cząsteczki białka nie przekracza 20. Białka

globularne zwykle są rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli.

Przykładem tej grupy białek są albumina i globuliny.



fibrylarne

(włókienkowe), dla których stosunek osiowy osiąga wartość

około 200. Są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie i roztworach

soli. Przykładem tej grupy białek są kolagen, elastyna i keratyna.

Uwzględniając składniki tworzące białko można wśród białek globularnych

wyodrębnić:



białka proste

zbudowane tylko z aminokwasów,



białka złożone

(skoniugowane), które obok części białkowej zawierają

istotną dla swojej funkcji nieorganiczną lub organiczną część

niebiałkową.

Glikoproteiny

zawierają obok białka węglowodany obojętne (np. galaktozę,

mannozę,

fruktozę),

aminocukry

(N-acetylogalaktozoaminę,

N-

acetyloglukozoaminę) lub kwasowe pochodne monocukrów (kwas uronowy,

3

kwas sjalowy).

Lipoproteiny

zawierają trójglicerydy, cholesterol, estry

choleterolu i fosfolipidy. W

metaloproteinach

atom metalu jest związany

koordynacyjnie lub jonowo. W

fosfoproteinach

reszta kwasu fosforowego

jest połączona wiązaniem estrowym z resztą seryny lub treoniny.

Nukleoproteiny

są zasocjowane z kwasami nukleinowymi w rybosomach.

Chromoproteiny

(np. hemoproteiny) zawierają barwny związek jako grupę

prostetyczną.

Funkcje białek



strukturalne

– pełnią je białka tkanki łącznej, a wewnątrzkomórkowo

białka mikrofilamentów



enzymatyczne

– enzymy katalizują większość reakcji chemicznych

zachodzących w organiźmie



regulatorowe

– aktywatory i inhibitory enzymów regulują szereg

procesów



przekazywanie informacji



zewnątrzkomórkowo – hormony białkowe i cytokiny



wewnątrzkomórkowo – np. białka G



receptory komórkowe – warunkują odpowiedź komórki na określone

bodźce



transportowe

– transport zewnątrzkomórkowy i wewnątrzkomórkowy

związków trudno rozpuszczalnych w wodzie, przenoszenie elektronów w

łańcuchu oddechowym



magazynowe

– np. ferrytyna gromadzi jony żelaza

4



odpornościowe



odporność swoista – immunoglobuliny



odporność nieswoista – układ dopełniacza, interferony



krzepnięcie krwi



kurczliwość – białka włókien mięśniowych



funkcje buforowe

Wybrane właściwości fizykochemiczne białek

Charakter amfolityczny

W zależności od pH roztworu cząsteczki białka wykazują w środowisku

kwaśnym nadmiar ładunku dodatniego, a w środowisku zasadowym nadmiar

ładunku ujemnego. Punkt izoelektryczny białka określa takie pH, w którym

dane białko występuje w postaci jonu obojniaczego. W punkcie tym ładunki

dodatnie i ujemne się równoważą dając ładunek sumaryczny równy zeru.

Rozpuszczalność

Rozpuszcalność białek zależy od pH i siły jonowej roztworu, stałej

dielektrycznej rozpuszczalnika i od cech strukturalnych danego b

iałka.

Wsalanie

– określone stężenie soli powstrzymuje asocjację lub agregację

cząsteczek białka i poprawia jego rozpuszczalność. Ten efekt dotyczy białek

o asymetrycznym rozkładzie ładunku w cząsteczce.

5

Wysalanie

– określone stężenie soli powoduje powstrzymanie hydratacji

białka i jego wytrącenie z roztworu.

Denaturacja

Są to określone zmiany wywołane czynnikami fizycznymi lub chemicznymi

prowadzące do utraty aktywności biologicznej i niektórych cech

fizykochemicznych białka. W trakcie denaturacji białka dochodzi do zerwania

wiązań wodorowych, hydrofobowych, a niekiedy także dwusiarczkowych.

Proces denaturacji nie zmienia struktury pierwszorzędowej białka. Jeśli w

trakcie denaturacji białka jego nowa konformacja nie została utrwalona

poprzez wytworzenie

nowych wiązań dwusiarczkowych, nowych wiązań

kowalencyjnych lub poprzez niespecyficzne utlenienie, to proces denaturacji

jest odwracalny

– możliwa jest renaturacja. W przeciwnym wypadku

denaturacja jest nieodwracalna.

Białka osocza

W osoczu krwi człowieka wykazano obecność około 300 różnych białek, z

których każde ma specyficzną dla siebie budowę i pełni jedną lub kilka

określonych funkcji. Stężenia poszczególnych białek osocza mogą się

zmieniać w różnych okresach życia i stanach fizjologicznych.

Funkcje bialek osocza

Regulacja ciśnienia koloidosomotycznego (onkotycznego).

