1

ĆWICZENIE 1

C

HARAKTERYSTYKA KINETYCZNA PROCESÓW BIOTECHNOLOGICZNYCH

–

BADANIE

DYNAMIKI BIOSYNTEZY OKSYDAZY GLUKOZOWEJ PRZEZ SZCZEP

A

SPERGILLUS NIGER

Oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4 – oksydaza – β-D-glukoza: tlen) jest enzymem

katalizującym odłączanie wodoru od substratu (glukozy) i przenoszenie go bezpośrednio na

cząsteczkę tlenu wg schematu:

C

6

H

12

O

6

+ O

2

+ H

2

O → C

6

H

12

O

7

+ H

2

O

2

Oksydaza jest odpowiedzialna za utlenianie nieufosforylowanej glukozy do kwasu glukonowego

z udziałem cząsteczki tlenu i wytworzeniem nadtlenku wodoru; jest więc enzymem posiadającym

zdolność przenoszenia dwóch elektronów wg schematu:

Β-D-glukopiranoza → δ

δ

δ

δ-D-glukonolakton + 2e + 2H

+

O

2

+ 2e + 2H

+

→ H

2

O

2

Enzym ten wykazuje wyjątkową specyficzność substratową dla β-anomeru D-glukozy - atakuje

grupę hydroksylową pierścienia glukopiranozowego znajdującą się w pozycji ekwatorialnej. Dużo

niższe powinowactwo wykazuje oksydaza glukozowa do α-D-glukozy (0,98). Jednak z uwagi na

zachodzącą w środowisku spontaniczną mutarotację α-glukozy do α-,β-glukozy, cała pula glukozy

jest dostępna dla enzymu. Aktywność oksydazy glukozowej do innych mono- i disacharydów jest

bardzo niska (powinowactwo do ksylozy 0,97, mannozy 0,64, maltozy 0,19, galaktozy 0,14, a w

stosunku do fruktozy, arabinozy, rybozy, laktozy, sacharozy czy rafinozy nie wykazuje żadnego

działania).

Z dotychczasowych badań wynika, że zarówno skład chemiczny jak i właściwości oksydazy

glukozowej tylko w niewielkim stopniu zależą od jej pochodzenia. Ważnym natomiast czynnikiem

warunkującym właściwości oksydazy jest stopień jej oczyszczenia. Ciężar cząsteczkowy enzymu w

zależności od jego pochodzenia waha się od 146 000 do 154 000. Jego punkt izoelektryczny jest

bliski pH 4,1, natomiast optimum działania mieści się w przedziale pH 5,5 - 6,0. Wiadomo, że

oksydaza glukozowa jest flawoproteidem współdziałającym z FAD jako koenzymem. Na 1 mol

apoenzymu przypadają 2 mole FAD, łączące się z białkiem apoenzymu przez ryboflawinę.

Apoenzym oksydazy glukozowej może być dimerem lub tetrametrem, w którym podjednostki

białkowe połączone są niekowalencyjnie. Skład aminokwasowy apoenzymu charakteryzuje się

nieznaczną ilością reszt cysteiny oraz nieproporcjonalnie wysoką zawartością aminokwasów

dikarboksylowych i hydrofobowych. W krystalicznym preparacie oksydazy glukozowej nie

wykryto metali takich jak żelazo i miedź. Mogą one jednak brać udział w tworzeniu kompleksu

enzymu z substratem jako kofaktory.

Oksydaza glukozowa jest wytwarzana przez wiele drobnoustrojów. Podstawowym źródłem

tego enzymu na skalę przemysłową są szczepy z rodzaju Aspergillus (A.niger) i Penicillium

2

(P. notatum, P. glaucum, P. funiculosum). Grzyby te hodowane są na podłożu o ściśle

zdefiniowanym składzie. Najczęściej wykorzystywanym w produkcji źródłem węgla jest glukoza,

w mniejszym stopniu sacharoza. Stosowane są także ekonomiczniejsze substraty takie jak melasa.

