9.10.2011

Ćwiczenie 2

Metodyka oznaczania glukozy:

• glukoza (heksoza) - stanowi istotne źródło energii w tkankach ssaków, jest najważniejszym węglowodanem z uwagi na fakt, że niemal wszystkie węglowodany zawarte w pokarmach zostają przekształcone w glukozę zanim ulegną dalszemu metabolizmowi

• stężenie glukozy w osoczu krwi żylnej - na czczo u ludzi zdrowych 60-99 mg/dl (3,4-5,5 mmol/l) przeliczanie mg/dl na mmol/l= mg/dl : 1,78 =mmol/l

Przydatność kliniczna:

• oznaczanie stężenia glukozy w rozpoznawaniu i monitorowaniu stanów hiper i hipoglikemicznych

• rozpoznawanie cukrzycy, nieprawidłowej glikemii na czczo i nieprawidłowej tolerancji glukozy

• monitorowanie leczenia cukrzycy

• wykrywanie i diagnostyka stanów hiperglikemicznych

• przewlekłe lub ostre stany zapalne trzustki i wątroby

• endokrynopatie (zespół Cushinga itp.)

Zaburzenia przemiany węglowodanowej

• cukrzyca - grupa chorób metabolicznych charakteryzująca się hiperglikemią wynikającą z efektu wydzielania lub działania insuliny (powikłania: uszkodzenie wzroku, niewydolność nerek, wątroby, serca, uszkodzenie naczyń krwionośnych)

• stany przedcukrzycowe

• nieprawidłowa glikemia na czczo - wynik nasilonej glukoneogenezy w wątrobie

• upośledzona tolerancja glukozy - stan pośredni między prawidłową tolerancją a wystąpieniem pełnoobjawowej cukrzycy.

Klasyfikacja cukrzycy

• cukrzyca typu I - spowodowana zniszczeniem komórek β trzustki przez proces autoimmunologiczny co zwykle prowadzi do niedoboru insuliny

• cukrzyca typu II - wynika z postępującego upośledzenia insuliny rozwijającego się w warunkach insulino oporności

• cukrzyca o znanej etiologii

• cukrzyca ciążowa - nieprawidłowa glikemia na czczo, nieprawidłowa tolerancja glukozy lub cukrzyca po raz pierwszy wykryta w czasie ciąży, cukrzyca ciążowa występuje u 3-5% kobiet ciężarnych

• cukrzyca typu LADA (4-5 dekada życia, ale obraz cukrzycy typu I)

• cukrzyca typu MODY (młodzi ludzie, ale obraz cukrzycy typu II)

Celem rozpoznania zaburzeń węglowodanowych należy przeprowadzić następujące badania:

1. Oznaczenie glikemii, gdy występują objawy cukrzycy

1. w dowolnym czasie w ciągu dnia, bez konieczności bycia na czczo (tzw. glikemia przygodna). Wartość stężenia glukozy > 200 mg/dl (>11,1 mmol/l) upoważnia do wstępnego rozpoznania cukrzycy

2. jeżeli glikemia jest <200 mg/dl należy oznaczyć stężenie glukozy na czczo w osoczu krwi żylnej.

2. Gdy nie występują objawy cukrzycy lub przy glikemii przygodnej <200 mg/dl należy dwukrotnie oznaczyć glikemii w kolejnych dniach na czczo w osoczu krwi żylnej. jeśli glikemia dwukrotnie wyniesie ≥126 mg/dl (≥7 mmol/l) - rozpoznanie cukrzycy.

3. Jeśli jeden pomiar glikemii na czczo wyniesie 100-125 mg/dl (5,6-6,9 mmol/l) oraz gdy istnieje uzasadnione podejrzenie nietolerancji glukozy wykonuje się test doustnego obciążenia glukozą (OGTT).

Test OGTT

• pobranie wyjściowej próbki krwi żylnej w celu oznaczenia glukozy w osoczy (na czczo)

• obciążenie glukozą - pacjent wypija 75 g bezwodnej glukozy rozpuszczonej w 250-300 ml wody w ciągu 5 minut

• następnie pacjent pozostaje w spoczynku w pozycji siedzącej

• po 120 minutach należy pobrać dwukrotnie próbkę krwi żylnej celem oznaczenia stężenia glukozy w osoczu

GCT - badanie przesiewowe u kobiet ciężarnych w 24-28 tygodniu ciąży

• obciążenie 60 g bezwodnej glukozy (niekoniecznie na czczo)

• oznaczenie po 60 minutach.

Wynik OGTT:

• glikemia po 120 minutach <140 mg/dl (<7,8 mmol/l) dowodzi, że pacjent wykazuje prawidłową tolerancję glukozy

• 140-199 mg/dl (7,8-11 mmol/l) sugeruje nieprawidłową tolerancję glukozy

• >200 mg/dl (>11,1 mmol/l) rozpoznajemy cukrzycę

OGTT nie należy wykonywać u pacjentów, u których glukozy na czczo wynosi >140 mg/dl.