Około 3-4

krotnie większe stężenie białka w przestrzeni wewnątrznaczyniowej w

stosunku do przestrzeni pozanaczyniowej zapobiega ucieczce wody ze

6

światła naczynia do przestrzeni pozanaczyniowej i zapewnia kontrolę

dystrybucji płynów przestrzeni pozakomórkowej. Zaburzenie tej funkcji staje

sie widoczne,

gdy pojawiają się obrzęki spowodowane obniżeniem stężenia

białka całkowitego w osoczu. Głównym białkiem pełniącym tę funkcję jest

albumina z

racji swego dominującego udziału procentowego w puli białek

osocza.

Funkcje

transportowe.

Albumina

stanowi

niespecyficzny

układ

transportujący hormony, bilirubinę, wolne kwasy tłuszczowe, jony metali,

witaminy oraz leki. Wiele leków, hormony, jony wapnia wykazują aktywność

biologiczną tylko w formie wolnej, w przeciwieństwie do formy związanej z

białkiem. Zmiany stężenia białka całkowitego oraz jego zdolności wiązania

poszczególnych leków, hormonów, bilirubiny i wapnia mogą mieć istotne

znaczenie

kliniczne

.

Oprócz

albuminy

wyspecjalizowane

funkcje

tr

ansportowe pełnią inne białka. np. transferyna transportuje żelazo,

lipoproteiny transportują poszczególne lipidy (ich funkcje zostały

przedstawione

w rozdziale „Lipoproteiny osocza”), TBG (Thyroxine Binding

Globulin

– globulina wiążąca tyroksynę) i TBA (Thyroxine Binding

PreAlbumine

– prealbumina wiążąca tyroksynę) transportują tyroksynę,

SHBG (Sex Hormone Binding Globulin

– globulina wiążąca hormony

płciowe) transportuje hormony płciowe, RBP (Retinol Binding Protein –

białko wiążące retinol) przenosi retinol.

Udział w krzepnięciu krwi.

Większość osoczowych czynników krzepnięcia

jest białkami.

7

Udział w fibrynolizie.

Enzymy fibrynolizy również są białkami.

Funkcje

enzymatyczne.

Oprócz

enzymów

proteolitycznych

zaa

ngażowanych w procesy krzepnięcia i fibrynolizy, inne białka pełnią

funkcje enzymatyczne, np. ceruloplazmina katalizuje utlenienie żelaza z

Fe2+ do Fe3+

, które następnie jest wiązane przez transferynę. W podziale

klinicznym enzymów są one określane jako enzymy sekrecyjne (opisane w

rozdziale pt. „Enzymy ważne klinicznie”).

Regulacja aktywności enzymów.

Układ krzepnięcia oraz układ aktywacji

dopełniacza

są

przykładami

kaskadowej

aktywacji

enzymów

proteolitycznych. PAI-1 i PAI-2 (Plasminogen Activator Inhibitor

– inhibitor

aktywatora plazminogenu) są elementami regulacji równowagi pomiędzy

procesami krzepnięcia i fibrynolizy.

Funkcje odpornościowe.

Immunoglobiliny stanowią układ odporności

swoistej, natomiast układ dopełniacza jest elementem odporności

nieswoistej.

Funkcje hormonalne.

Niektóre hormony produkowane przez przysadkę

mózgową oraz gonadotropina kosmówkowa mają budowę białkową.

Funkcje buforowe.

Dzięki swojej budowie białka osocza mają właściwosci

buforowe i odpowiadają za około 18% pojemności buforowej krwi.

Metody oznaczania białek osocza

Ponieważ białka osocza stanowią mieszaninę związków o różnych masach

czasteczkowych, a ich proporcje mogą sie istotnie zmieniać w różnych

stanach patologicznych, przyjęto nie podawać stężenia białka całkowitego w

j

ednostkach układu SI (w milimolach/litr), lecz w gramach/litr lub

8

gramach/decylitr

. Metody oznaczania stężenia białka polegają na

wykorzystaniu właściwości chemicznych lub fizycznych wspólnych dla

wszystkich białek osocza.

Metoda Kjeldahla

Jest metodą referencyjną przy standaryzacji innych metod ilościowego

oznaczania białka. Polega na ilościowym oznaczeniu azotu w białku. W celu

oznaczenia azotu zawartego w białkach należy próbkę oczyścić z innych

związków zawierających azot pozabiałkowy (jego zawartość jest znacznie

niższa niz azotu białkowego).

