1
ĆWICZENIE 1
C
HARAKTERYSTYKA KINETYCZNA PROCESÓW BIOTECHNOLOGICZNYCH
–
BADANIE
DYNAMIKI BIOSYNTEZY OKSYDAZY GLUKOZOWEJ PRZEZ SZCZEP
A
SPERGILLUS NIGER
Oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4 – oksydaza – β-D-glukoza: tlen) jest enzymem
katalizującym odłączanie wodoru od substratu (glukozy) i przenoszenie go bezpośrednio na
cząsteczkę tlenu wg schematu:
C
6
H
12
O
6
+ O
2
+ H
2
O → C
6
H
12
O
7
+ H
2
O
2
Oksydaza jest odpowiedzialna za utlenianie nieufosforylowanej glukozy do kwasu glukonowego
z udziałem cząsteczki tlenu i wytworzeniem nadtlenku wodoru; jest więc enzymem posiadającym
zdolność przenoszenia dwóch elektronów wg schematu:
Β-D-glukopiranoza → δ
δ
δ
δ-D-glukonolakton + 2e + 2H
+
O
2
+ 2e + 2H
+
→ H
2
O
2
Enzym ten wykazuje wyjątkową specyficzność substratową dla β-anomeru D-glukozy - atakuje
grupę hydroksylową pierścienia glukopiranozowego znajdującą się w pozycji ekwatorialnej. DuŜo
niŜsze powinowactwo wykazuje oksydaza glukozowa do α-D-glukozy (0,98). Jednak z uwagi na
zachodzącą w środowisku spontaniczną mutarotację α-glukozy do α-,β-glukozy, cała pula glukozy
jest dostępna dla enzymu. Aktywność oksydazy glukozowej do innych mono- i disacharydów jest
bardzo niska (powinowactwo do ksylozy 0,97, mannozy 0,64, maltozy 0,19, galaktozy 0,14, a w
stosunku do fruktozy, arabinozy, rybozy, laktozy, sacharozy czy rafinozy nie wykazuje Ŝadnego
działania).
Z dotychczasowych badań wynika, Ŝe zarówno skład chemiczny jak i właściwości oksydazy
glukozowej tylko w niewielkim stopniu zaleŜą od jej pochodzenia. WaŜnym natomiast czynnikiem
warunkującym właściwości oksydazy jest stopień jej oczyszczenia. CięŜar cząsteczkowy enzymu w
zaleŜności od jego pochodzenia waha się od 146 000 do 154 000. Jego punkt izoelektryczny jest
bliski pH 4,1, natomiast optimum działania mieści się w przedziale pH 5,5 - 6,0. Wiadomo, Ŝe
oksydaza glukozowa jest flawoproteidem współdziałającym z FAD jako koenzymem. Na 1 mol
apoenzymu przypadają 2 mole FAD, łączące się z białkiem apoenzymu przez ryboflawinę.
Apoenzym oksydazy glukozowej moŜe być dimerem lub tetrametrem, w którym podjednostki
białkowe połączone są niekowalencyjnie. Skład aminokwasowy apoenzymu charakteryzuje się
nieznaczną ilością reszt cysteiny oraz nieproporcjonalnie wysoką zawartością aminokwasów
dikarboksylowych i hydrofobowych. W krystalicznym preparacie oksydazy glukozowej nie
wykryto metali takich jak Ŝelazo i miedź. Mogą one jednak brać udział w tworzeniu kompleksu
enzymu z substratem jako kofaktory.
Oksydaza glukozowa jest wytwarzana przez wiele drobnoustrojów. Podstawowym źródłem
tego enzymu na skalę przemysłową są szczepy z rodzaju Aspergillus (A.niger) i Penicillium
2
(P. notatum, P. glaucum, P. funiculosum). Grzyby te hodowane są na podłoŜu o ściśle
zdefiniowanym składzie. Najczęściej wykorzystywanym w produkcji źródłem węgla jest glukoza,
w mniejszym stopniu sacharoza. Stosowane są takŜe ekonomiczniejsze substraty takie jak melasa.