Optymalne źródło azotu dla syntezy oksydazy glukozowej to azotan wapniowy, podczas gdy sole

amonowe traktuje się jako inhibitory biosyntezy tego enzymu pobudzające jednocześnie wzrost

biomasy grzyba. Ważnym czynnikiem stymulującym wytwarzanie oksydazy glukozowej może być

zawarty w podłożu fosforan potasowy i jony magnezu. Wyniki badań wskazują, że induktorem

syntezy tego enzymu może też być węglan wapnia, warunkujący utrzymanie właściwego pH, a

także stanowiący oparcie dla grzybni w płynnej pożywce (sól nierozpuszczalna w wodzie) oraz

działający jako czynnik umożliwiający przestawienie metabolizmu glukozy z glikolizy na

bezpośrednie utlenianie przez oksydazę glukozową. Duży wpływ na zawartość oksydazy

glukozowej w grzybni ma szybkość mieszania przy stałym napowietrzaniu hodowli. Podczas

hodowli A. niger bardzo ważne jest też utrzymanie odpowiedniego pH pożywki (5,6), gdyż w

niskim pH grzyb syntetyzuje kwas cytrynowy.

O regulacji syntezy i wydzielania oksydazy glukozowej wiadomo stosunkowo niewiele. Enzym ten

jest produkowany jako część kompleksu enzymatycznego zawierającego także katalazę. Oksydaza

glukozowa

produkowana

przez

A.

niger

jest

zlokalizowana

w

peroksysomach

(wewnątrzkomórkowy enzym, którego produkcja wymaga mechanicznej dezintegracji grzybni i

oczyszczania). Kompleks enzymatyczny wytwarzany przez Penicillium zostaje natomiast

wydzielony do środowiska zewnętrznego.

W przemyśle spożywczym oksydaza glukozowa wykorzystywana jest do:

- usuwania nieznacznych ilości glukozy w obecności nadmiaru tlenu (zapobieganie reakcjom typu

Maillarda), co umożliwia np. poprawę koloru i długości przechowywania suszonych

produktów, przede wszystkim w przemyśle jajczarsko-drobiarskim (w procesie odcukrzania

jaj przed ich suszeniem utlenianie zawartej w jajach glukozy do kwasu glukonowego

zapobiega jej reakcji z grupami aminowymi albuminy, prowadzącej do brązowienia oraz

nieprzyjemnego zapachu produktu)

- usuwania niewielkich ilości tlenu w obecności nadmiaru glukozy (zapobieganie utlenianiu i

ochrona łatwo utleniających się produktów spożywczych podczas przechowywania,

zapobieganie rozwojowi aerobowej mikroflory, hamowanie procesów korozyjnych

opakowań w wyniku hamowania uwalniania żelaza z metalowej powierzchni puszek do

produktu), co sprowadza się do stosowania w przemyśle piwowarskim, owocowo-

warzywnym (zabezpieczanie soków przed ciemnieniem i utratą witaminy C, stabilizacja

barwy, smaku i zawartości witaminy C w konserwach owocowo-warzywnych z dodatkiem

3

glukozy, zapobieganie ciemnieniu nieenzymatycznemu produktów z ziemniaków takich jak

frytki i chipsy), winiarskim (dodatek oksydazy glukozowej do win i moszczów skutecznie

zastępuje ich pasteryzację lub siarkowanie), tłuszczowym (zapobieganie jełczeniu tłuszczy,

wydłużanie trwałości majonezu do 6, a nawet 12 miesięcy) i mięsnym (stabilizacja konserw

mięsnych z dodatkiem glukozy)

- utrwalania serów dojrzewających (w mieszaninie z glukozą), co zastępuje parafinowanie

- wykrywania i ilościowego oznaczania glukozy w żywności (również w chemii analitycznej i

diagnostyce medycznej do oznaczania glukozy w płynach ustrojowych).

Oksydaza glukozowa jest również stosowana w lecznictwie jako składnik niektórych leków do

leczenia ran, czy stanów zapalnych skóry oraz w preparatach do higieny jamy ustnej (nadtlenek

wodoru wykazuje działanie bakteriobójcze, szczególnie w odniesieniu do mikroflory beztlenowej).