W pierwszym etapie przeprowadza się mineralizację związków organicznych

(wśród nich ilościowo dominuje białko) kwasem siarkowym w obecności

katalizatora (jony miedziowe lub rtęciowe). Azot zawarty w tych związkach

przechodzi w siarczan amonowy:

azot organiczny + H2SO4



(NH4)2SO4

Pod wpływem stężonego wodorotlenku sodowego w kolbie aparatu

destylacyjnego z powstałego siarczanu amonowego jest uwalniany

amoniak:

(NH4)2SO4 + 2NaOH



Na2SO4 + 2 H2O + 2NH3

9

W o

dbieralniku powstały amoniak wiąże sie z kwasem siarkowym lub solnym

o znanym stężeniu:

2NH3 + H2SO4



(NH4)2SO4

Pozostałą cześć kwasu, która nie przereagowała z amoniakiem oznacza się

ilościowo miareczkując ją:

H2SO4 + 2NaOH



Na2SO4 + 2H2O

Następnie oblicza się ilość azotu w próbce, którą się przelicza na zawartość

białka. Średnia zawartość azotu w białkach surowicy wynosi 16%, czyli

współczynnik przeliczenia dla białek surowicy wynosi 6,25. Zawartość azotu

w poszczególnych oczyszczonych białkach jest różna: np. 12% dla mucyn i

30% dla protamin, dlatego oznaczając stężenia poszczególnych białek

należy uwzględnić różne współczynniki.

Metody kolorymetryczne

Najczęściej stosuje sie metodę biuretową i metodę Lowry’ego.

Metoda biuretowa

– jony miedziowe w środowisku zasadowym wiążą się z

wiązaniami peptydowymi tworząc kompleks o zabarwieniu fiołkowym. Ta

reakcja nosi nazwę reakcji Piotrowskiego na cześć swego odkrywcy.

10

Dodatnią reakcję dają związki posiadające co najmniej dwa wiązania

peptydowe. Oprócz białek są to również peptydy, amidy



-amino

kwasów i

inne związki. Najprostszym związkiem dającym tę reakcję jest biuret, produkt

kondensacji dwóch cząsteczek mocznika. Metody biuretowej nie należy

stosować do oznaczania białek w obecności soli amonowych i siarczanu

magnezu, ponieważ obie sole zaburzają ilościowe wiązanie jonów

miedziowych.

Metoda Lowry’ego i wsp.

– jest oparta na reakcji barwnej dawanej przez

dwa odczynniki. Białko reaguje z jonami miedziowymi w środowisku

zasadowym dając reakcję biuretową oraz dochodzi do redukcji odczynnika

fosforo-molibdenowego

(odczynnika

Folina-

Ciocalteau)

do

błękitu

molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan. Ze względu na

różny skład aminokwasowy i różną zawartość tyrozyny i tryptofanu

poszczególne białka mogą dawać różne natężenie barwy z odczynnikiem

Folina-

Ciocalteau, należy więc stosować odpowiednie wzorce białkowe.

Inne związki reagujące z odczynnikiem Folina-Ciocalteau (fenole i ich

pochodne, kwas moczowy, puryny, pirymidyny) powodują zwiększenie

natężenia barwy. Siarczan cynku i siarczan amonowy (w stężeniu powyżej

0,1%), zobojętniony kwas trójchlorooctowy i nadchlorowy, aceton, mocznik

(w stężeniu powyżej 1%), etanol i eter (w stężeniu powyżej 5%) oraz

11

zanieczyszenie DNA w oznaczanej próbce zmniejszają natężenie barwy.

Bufory fosforanowe o stężeniu wyższym niż 0,1 M powodują zmętnienie

prób. Metoda Lowry’ego jest znacznie czulsza od metody biuretowej i

umożliwia oznaczanie białka w zakresie stężeń 10-100 mg/l.

Metody turbidymetryczne (zmętnieniowe)

Do

tej grupy metod należy metoda Extona. Kwas sulfosalicylowy i siarczan

sodowy powodują wytrącenie białka z roztworu. Powstałe zmętnienie

oznacza się mierząc absorbancję. Ta metoda jest zwykle stosowana do

oznaczania stężenia białka w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym.

Stężenie białka całkowitego w surowicy

Normoproteinemia

,

czyli prawidłowe stężenie białka całkowitego w

surowicy, wynosi 60 -80 g/ (6-8 g/dl).

Hipoproteinemia

jest to obniżenie stężenia białka całkowitego w surowicy

poniżej 60 g/l (6 g/dl). Może być spowodowana 3 grupami przyczyn

powodującymi zmniejszenie ilości białka rozpuszczonego w surowicy:

-

obniżeniem wytwarzania białek surowicy, które może być spowodowane

uszkodzeniem miąższu wątroby, niedożywieniem, zaburzeniami trawienia

białek lub wchłaniania aminokwasów w przewodzie pokarmowym;

12

-

utratą białka z organizmu, która jest możliwa na drodze nerkowej (choroby

nerek przebiegające z białkomoczem – np. zespół nerczycowy) lub

pozanerkowej (oparzenia lub po krwotokach);

-

zwiększeniem katabolizmu białek (choroby gorączkowe, choroby

nowotworowe, ciężkie posocznice).