Optymalne źródło azotu dla syntezy oksydazy glukozowej to azotan wapniowy, podczas gdy sole
amonowe traktuje się jako inhibitory biosyntezy tego enzymu pobudzające jednocześnie wzrost
biomasy grzyba. WaŜnym czynnikiem stymulującym wytwarzanie oksydazy glukozowej moŜe być
zawarty w podłoŜu fosforan potasowy i jony magnezu. Wyniki badań wskazują, Ŝe induktorem
syntezy tego enzymu moŜe teŜ być węglan wapnia, warunkujący utrzymanie właściwego pH, a
takŜe stanowiący oparcie dla grzybni w płynnej poŜywce (sól nierozpuszczalna w wodzie) oraz
działający jako czynnik umoŜliwiający przestawienie metabolizmu glukozy z glikolizy na
bezpośrednie utlenianie przez oksydazę glukozową. DuŜy wpływ na zawartość oksydazy
glukozowej w grzybni ma szybkość mieszania przy stałym napowietrzaniu hodowli. Podczas
hodowli A. niger bardzo waŜne jest teŜ utrzymanie odpowiedniego pH poŜywki (5,6), gdyŜ w
niskim pH grzyb syntetyzuje kwas cytrynowy.
O regulacji syntezy i wydzielania oksydazy glukozowej wiadomo stosunkowo niewiele. Enzym ten
jest produkowany jako część kompleksu enzymatycznego zawierającego takŜe katalazę. Oksydaza
glukozowa
produkowana
przez
A.
niger
jest
zlokalizowana
w
peroksysomach
(wewnątrzkomórkowy enzym, którego produkcja wymaga mechanicznej dezintegracji grzybni i
oczyszczania). Kompleks enzymatyczny wytwarzany przez Penicillium zostaje natomiast
wydzielony do środowiska zewnętrznego.
W przemyśle spoŜywczym oksydaza glukozowa wykorzystywana jest do:
- usuwania nieznacznych ilości glukozy w obecności nadmiaru tlenu (zapobieganie reakcjom typu
Maillarda), co umoŜliwia np. poprawę koloru i długości przechowywania suszonych
produktów, przede wszystkim w przemyśle jajczarsko-drobiarskim (w procesie odcukrzania
jaj przed ich suszeniem utlenianie zawartej w jajach glukozy do kwasu glukonowego
zapobiega jej reakcji z grupami aminowymi albuminy, prowadzącej do brązowienia oraz
nieprzyjemnego zapachu produktu)
- usuwania niewielkich ilości tlenu w obecności nadmiaru glukozy (zapobieganie utlenianiu i
ochrona łatwo utleniających się produktów spoŜywczych podczas przechowywania,
zapobieganie rozwojowi aerobowej mikroflory, hamowanie procesów korozyjnych
opakowań w wyniku hamowania uwalniania Ŝelaza z metalowej powierzchni puszek do
produktu), co sprowadza się do stosowania w przemyśle piwowarskim, owocowo-
warzywnym (zabezpieczanie soków przed ciemnieniem i utratą witaminy C, stabilizacja
barwy, smaku i zawartości witaminy C w konserwach owocowo-warzywnych z dodatkiem
3
glukozy, zapobieganie ciemnieniu nieenzymatycznemu produktów z ziemniaków takich jak
frytki i chipsy), winiarskim (dodatek oksydazy glukozowej do win i moszczów skutecznie
zastępuje ich pasteryzację lub siarkowanie), tłuszczowym (zapobieganie jełczeniu tłuszczy,
wydłuŜanie trwałości majonezu do 6, a nawet 12 miesięcy) i mięsnym (stabilizacja konserw
mięsnych z dodatkiem glukozy)
- utrwalania serów dojrzewających (w mieszaninie z glukozą), co zastępuje parafinowanie
- wykrywania i ilościowego oznaczania glukozy w Ŝywności (równieŜ w chemii analitycznej i
diagnostyce medycznej do oznaczania glukozy w płynach ustrojowych).