Ponadto oksydaza glukozowa wykorzystywana jest do produkcji kwasu glukonowego. Związek ten

jest stosowany w przemyśle spożywczym jako regulator kwasowości produktów lub jako dodatek

przeciwdziałający zbrylaniu (glukoniany w sproszkowanych produktach żywnościowych), a w

farmacji i przemyśle spożywczym - do otrzymywania przyswajalnych przez organizm form jonów

(glukoniany żelaza, magnezu). Kwas glukonowy jest także wykorzystywany m.in. w produkcji

środków do prania, przemyśle tekstylnym, metalurgii, także jak dodatek do past do zębów i

cementu; produkcja roczna sięga 60 000 ton.

Oksydaza glukozowa jest często stosowana w przemyśle spożywczym razem z katalazą

(E.C.1.11.1.6), która umożliwia rozkład generowanego H

2

O

2

(katalazę stosuje się też w celu

usuwania nadtlenku wodoru dodanego do produktu w celu jego odkażenia). Ma wówczas miejsce

ciąg reakcji:

2C

6

H

12

O

6

+ 2O

2

+ 2H

2

O → 2C

6

H

12

O

7

+ 2H

2

O

2

(oksydaza glukozowa)

2H

2

O

2

→ 2H

2

O + O

2

(katalaza)

Sumarycznie: 2C

6

H

12

O

6

+ O

2

→ C

6

H

12

O

7

; zachodzi więc eliminacja nadtlenku wodoru i produkcja

kwasu glukonowego, bez wprowadzania cząsteczki tlenu z powrotem do środowiska reakcji

(stosowane mogą być więc jako biochemiczny przeciwutleniacz).

Z tego względu technologie produkcji obu tych enzymów są równocześnie udoskonalane. Oksydaza

glukozowa i katalaza są stosowane na dużą skalę w technologii od wczesnych lat 50.

4

W

YKONANIE ĆWICZENIA

I. Prowadzenie hodowli Aspergillus niger

Stacjonarną hodowlę szczepu należy prowadzić na brzeczce zestalonej agarem w temperaturze

30

o

C aż do wykształcenia przez szczep właściwych form zarodnikujących, a następnie przerośnięte

grzybnią skosy przechowywać w temperaturze 4

o

C.

Hodowlę wstrząsarkową należy prowadzić w kolbach stożkowych o pojemności 300 cm

3

zawierających po 100 cm

3

pożywki o następującym składzie:

melasa

10,000 %

Ca(NO

3

)

2

0,200 %

kwas cytrynowy

0,075 %

KH

2

PO

4

0,025 %

KCl 0,025 %
FeCl

3

x 6 H

2

O 0,001 %

Kolby z podłożem wyjałowić w autoklawie ciśnieniowym pod ciśnieniem 1,2 atmosfery

w temperaturze 120

o

C przez 45 minut. Po ostudzeniu do temperatury pokojowej podłoża szczepić

zawiesiną zarodników (o stałej gęstości) w ilości 2 cm

3

zawiesiny na kolbę, a następnie umieszczać

na wytrząsarce o amplitudzie 5 cm i częstości wychyleń 300 na minutę. Hodowlę prowadzić

w temperaturze 28

o

C przez 0, 16, 20, 25, 30, 33 i 43 godziny (po 2 kolby w każdym wariancie).

W odpowiednim czasie hodowle przerywać przez oziębienie do temperatury 4

o

C.

II. Wykonanie oznaczeń

Opisać krótko morfologię hodowli (charakter wzrostu: strzępki, grudki, wygląd grzybni

powietrznej). W każdej hodowli oznaczyć:

- aktywność oksydazy glukozowej w ekstrakcie z grzybni i w płynie pohodowlanym

- zmiany zawartości substancji cukrowych w płynie pohodowlanym

- zmiany kwasowości oraz pH płynu pohodowlanego

W tym celu grzybnię oddzielić od płynu pohodowlanego metodą sączenia przez sitko. Zmierzyć

objętość płynu pohodowlanego, a następnie umieścić go w chłodni do czasu analiz.