Do hipoproteinemii może również dojść, gdy ilość białka rozpuszczonego w

surowicy nie ulega zmianie, lecz zwiększa się objętość osocza, w której

białko jest rozpuszczone. Z taką sytuacją możemy mieć do czynienia w

przypadku przewodnienia.

Hiperproteinemia

jest to zwiększenie stężenia białka całkowitego w osoczu

powyżej 80 g/l (8 g/dl). Może być spowodowana:

-

zwiększeniem syntezy białka. Odpowiada za nie wzrost syntezy

immunoglobulin (n

ie stwierdza się hiperproteinemii wywołanej wzrostem

syntezy albumin). W badaniu elektroforetycznym surowicy stanowi takiemu

towarzyszy hipergammaglobulinemia. Taka sytuacja występuje w

nowotworach układu chłonnego, które syntetyzują w nadmiarze jedną klasę

immunoglobulin (lub fragmenty immunoglobulin). Do tych chorób należą:

szpiczak

mnogi,

choroba

ciężkich łańcuchów, makroglobulinemia

Walderstr

öma i inne.

13

- d

rugą przyczyną hiperproteinemii może być odwodnienie, w którym nie

dochodzi do zwiększenia ilości białka rozpuszczonego w osoczu, lecz do

zmniejszenia

objętości osocza.

Elektroforeza białek

Elektroforeza białek wykorzystuje różnice w wędrówce białek w polu

elektrycznym umożliwiając ich rozdział na frakcje. Najczęściej dokonuje się

rozdziału elektroforetycznego na octanie celulozy lub agarozie. Stosowany

bufor ma zwykle pH 8,6. Większość białek w tych warunkach posiada

ładunek ujemny i wędruje w kierunku anody. Szybkość wędrówki białka w

polu elektrycznym zależy od ładunku elektrycznego cząsteczki białka,

napięcia, wielkości cząsteczki białka, pH i siły jonowej buforu oraz rodzaju

nośnika. Standardowo w rozdziale elektroforetycznym białek surowicy

otrzymuje się frakcję albuminy i 4 frakcje globulinowe:



1,



2,



i



(ryc. 1).

W rozdziale elektroforet

ycznym białek osocza pomiędzy frakcją



i



globulin

jest obecna frakcja zawierająca fibrynogen. Aby uniknąć trudności

interpretacyjnych spowodowanych tym faktem zaleca się do elektroforezy

białek używać surowicy zamiast osocza. Po dokonaniu rozdziału w polu

elektrycznym frakcje białkowe wybarwia się czernią amidową lub innym

barwnikiem łączącym się z białkiem. Po utrwaleniu i odpłukaniu nadmiaru

barwnika dokonuje się odczytu densytometrycznego. Współczesne

densytometry automatycznie

podają zawartość procentową poszczególnych

frakcji białkowych obliczając stosunek powierzchni pola pod krzywą danej

frakcji w stosunku do powierzchni pola pod krzywą całego densytogramu

14

(ryc. 2)

oarz wyliczają stosunek zawartości procentowej albumin do globulin

(A/G).

Znając stężenie białka całkowitego w danej próbce surowicy i

zawartość procentową poszczególnych frakcji białkowych można wyliczyć

stężenie każdej z nich.

Ryc. 1. Żel, na którym dokonano rozdziału elektroforetycznego białek

surowicy. Zaznaczono

ścieżkę nr 15, która przedstawia prawidłowy

proteinogram.

15

Ryc. 2. Odczyt densytometryczny żelu, na którym dokonano rozdziału

elektroforetycznego

surowicy z prawidłowym proteinogramem.

Albumina

jest białkiem globularnym o masie cząsteczkowej 6600. Jest

wytwarzana w wątrobie i ma okres półtrwania w osoczu około 14 dni. U

poszczególnych osób zwykle występuje jeden rodzaj albuminy. Bardzo

rzadko występuje bisalbuminemia polegająca na występowaniu we krwi

dwóch rodzajów albuminy o różnym składzie aminokwasowym i różnej

ruchliwości elektroforetycznej. Bisalbuminemia jest dziedziczna i nie

powoduje konsekwencji klinicznych.

Frakcje globulinowe zawierają różne białka o identycznej lub podobnej

ruchliwości elektroforetycznej.

16



1-globuliny

– w tej frakcji występują:



1 inhibitor proteaz,



1 kwaśna

glikoproteina (AAG, orozomukoid),



-lipoproteiny (HDL).



2-globuliny

– w tej frakcji wystepują:



2 makroglobulina, haptoglobina,

ceruloplazmina i niektóre immunoglobuliny.