Oksydaza glukozowa jest równieŜ stosowana w lecznictwie jako składnik niektórych leków do
leczenia ran, czy stanów zapalnych skóry oraz w preparatach do higieny jamy ustnej (nadtlenek
wodoru wykazuje działanie bakteriobójcze, szczególnie w odniesieniu do mikroflory beztlenowej).
Ponadto oksydaza glukozowa wykorzystywana jest do produkcji kwasu glukonowego. Związek ten
jest stosowany w przemyśle spoŜywczym jako regulator kwasowości produktów lub jako dodatek
przeciwdziałający zbrylaniu (glukoniany w sproszkowanych produktach Ŝywnościowych), a w
farmacji i przemyśle spoŜywczym - do otrzymywania przyswajalnych przez organizm form jonów
(glukoniany Ŝelaza, magnezu). Kwas glukonowy jest takŜe wykorzystywany m.in. w produkcji
środków do prania, przemyśle tekstylnym, metalurgii, takŜe jak dodatek do past do zębów i
cementu; produkcja roczna sięga 60 000 ton.
Oksydaza glukozowa jest często stosowana w przemyśle spoŜywczym razem z katalazą
(E.C.1.11.1.6), która umoŜliwia rozkład generowanego H
2
O
2
(katalazę stosuje się teŜ w celu
usuwania nadtlenku wodoru dodanego do produktu w celu jego odkaŜenia). Ma wówczas miejsce
ciąg reakcji:
2C
6
H
12
O
6
+ 2O
2
+ 2H
2
O → 2C
6
H
12
O
7
+ 2H
2
O
2
(oksydaza glukozowa)
2H
2
O
2
→ 2H
2
O + O
2
(katalaza)
Sumarycznie: 2C
6
H
12
O
6
+ O
2
→ C
6
H
12
O
7
; zachodzi więc eliminacja nadtlenku wodoru i produkcja
kwasu glukonowego, bez wprowadzania cząsteczki tlenu z powrotem do środowiska reakcji
(stosowane mogą być więc jako biochemiczny przeciwutleniacz).
Z tego względu technologie produkcji obu tych enzymów są równocześnie udoskonalane. Oksydaza
glukozowa i katalaza są stosowane na duŜą skalę w technologii od wczesnych lat 50.
4
W
YKONANIE ĆWICZENIA
I. Prowadzenie hodowli Aspergillus niger
Stacjonarną hodowlę szczepu naleŜy prowadzić na brzeczce zestalonej agarem w temperaturze
30
o
C aŜ do wykształcenia przez szczep właściwych form zarodnikujących, a następnie przerośnięte
grzybnią skosy przechowywać w temperaturze 4
o
C.
Hodowlę wstrząsarkową naleŜy prowadzić w kolbach stoŜkowych o pojemności 300 cm
3
zawierających po 100 cm
3
poŜywki o następującym składzie:
melasa
10,000 %
Ca(NO
3
)
2
0,200 %
kwas cytrynowy
0,075 %
KH
2
PO
4
0,025 %
KCl 0,025 %
FeCl
3
x 6 H
2
O 0,001 %
Kolby z podłoŜem wyjałowić w autoklawie ciśnieniowym pod ciśnieniem 1,2 atmosfery
w temperaturze 120
o
C przez 45 minut. Po ostudzeniu do temperatury pokojowej podłoŜa szczepić
zawiesiną zarodników (o stałej gęstości) w ilości 2 cm
3
zawiesiny na kolbę, a następnie umieszczać
na wytrząsarce o amplitudzie 5 cm i częstości wychyleń 300 na minutę. Hodowlę prowadzić
w temperaturze 28
o
C przez 0, 16, 20, 25, 30, 33 i 43 godziny (po 2 kolby w kaŜdym wariancie).
W odpowiednim czasie hodowle przerywać przez oziębienie do temperatury 4
o
C.
II. Wykonanie oznaczeń
Opisać krótko morfologię hodowli (charakter wzrostu: strzępki, grudki, wygląd grzybni
powietrznej). W kaŜdej hodowli oznaczyć:
- aktywność oksydazy glukozowej w ekstrakcie z grzybni i w płynie pohodowlanym
- zmiany zawartości substancji cukrowych w płynie pohodowlanym
- zmiany kwasowości oraz pH płynu pohodowlanego
W tym celu grzybnię oddzielić od płynu pohodowlanego metodą sączenia przez sitko. Zmierzyć
objętość płynu pohodowlanego, a następnie umieścić go w chłodni do czasu analiz.