Oznaczenia:

• hemoglobina glikowana (HbA1c) - produkt nieenzymatycznego przyłączenia się glukozy do wolnych grup aminowych globiny w cząsteczce hemoglobiny

• oznaczanie hemoglobiny glikowanej nie jest testem rozpoznającym cukrzycę, ale może służyć jako test przesiewowy, pozwala na retrospektywną ocenę stężenia glukozy odzwierciedla bowiem średnie stężenie glukozy w ciągu poprzednich 120 dni

• metoda referencyjna oznaczania hemoglobiny glikowanej jest metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

Metody oznaczania glukozy

• metoda z oksydazą glukozową

• metoda z heksokinazą

• metoda z dehydrogenazą glukozową

• metoda amperometryczna z oksydazą glukozową

• testy paskowe.

Metoda z oksydazą glukozową

zasada metody:

• Glukoza jest utleniana przez oksydazę glukozy do kwasu glukonowego i nadtlenku wodoru;

• Nadtlenek wodoru reaguje w obecności peroksydazy z HBA (kwasem hydrobenzoesowym) i AAP (4-aminoantypiryną) tworząc czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości fali pomiędzy 460-560 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.

Metodyka oznaczeń białka całkowitego i albuminy

• Surowica krwi jest złożonym płynem biologicznym zawierającym 60-80 g/l różnorodnych białek;

• W prawidłowej surowicy występuje około 10 tys. białek;

• Poznano 490 białek przy czym około 150 z nich odgrywa rolę w diagnostyce laboratoryjnej i w prowadzonych aktualnie badaniach naukowych;

• Są wartościowymi biomarkerami czyli substancjami, których zmiany ilościowe i/lub jakościowe wskazują na obecność i naturę choroby.

Rola białek osocza:

• Dystrybucja płynów krew/przestrzeń pozanaczyniowa

• Hemostaza i krzepnięcie

• Funkcje transportowe (nośniki hormonów, metabolitów, metali, leków i in.)

• Enzymy

• Białka układu odpornościowego

• Składniki układu buforowego (około 18%)

• Hormony

• Receptory

• Materiał odżywczy i budulcowy

Zaburzenia w proporcji składu jak i zmiany w stężeniach poszczególnych białek mogą informować o:

• Nieprawidłowej funkcji narządów: wątroby, nerek, gruczołów dokrewnych;

• Obecności stanu zapalnego;

• Chorobie nowotworowej (markery onkologiczne)

• Patologii układu immunologicznego

• Choroby mózgu i opon mózgowo - rdzeniowych

Metodyka oznaczeń białka całkowitego i albuminy.

Czynniki wpływające na poziom białka całkowitego:

1. Dt. pobieranego materiału:

• Rodzaj pobranego materiału:

• Surowica/osocze

• Mocz - poranna porcja moczu, zbiórka dobowa, zbiórka nocna, zbiórka kilkugodzinna

• Dieta (wegetariańska - brak wpływu na stężenie białka całkowitego, natomiast obfity posiłek białkowy w przeciągu kilku dni przed badaniem może spowodować wzrost stężenia białka całkowitego maksymalnie o 10%);

• Okres pobierania materiału:

• W okresie zimowym stężenie białka całkowitego spada o 10% w porównaniu do okresu letniego;

• Informacja o podejrzeniu;

2. Dt. przygotowania pacjenta przed pobraniem materiału:

• Okres 12 godzin bez posiłku (min. 6-8 godz.) - zaburzenie ich rytmu dobowego. W ciągu dnia stężenie białka jest około 10% wyższe niż w nocy.

• Pozycja ciała pacjenta:

• Zmiana pozycji z leżącej na stojącą może po 30 minutach zwiększyć stężenie białka o około 10%

• Wysiłek fizyczny o kolejne 10%

• Pacjenci hospitalizowani mają niższe stężenie białka całkowitego o 5-10 g/l

3. Dt. samego aktu pobierania:

• Najlepiej bez użycia stazy (zbyt długie zaciśnięcie stazy przy pobieraniu może po kilku minutach spowodować wzrost stężenia białka całkowitego)

• Szybkie oddzielenie surowicy od masy krwinkowej

• Antykoagulant (heparyna ma zły wpływ na γ-globuliny)

4. Przechowywanie materiału:

• Temperatura pokojowa (próbka jest stabilna do 8-10 godzin jeżeli jest szczelnie zamknięta)

• Temperatura +4şC (stabilność przez 3-4 dni)

• Temperatura -20ş, -70şC (nawet do 6 miesięcy)

5. Inne

• Dostosowanie dobranej metody do oznaczania poszczególnych białek (metoda dostosowana do oczekiwanego stężenia białka)

• Aktualna i właściwa kalibracja

• Eliminowanie interferencji z powodu obecnych w materiale różnych związków chemicznych.

Oznaczanie białka całkowitego - metoda biuretowa

zasada metody: W środowisku alkalicznym wiązania peptydowe reagują z jonami miedzi tworząc niebiesko - fioletowy kompleks. Intensywność zabarwienia mierzona jest przy długości fali 520-560 nm i jest wprost proporcjonalna do stężenia białka całkowitego w badanej próbce.

Oznaczanie albuminy - metoda z BCG

zasada metody: Albumina wiąże się z zielenią bromokrezolową (BCG) powodując zmianę absorpcji widmowej barwnika. Natężenie barwy utworzonego kompleksu mierzone przy długości fali 625 nm jest proporcjonalne do stężenia albuminy w badanej próbce.

3

---