-globuliny

– dodanie do buforu mleczanu wapnia pozwala rozdzielić tę

frakcję na



1 i



2 globuliny, jednakże nie ma to istotnego znaczenia

klinicznego. Frakcja ta zawiera: transferynę,



-

lipoproteiny (LDL), składnik

C3 dopełniacza i niektóre immunoglobuliny.



-globuliny

– w tej frakcji występuje większość immunoglobulin i białko C-

reaktywne (CRP).

Na podstawie ro

zdziału elektroforetycznego białek surowicy można

stwierdzić w sytuacjach patologicznych:

1. D

ysproteinemię

polegającą na zmanie stosunków ilościowych pomiędzy

poszczególnymi frakcjami białkowymi. Należy pamiętać, że zmiana

zawartości procentowej danej frakcji białkowej nie musi oznaczać zmiany jej

stężenia. Częstą postacią dysproteinemii jest hipergammaglobulinemia

polegająca na wzroście procentowej zawartości gamma globulin w surowicy.

Wyróżniamy 2 typy hipergammaglobulinemii:

-

monoklonalną spowodowaną zwiększoną produkcją jednej klasy

immunoglobulin (lub ich fragmentów). Może występować w szpiczku

mnogim, choro

bie ciężkich łańcuchów, makroglobulinemii Walderströma.

Może jej towarzyszyć hiperproteinemia;

17

-

poliklonalną spowodowaną zwiększoną produkcją różnych klas

immunoglobulin. Występuje w przewlekłych stanach zapalnych, chorobach

autoimmunologicznych. Niektórym z tych stanów może towarzyszyć

zwiększone wytwarzanie białka C-reaktywnego (CRP), które także jest

składnikiem frakcji gamma globulin.

2. Pa

raproteinemię,

czyli pojawienie się dodatkowego pasma (frakcji), które

prawidłowo nie występuje, np. białka monoklonalnego (białko M)

produkowanego przez komórki nowotworowe wywodzące się z układu

immunologicznego. Występująca w surowicy hemoglobina (prawidłowo

występuje w ilościach śladowych) pochodząca z hemolizy erytrocytów może

dać obraz paraproteinemii.

Białka ostrej fazy

Jest to grupa białek osocza, których stężenie w różnym stopniu wzrasta w

odpowiedzi na proces zapalny, uraz tkanek, oparzenia, martw

icę tkanek

oraz nowotwory

. Stany te określamy mianem ostrej fazy. Mediatory stanu

zapalnego (interleukina 6 i interleukina 1) produkowane i uwalniane do

krążenia w miejscu gdzie toczy się proces zapalny docierają do wątroby i

indukują w hepatocytach produkcję białek ostrej fazy. Są one glikoproteinami

zawierającymi kwas sialowy. Ich stężenie w osoczu zaczyna rosnąć już po

upływie 2-5 godzin od wystąpienia stanu określonego mianem ostrej fazy.

Ich stężenie może rosnąć w niewielkim stopniu, np. ceruloplazminy około

dwukrotnie, aż do ponad 1000-krotnego wzrostu, jak w przypadku białka C-

reaktywnego. Wiele z białek ostrej fazy to inhibitory proteaz mające

ograniczyć proteolityczne uszkodzenie tkanek do miejsca toczącego się

18

procesu. W odpowiedzi na proces ostrej

fazy stężenie niektórych białek

osocza ulega obniżeniu. Te białka określamy jako ujemne (negatywne)

białka ostrej fazy w odróżnieniu od pozostałych, czyli dodatnich

(pozytywnych) białek ostrej fazy. Najważniejszym negatywnym białkiem

ostrej fazy jest transferyna. Inne pr

zykłady tej grupy białek to białko wiążące

retinol (RBP) i prealbumina. Niektórzy autorzy zaliczają albuminę do grupy

ujemnych białek ostrej fazy ponieważ jej zawartość procentowa w surowicy

ulega w ostrej fazie obniżeniu.

Białko C-reaktywne (CRP)

Jest pentamerem zbudowanym z identycznych podjednostek. Nazwa

pochodzi od zdolności wiązania się z polisacharydem C ściany komórkowej

bakterii Pneumococcus pneumoniae

. Białko C-reaktywne wiąże się z

wieloma składnikami obcych lub uszkodzonych własnych komórek i aktywuje

klasyczną drogę aktywacji dopełniacza. Aktywuje makrofagi i podobnie jak

przeciwciała rozpoczyna procesy opsonizacji, fagocytozy i lizy obcych

komórek. Stężenie CRP w osoczu wzrasta w czasie zakażeń bakteryjnych,

rozległych urazów, oparzeń, martwicy tkanek (np. zawału serca) i chorób

nowotworowych. Wzrost stężenia CRP rozpoczyna się po 2 godzinach od

wystąpienia procesu ostrej fazy. Jeżeli proces się nie rozszerza, to stężenie

CRP może ulec obniżeniu w ciagu 24 godzin.Przy oznaczaniu stężenia w

osoczu białka C-reaktywnego metodami rutynowymi wzrost jego stężenia

powyżej górnego zakresu normy (10 mg/l) wskazuje na proces ostrej fazy.