Grzybnię

czterokrotnie przemyć schłodzonym 0,85% NaCl (popłukując przy tym kolbę). Osuszyć delikatnie

bibułą i zważyć.

Następnie:

5

A.

Odważyć 1 g mokrej grzybni i dokładnie ucierać w moździerzu przez 10 minut ze szczyptą piasku.

W tym celu do moździerza najpierw wlać 3 cm

3

schłodzonego buforu (1 M NaCl w 0,2 M buforze

fosforanowym o pH 5,8), następnie dodać odważoną grzybnię i piasek. Rozcierając, dodawać

sukcesywnie bufor: po 3 minutach następne 3 cm

3

, po dalszych 3 - kolejne 4 cm

3

(razem 10 cm

3

buforu). Przenieść ilościowo (dokładnie popłukać moździerz!) do cylindra ze szlifem o pojemności

50 cm

3

, uzupełnić wodą do 50 cm

3

, zamieszać i odstawić na 2 minuty. Filtrować dwa razy przez ten

sam sączek ze średniej bibuły, z zawracaniem początkowej objętości, aż do uzyskania klarownego

przesączu (ekstraktu).

B.

Pobrać niewielką próbkę grzybni (0,5 g) i wyznaczyć jej suchą masę metodą wagową po uprzednim

wysuszeniu próbki w temperaturze 105

o

C do stałego ciężaru.

Próby klarownego ekstraktu grzybni oraz płynu pohodowlanego wykorzystać do dalszych analiz.

Oznaczenie aktywności oksydazy glukozowej w grzybni i płynie pohodowlanym

Odczynniki: - GOD

(4,30g glukozy + 50 cm

3

0,2M buforu fosforanowego o pH 5,8 + 1,5 cm

3

5mg% peroksydazy +

1,4 cm

3

1% o-dianizydyny (3,3’-dimetoksybenzydyna; amina aromatyczna), uzupełnione do 100 cm

3

)

- wzorce H

2

O

2

- 2,5 M H

2

SO

4

.

Zasada metody: Peroksydaza redukuje H

2

O

2

w obecności o-dianizydyny (DH

2

), która ulega

utlenieniu tworząc barwny związek D zgodnie z reakcją: H

2

O

2

+ DH

2

→ 2H

2

O + D.

Próba właściwa:

Do odpowiednio opisanych probówek odmierzyć po 1,0 cm

3

ekstraktów grzybni

lub płynu pohodowlanego

*

. Probówki umieścić w ultratermostacie o temperaturze 30

o

C celem

dogrzania badanych roztworów. Po 5 minutach dodać po 3 cm

3

odczynnika GOD. Inkubować

dokładnie 15 minut. Reakcję przerwać dodając po 5 cm

3

2,5 M H

2

SO

4

(końcówka z filtrem!).

Ekstynkcję badanych prób odczytać na spekolu przy λ= 530 nm.

Próba kontrolna: Do probówek odmierzyć po 1,0 cm

3

próbek klarownego ekstraktu grzybni lub

płynu pohodowlanego

**

. Wstawić do ultratermostatu o temperaturze 30

o

C. Po 5 minutach dodać po

5 cm

3

2,5 M H

2

SO

4

(końcówka z filtrem!) i

po 3 cm

3

odczynnika

GOD. Ekstynkcję badanych prób

odczytać na spekolu przy λ = 530 nm.