Grzybnię
czterokrotnie przemyć schłodzonym 0,85% NaCl (popłukując przy tym kolbę). Osuszyć delikatnie
bibułą i zwaŜyć.
Następnie:
5
A.
OdwaŜyć 1 g mokrej grzybni i dokładnie ucierać w moździerzu przez 10 minut ze szczyptą piasku.
W tym celu do moździerza najpierw wlać 3 cm
3
schłodzonego buforu (1 M NaCl w 0,2 M buforze
fosforanowym o pH 5,8), następnie dodać odwaŜoną grzybnię i piasek. Rozcierając, dodawać
sukcesywnie bufor: po 3 minutach następne 3 cm
3
, po dalszych 3 - kolejne 4 cm
3
(razem 10 cm
3
buforu). Przenieść ilościowo (dokładnie popłukać moździerz!) do cylindra ze szlifem o pojemności
50 cm
3
, uzupełnić wodą do 50 cm
3
, zamieszać i odstawić na 2 minuty. Filtrować dwa razy przez ten
sam sączek ze średniej bibuły, z zawracaniem początkowej objętości, aŜ do uzyskania klarownego
przesączu (ekstraktu).
B.
Pobrać niewielką próbkę grzybni (0,5 g) i wyznaczyć jej suchą masę metodą wagową po uprzednim
wysuszeniu próbki w temperaturze 105
o
C do stałego cięŜaru.
Próby klarownego ekstraktu grzybni oraz płynu pohodowlanego wykorzystać do dalszych analiz.
Oznaczenie aktywności oksydazy glukozowej w grzybni i płynie pohodowlanym
Odczynniki: - GOD
(4,30g glukozy + 50 cm
3
0,2M buforu fosforanowego o pH 5,8 + 1,5 cm
3
5mg% peroksydazy +
1,4 cm
3
1% o-dianizydyny (3,3’-dimetoksybenzydyna; amina aromatyczna), uzupełnione do 100 cm
3
)
- wzorce H
2
O
2
- 2,5 M H
2
SO
4
.
Zasada metody: Peroksydaza redukuje H
2
O
2
w obecności o-dianizydyny (DH
2
), która ulega
utlenieniu tworząc barwny związek D zgodnie z reakcją: H
2
O
2
+ DH
2
→ 2H
2
O + D.
Próba właściwa:
Do odpowiednio opisanych probówek odmierzyć po 1,0 cm
3
ekstraktów grzybni
lub płynu pohodowlanego
*
. Probówki umieścić w ultratermostacie o temperaturze 30
o
C celem
dogrzania badanych roztworów. Po 5 minutach dodać po 3 cm
3
odczynnika GOD. Inkubować
dokładnie 15 minut. Reakcję przerwać dodając po 5 cm
3
2,5 M H
2
SO
4
(końcówka z filtrem!).
Ekstynkcję badanych prób odczytać na spekolu przy λ= 530 nm.
Próba kontrolna: Do probówek odmierzyć po 1,0 cm
3
próbek klarownego ekstraktu grzybni lub
płynu pohodowlanego
**
. Wstawić do ultratermostatu o temperaturze 30
o
C. Po 5 minutach dodać po
5 cm
3
2,5 M H
2
SO
4
(końcówka z filtrem!) i
po 3 cm
3
odczynnika
GOD. Ekstynkcję badanych prób
odczytać na spekolu przy λ = 530 nm.