19

Ostatnio coraz większe znaczenie zyskuje oznaczanie stężenia białka C-

reatywnego metodami wysokiej czułości (hs-CRP, high sensitivity CRP).

Badanie to pozwala wykryć niewielki wzrost stężenia w osoczu, który w

badaniu metodami

tradycyjnymi mieści się jeszcze w zakresie normy dla

stanów ostrej fazy. Stężenie białka C-reaktywnego (hs-CRP) powyżej 2 mg/l

jest jednym z najczulszych wskaźników wzrostu ryzyka wystąpienia choroby

niedokrwiennej serca i zawału serca. Oznaczanie poziomu białka C-

reaktywnego (hs-

CRP) ma duże znaczenie u osób z wieloma czynnikami

ryzyka choroby niedokrwiennej serca (opisanymi w rozdziale pt.

„Lipoproteiny osocza”), u których są prawidłowe wyniki oznaczeń

parametrów lipidowych. Ostanio znacznie wzrasta rola oznaczania hs-CRP

w monitorowaniu osób z chorobą niedokrwienną serca. Wynik oznaczenia

hs-

CRP powyżej 10 mg/l wskazuje na toczący się proces zapalny lub inną

przyczynę stanu ostrej fazy i wymaga ponownego oznaczenia po ustąpieniu

przyczyny ostrej fazy.

Jeśli stwierdzamy, że u pacjenta występuje stan, który może powodować

wzrost stężenia białek ostrej fazy (np. infekcja, przeziębienie), wówczas nie

ma sensu wykonanie oznaczenia hs-

CRP. Oznaczenie to należy wykonać

po ustaniu stwierdzonego zaburzenia wywołujacego wzrost stężenia białek

ostrej fazy.



1

inhibitor proteaz

Dawniej określany mianem



1

antytrypsyny. Hamuje aktywność proteaz.

Odpowiada za około 90% aktywności antytrypsynowej osocza. Jego główną

funkcją jest hamowanie aktywności elastazy granulocytarnej uwalnianej

20

podczas fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste. Hamuje także

aktywność elastazy trzustkowej, trypsyny, chymotrypsyny, reniny, trombiny i

plazminy. W stanach zapalnych stężenie



1

inhibitora proteaz rośnie około

4-

krotnie osiągajac maksimum po 2-4 dniach.

Genetycznie uwarunkowany brak lub niedobór



1 inhibitora proteaz

powoduje zwiększoną aktywność proteaz, a w szczególności elastazy

prowadząc do uszkodzenia wątroby i płuc. To zaburzenie jest przyczyną

genetycznie uwarunkowanej rozedmy

płuc i rozstrzeni oskrzeli.

Ceruloplazmina

Jest późnym białkiem ostrej fazy. Jest syntetyzowana w wątrobie. Około 90-

95% miedzi w osoczu jest połączone z ceruloplazminą. Pełni funkcje

antyoksydacyjne chroniąc tkanki w stanach ostrej fazy. Katalizuje utlenienie

jonu żelazawego do jonu żelazowego umożliwiając jego wiązanie się z

transferyną. Wzrost poziomu ceruloplazminy obserwuje się w stanach

zapalnych, procesach martwiczych i przy stosowaniu estrogenów. Obniżenie

stężenia ceruloplazminy w osoczu występuje w chorobie Wilsona.

Haptoglobina

Jest tetramerem zbudowanym z 2 rodzajów podjednostek (



i



). W stanach

ostrej fazy jej stężenie zwiększa się wielokrotnie, wzrost stężenia

rozpoczyna się w ciągu 48 godzin, a normalizacja po około 9 dniach.

Haptoglobina wi

ąże się nieodwracalnie z hemoglobiną występujacą w

surowicy. Kompleks haptoglobina-hemoglobina jest szybko wychwytywany

21

przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego, gdzie oba białka są

rozkładane do aminokwasów. Wychwyt hemoglobiny przez haptoglobinę

z

apobiega jej przedostawaniu sie do kanalików nerkowych, gdzie mogłaby

spowodować ich uszkodzenie oraz zapobiega utracie żelaza. Ponieważ

kompleks haptoglobina-

hemoglobina ma krótszy okres półtrwania w osoczu

ni

ż sama haptoglobina, w przypadku hemolizy stężenie haptoglobiny ulega

zmniejszeniu.

Z tego powodu stężenie haptoglobiny w osoczu może nie

wzrastać gdy ostrej fazie towarzyszy hemoliza.