*

próby właściwe: 2 powtórzenia ekstraktu z grzybni i 1 powtórzenie płynu pohodowlanego dla każdej kolby

**

próby kontrolne: 1 powtórzenie ekstraktu z grzybni i płynu pohodowlanego dla każdej kolby

6

Krzywa wzorcowa H

2

O

2

:

Z podstawowego roztworu

H

2

O

2

o stężeniu 1 mg% sporządzić szereg

rozcieńczeń zgonie z poniższą tabelą:

nr

woda

[cm

3

]

standard H

2

O

2

[cm

3

]

stężenie H

2

O

2

[mg% w 1 cm

3

]

µmole H

2

O

2

w 1 cm

3

1
2
3
4
5

1,00
0,75
0,50
0,25
0,00

0,00
0,25
0,50
0,75
1,00

0,00
0,25

0,5

0,75

1,0

Przygotowane próbki wzorcowe wstawić do ultratermostatu o temperaturze 30

o

C i dalej

postępować analogicznie jak z próbami właściwymi.

Aktywność oksydazy glukozowej (A) wyrazić jako ilość mikromoli produktu wytworzoną przez

enzym w czasie 1 minuty (aktywność w grzybni) oraz jako ilość nanomoli produktu wytworzoną

przez enzym w czasie 1 minuty (aktywność w płynie pohodowlanym).

Dla ekstraktu z grzybni obliczyć aktywność w przeliczeniu na gram świeżej masy grzybni, a

następnie gram suchej masy grzybni. Następnie policzyć wydajność bioprocesu, wyrażoną jako

aktywność uzyskana z całej biomasy w kolbie, biorąc pod uwagę suchą masę grzybni.

Dla płynu pohodowlanego aktywność wyrazić w przeliczeniu na 1 cm

3

.

Oznaczenie zużycia substancji cukrowych w płynie pohodowlanym

Oznaczanie refraktometrycze cukrów:

25 cm

3

płynu pohodowlanego umieścić w cylindrze

o pojemności 50 cm

3

. Odbiałczać, w tym celu dodać 1,0 cm

3

odczynnika Carrez I, wymieszać,

dodać 1,0 cm

3

odczynnika Carrez II i ponownie wymieszać. Dopełnić wodą destylowaną do 30

cm

3

. Po 10 minutach sączyć przez średnią bibułę do klarowności. Nanieść kroplę na refraktometr i

odczytać wynik na skali sacharymetru w % sacharozy. Obliczyć ilość cukru w płynie

pohodowlanym.

Oznaczenie zmian kwasowości (a) i pH (b) płynu pohodowlanego

a. 5 cm

3

płynu pohodowlanego umieścić w zlewce o pojemności 100 cm

3

, dodać 5 cm

3

wody

destylowanej i miareczkować 0,01 M NaOH wobec fenoloftaleiny do pH 8,3 (punkt zmiany barwy

fenoloftaleiny; barwa ma się utrzymywać przez pół minuty). Wyniki przeliczyć na mg kwasu

glukonowego (1cm

3

1M NaOH odpowiada 0,196g kwasu glukonowego) w 5 ml płynu

pohodowlanego.

b. Zmierzyć pH płynu pohodowlanego.

7

Obliczenia i opracowanie wyników

1. Na podstawie obliczonych danych przedstawić na wykresach:

a) zmiany aktywności oksydazy glukozowej (A/g) w ekstraktach z grzybni i płynie

pohodowlanym (A/ml) oraz masy grzybni w zależności od czasu trwania hodowli

b) zmiany poziomu cukru i pH płynu pohodowlanego w czasie hodowli.

Na tej podstawie omówić fazy hodowli badanego szczepu A. niger i uwarunkowania

biosyntezy oksydazy glukozowej.

2. Przedstawić na wykresie wydajność bioprocesu i wytypować najkorzystniejszy okres

hodowli dla produkcji enzymu; zaproponować sposoby podwyższenia efektywności

biosyntezy.

Literatura:

Bednarski W. i Reps A. (red). 2003. Biotechnologia żywności. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne Warszawa.
Bednarski W. i Fiedurek J. (red.), 2007. Podstawy biotechnologii przemysłowej. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne

Warszawa.

Szewczyk K.W., 2003. Technologia biochemiczna. Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej.
Letters in Applied Microbiology 2001, 32, 16-19.
Whitaker J.R., Vovagen A.G.J., Wong D.W.S. (red.). 2003. Handbook of food enzymology. Marcel Dekker USA.