*
próby właściwe: 2 powtórzenia ekstraktu z grzybni i 1 powtórzenie płynu pohodowlanego dla kaŜdej kolby
**
próby kontrolne: 1 powtórzenie ekstraktu z grzybni i płynu pohodowlanego dla kaŜdej kolby
6
Krzywa wzorcowa H
2
O
2
:
Z podstawowego roztworu
H
2
O
2
o stęŜeniu 1 mg% sporządzić szereg
rozcieńczeń zgonie z poniŜszą tabelą:
nr
woda
[cm
3
]
standard H
2
O
2
[cm
3
]
stęŜenie H
2
O
2
[mg% w 1 cm
3
]
µmole H
2
O
2
w 1 cm
3
1
2
3
4
5
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
0,00
0,25
0,5
0,75
1,0
Przygotowane próbki wzorcowe wstawić do ultratermostatu o temperaturze 30
o
C i dalej
postępować analogicznie jak z próbami właściwymi.
Aktywność oksydazy glukozowej (A) wyrazić jako ilość mikromoli produktu wytworzoną przez
enzym w czasie 1 minuty (aktywność w grzybni) oraz jako ilość nanomoli produktu wytworzoną
przez enzym w czasie 1 minuty (aktywność w płynie pohodowlanym).
Dla ekstraktu z grzybni obliczyć aktywność w przeliczeniu na gram świeŜej masy grzybni, a
następnie gram suchej masy grzybni. Następnie policzyć wydajność bioprocesu, wyraŜoną jako
aktywność uzyskana z całej biomasy w kolbie, biorąc pod uwagę suchą masę grzybni.
Dla płynu pohodowlanego aktywność wyrazić w przeliczeniu na 1 cm
3
.
Oznaczenie zuŜycia substancji cukrowych w płynie pohodowlanym
Oznaczanie refraktometrycze cukrów:
25 cm
3
płynu pohodowlanego umieścić w cylindrze
o pojemności 50 cm
3
. Odbiałczać, w tym celu dodać 1,0 cm
3
odczynnika Carrez I, wymieszać,
dodać 1,0 cm
3
odczynnika Carrez II i ponownie wymieszać. Dopełnić wodą destylowaną do 30
cm
3
. Po 10 minutach sączyć przez średnią bibułę do klarowności. Nanieść kroplę na refraktometr i
odczytać wynik na skali sacharymetru w % sacharozy. Obliczyć ilość cukru w płynie
pohodowlanym.
Oznaczenie zmian kwasowości (a) i pH (b) płynu pohodowlanego
a. 5 cm
3
płynu pohodowlanego umieścić w zlewce o pojemności 100 cm
3
, dodać 5 cm
3
wody
destylowanej i miareczkować 0,01 M NaOH wobec fenoloftaleiny do pH 8,3 (punkt zmiany barwy
fenoloftaleiny; barwa ma się utrzymywać przez pół minuty). Wyniki przeliczyć na mg kwasu
glukonowego (1cm
3
1M NaOH odpowiada 0,196g kwasu glukonowego) w 5 ml płynu
pohodowlanego.
b. Zmierzyć pH płynu pohodowlanego.
7
Obliczenia i opracowanie wyników
1. Na podstawie obliczonych danych przedstawić na wykresach:
a) zmiany aktywności oksydazy glukozowej (A/g) w ekstraktach z grzybni i płynie
pohodowlanym (A/ml) oraz masy grzybni w zaleŜności od czasu trwania hodowli
b) zmiany poziomu cukru i pH płynu pohodowlanego w czasie hodowli.
Na tej podstawie omówić fazy hodowli badanego szczepu A. niger i uwarunkowania
biosyntezy oksydazy glukozowej.
2. Przedstawić na wykresie wydajność bioprocesu i wytypować najkorzystniejszy okres
hodowli dla produkcji enzymu; zaproponować sposoby podwyŜszenia efektywności
biosyntezy.
Literatura:
Bednarski W. i Reps A. (red). 2003. Biotechnologia Ŝywności. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne Warszawa.
Bednarski W. i Fiedurek J. (red.), 2007. Podstawy biotechnologii przemysłowej. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne
Warszawa.
Szewczyk K.W., 2003. Technologia biochemiczna. Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej.
Letters in Applied Microbiology 2001, 32, 16-19.
Whitaker J.R., Vovagen A.G.J., Wong D.W.S. (red.). 2003. Handbook of food enzymology. Marcel Dekker USA.