1

kwaśna glikoproteina (AAG)

To białko ostrej fazy nosi również nazwę orozomukoid. W osoczu wiąże i

transportuje pro

gesteron. W stanach zapalnych obserwuje się powolny

wzrost stężenia orozomukoidu (około 5 dni), który zwykle nie przekracza

200% górnej granicy normy.



2

makroglobulina

Jest drugim ważnym inhibitorem proteaz. Wiąże się nieodwracalnie z

proteazami w komple

ksy, które są wychwytywane przez układ siateczkowo-

śródbłonkowy. W większości chorób zmiany stężenia



2

makroglobuliny są

niewielkie, co ogranicza jej znaczenie diagnostyczne. Ze względu na dużą

masę

cząsteczkową

(80

tys.)

nie

przechodzi

do

przestrzeni

poz

anaczyniowej. W zespole nerczycowym stężenie



2 makroglobuliny

może wzrastać kilkukrotnie. Utrata z moczem białek o niskiej masie

cząsteczkowej powoduje nieselektywny wzrost syntezy białek w wątrobie, w

tym także



2

makroglobuliny, która nie jest wydalana z moczem. W

22

elektroforezie białek surowicy obserwuje sie wtedy zwiększenie frakcji



2.

Obecność



2

makroglobuliny w moczu świadczy o przedostaniu się pełnej

krwi do moczu.

Fibrynogen

Pełni funkcje w układzie krzepnięcia. Jest pozytywnym białkiem ostrej fazy.

W

stanach

zapalnych

po

początkowym

niewielkim

obniżeniu

spowodowanym wzmożonym zużyciem, jego stężenie znacznie wzrasta,

nawet do 15 g/l.

23

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Ćwiczenie 1.

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka całkowitego w

surowicy metodą biuretową

Zasada metody

Białka i peptydy zawierające co najmniej dwa wiązania peptydowe reagują w

zasadowym roztworze z jonami miedzi w tak zwanej reakcji biuretowej z

wytworzeniem fioletowego kompleksu barwnego.

Materiał



surowica

Odczynniki



stężony odczynnik biuretowy (60 mmol/l CuSO

4

x 5 H

2

O, 160 mmol/l

winian sodowo-potasowy czterowodny),



roboczy odczynnik biuretowy (pięciokrotnie rozcieńczony stężony

odczynnik biuretowy),



wzorce białka o stężeniu 20, 40, 60, 80 g/l

24

Wykonanie

Do probówek chemicznych odmierzyć według schematu:

Składnik próby (ml)

Próba

Badana

(B)

Wzorcowa

(W)

Odczynnikowa

(O)

Surowica

0,05

-

-

Woda destylowana

-

-

-

Wzorce białka o stężeniu

20 g/l

40 g/l

0,05

60 g/l

80 g/l

Roboczy odczynnik biuretowy

1,5

1,5

1,5

Zawartość probówek dokładnie wymieszać i po upływie 30 minut zmierzyć

ekstynkcję próby badanej oraz wzorcowej względem próby odczynnikowej

przy długości fali 540 nm. Sporządzić wykres zależności absorbancji od

stężenia białka i odczytać z niego stężenie białka w próbie badanej.

25

ĆWICZENIE 2.

Ilościowe oznaczanie białka metodą Extona

Zasada metody

Białko wytrąca się przez dodanie kwasu sulfosalicylowego w obecności

siarczanu sodowego. Intensywność powstałego zmętnienia określa się

metodą turbidymetryczną.

Materiał badany



p

łyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz

Odczynniki



0,

9% roztwór chlorku sodu.



w

zorcowy roztwór białka o stężeniu 1,5 g/l.



o

dczynnik sulfosalicylowy: odważyć 50 g kwasu sulfosalicylowego

C

7

H

6

O

6

S x 2H

2

O i 160 g siarczanu sodu krystalicznego Na

2

SO

4

x 10

H

2

O, a nas

tępnie rozpuścić w wodzie destylowanej. Uzupełnić

do

objętości 1 l.

26

Wykonanie

Do probówek chemicznych odmierzyć wg schematu:

Składnik próby (ml)

Próba

badana

(B)

wzorcowa

(W)

odczynnikowa

(0)

PMR* lub mocz

0,2

-

-

wzorcowy roztwór białka

-

0,2

-

0,9% NaCl

-

-

0,2

odczynnik sulfosalicylowy

1,5

1,5

1,5

*PMR -

płyn mózgowo-rdzeniowy

Zawartość probówek dokładnie wymieszać i zmierzyć absorbancję próby

badanej oraz wzorcowej wobec próby odczynnikowej przy długości fali 445

nm. Optymalny czas pomiaru absorbancji wynosi 4-10 minut po dodaniu

odczynnika sulfosalicylowego.

27

Obliczenia

Stężenie białka całkowitego w g/l, oblicza się wg wzoru:

W

B

A

A

C





5

,

1

A

B

– absorbancja próby badanej

A

W

– absorbancja próby wzorcowej

ĆWICZENIE 3.

Izolowanie i oz

naczanie stężenia fibrynogenu w osoczu metodą

tyrozynową

Zasada metody

Fibrynogen zawarty w osoczu szczawianowym lub cytrynianowym

przekształca się we włóknik pod działaniem chlorku wapnia lub trombiny.

Oznaczenie stężenia fibrynogenu przeprowadza się kolorymetrycznie wg

metody Quicka poprzez pomiar zawartości tyrozyny w fibrynogenie (10,8 mg

fibrynogenu zawiera 1mg tyrozyny).

Materiał badany



osocze

28

Odczynniki



0,025 mol/l roztwór CaCl2: 2,777 g bezwodnego CaCl2 rozpuścić i

uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1000 ml



r

oztwór buforowy: 9 g NaCl, 0,8 g KH2PO4, 1,12 g Na2HPO4, 0,2 g

CaCl2

– rozpuścić i uzupełnić wodą destylowaną do objętości 1000

ml



0,9% roztwór NaCl



5% roztwór NaOH



w

zorcowy roztwór tyrozyny: 40 mg tyrozyny rozpuścić w 100 ml 2/3 N

H2SO4

(18,2 ml stężonego kwasu uzupełnić wodą do objętości 1000

ml)



12,5% roztwór węglanu sodowego



r

ozcieńczony odczynnik Folina-Ciocalteau



r

oztwór trombiny, zawierający 50-100 jednostek tego enzymu w 1 ml

(ampułka 100 j. rozpuszczona w 4 ml soli fizjologicznej)

Wykonanie

1. Izolowanie fibrynogenu

Do 0,5 ml osocza dodać 4,5 ml buforu fosforanowego (pH 6,5) i 5 ml CaCl2

(lub 0,2 ml roztworu trombiny). Do prob

ówki włożyć bagietkę, zamieszać

zawartość i odstawić na ok. 30-60 min. Po tym czasie powstały włóknik

nawin

ąć na bagietkę i ostrożnie wyjąć. Bagietkę ze skrzepem fibryny

przepłukać przez dwukrotne zanurzenie w probówce zawierającej 0,9%

29

NaCl a następnie, używając paseczka bibuły, zsunąć na wysokość 1 cm

od

dolnego końca bagietki.

2. Oznaczanie stężenia fibrynogenu

Umieścić bagietkę w 20 cm probówce zawierającej 1,0 ml 5 % NaOH.

Probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej i inkubować do momentu

ca

łkowitego rozpuszczenia skrzepu włóknika (10-20 min). W osobnej

probówce ogrzewać 1,0 ml 5 % roztworu NaOH jako próbę ślepą. Dodać do

oby

dwu probówek (badanej i ślepej) po 9 ml wody destylowanej.

Wymieszać, z każdej pobrać po 0,5 ml roztworu i dodać po 1,5 ml 12,5 %

roztworu Na2CO3

oraz 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina

i natychmiast wymie

szać, energicznie wstrząsając. Po 20 minutach odczytać

ekstynkcję próby badanej wobec ślepej przy długości fali 720 nm.

3. Wykonanie wykresu kalibracyjnego

Wzorcowy roztwór tyrozyny o stężeniu 400



g/ml rozcieńczyć wg poniższej

tabelki

Numer

próbki

Wzorcowy

roztwór tyrozyny

(ml)

Woda

destylowana

(ml)



g tyrozyny

w 1 ml roztworu

1

0,10

3,90

10

2

0,30

3,70

30

3

0,50

3,50

50

30

Z każdej próbki odmierzyć po 0,5 ml roztworu, dodać po 1,5 ml 12,5%

Na2CO3

oraz 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina intensywnie

wstrząsając. Próba ślepa zawiera 0,5 ml wody destylowanej, 1,5 ml 12,5%

roztworu Na2CO3

oraz 0,25 ml rozcieńczonego odczynnika Folina.

Po 20 minutach odczytać ekstynkcję prób wzorcowych wobec próby ślepej

przy długości fali 720 nm. Sporządzić wykres kalibracyjny zależności

eksty

nkcji od stężenia tyrozyny.

Obliczanie wyników

Stężenie fibrynogenu w mg/dl osocza oblicza się ze wzoru:

T

T

C

24

1000

9

,

0

200

10

8

,

10













gdzie:

T

– ilość tyrozyny w badanej próbce, odczytana z wykresu

kalibracyjnego

10,8

– równoważnik tyrozyny dla fibrynogenu

10

– wynika z 10 krotnego rozcieńczenia próbki

200

– wynika z przeliczenia stężenia na 100 ml osocza

0,9

– rozcieńczenie krwi cytrynianem

1000

– wynika z przeliczenia



g/mg