FARMACJA – Chemia organiczna

1

CHROMATOGRAFICZNE METODY ROZDZIAŁU SUBSTANCJI

Chromatografia, „pisanie kolorem” (gr. chroma = kolor + graphe = pisanie) jest

techniką służącą do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.

W metodzie tej następuje rozdział mieszaniny składników pomiędzy dwie fazy: fazę

nieruchomą – stacjonarną (bibuła filtracyjna, cienka warstwa adsorbentu naniesiona na

płytkę, wypełnienie kolumny) oraz dużą objętościowo fazę ruchomą – mobilną (ciecz lub

gaz). Faza ruchoma stanowi tu siłę napędową procesu, z kolei faza nieruchoma odgrywa

rolę siły hamującej migrację składników. Rozdział substancji pomiędzy obie fazy

następuje na skutek różnicy współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy

obydwie fazy. Szybkość migracji substancji jest tym większa, im mniejszy jest

współczynnik podziału (mniejsze powinowactwo składnika do fazy stacjonarnej).

W ogólnym przypadku, chromatograficzny rozdział substancji następuje w wyniku

przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę

stacjonarną. Podczas przepływu eluentu (fazy ruchomej) przez fazę stacjonarną następuje

proces elucji czyli wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji.

Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne

składniki są zatrzymywane w fazie stacjonarnej dłużej, a inne krócej (inna jest retencja),

dzięki czemu może następować ich separacja.

Chromatografia stosowana jest zarówno do badań jakościowych, ilościowych, jak i dla

celów preparatywnych. Sprzężenie, chromatografii gazowej z innymi metodami, na

przykład spektrometrią masową lub spektrofotometrią w podczerwieni, znacznie

rozszerza możliwości identyfikacji rozdzielanych składników.

PODZIAŁ METOD CHROMATOGRAFICZNYCH

Metody

chromatograficzne

można

klasyfikować

według

wielu

kryteriów.

W zależności od stanu skupienia fazy ruchomej, czyli medium wymywającego (eluentu),

rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:

•

chromatografia cieczowa, w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub

mieszanina rozpuszczalników,

•

chromatografia gazowa, w której eluentem jest gaz (hel, argon, azot, rzadziej wodór),

•

chromatografia fluidalna, w której eluentem jest ciecz w stanie nadkrytycznym (fluid).

FARMACJA – Chemia organiczna

2

Ze względu na stan skupienia fazy nieruchomej – stacjonarnej wyróżniamy układy:

Faza ruchoma

Faza stacjonarna

Typ chromatografii

gaz

ciecz

GLC gas – liquid chromatography

ciecz

ciecz

LLC liquid – liquid chromatography

gaz

ciało stałe

GSC gas – solid chromatography

ciecz

ciało stało

LSC liquid – solid chromatography

Zależnie od rodzaju zjawisk odpowiedzialnych za podział substancji wyróżnia się:

a.

chromatografię rozdzielczą (podziałową) – o zachowaniu się mieszaniny poddanej

rozdzieleniu decyduje współczynnik podziału poszczególnych składników pomiędzy

dwie nie mieszające się ze sobą ciecze. Fazę stacjonarną stanowi rozpuszczalnik

bardziej polarny zaadsorbowany w postaci cienkiej warstwy na odpowiednim

nośniku, a fazą ruchomą jest układ o mniejszej polarności (w chromatografii z

odwróconymi fazami układ faz jest odwrotny). Nośnikiem fazy stacjonarnej

najczęściej jest żel krzemionkowy, celuloza, ziemia okrzemkowa, skrobia

ziemniaczana, kauczuk.

b.

chromatografię adsorpcyjną – podstawą rozdziału jest niejednakowa skłonność

składników mieszaniny do adsorpcji fizycznej i chemicznej na powierzchni fazy

stacjonarnej (ciało stałe). Jako fazę stacjonarną stosuje się tlenek glinu, żel

krzemionkowy, węgiel aktywny, syntetyczne i naturalne krzemiany, tlenki,

siarczany i fosforany wapnia i magnezu. Fazę ruchomą stanowi ciecz lub gaz.

c.

chromatografię jonowymienną – wykorzystywane jest zjawisko różnych zdolności

do wymiany jonów przez składniki mieszaniny z wymieniaczem jonowym. Fazę

stacjonarną stanowi odpowiednio przygotowana żywica jonitowa.

d.

chromatografię żelową (sitową lub sączenie molekularne) – rozdzielanie polega

na zróżnicowanej dyfuzji cząsteczek w pory fazy stacjonarnej. Cząsteczki na tyle

duże, że ich dyfuzja jest wykluczona, szybko są wypłukiwane przez fazę ruchomą.

Cząsteczki mniejsze zatrzymują się na materiale nośnym i są wypłukiwane w

następnej kolejności.

Kolejny podział metod chromatograficznych wynika z różnego sposobu

umieszczenia nośnika:

a.

chromatografia kolumnowa – nośnik fazy stacjonarnej umieszczony jest w

kolumnie chromatograficznej, którą stanowi rura szklana, przewężona w dolnej

swej części, o stosunku wysokości fazy stacjonarnej (L) do kwadratu wewnętrznej

średnicy kolumny (D

2

) wynoszącym co najmniej 20. Lepsze warunki rozdziału

FARMACJA – Chemia organiczna

3

otrzymuje się, gdy stosunek L/D

2

przyjmuje większe wartości (od 90 do 150). Faza

ruchoma przemieszcza się pod wpływem siły grawitacyjnej.

b.

chromatografia planarna – możliwa tylko w chromatografii cieczowej. W jej

ramach można wyróżnić:

•

technikę cienkowarstwową TLC (ang. Thin Layer Chromatography) – faza

stacjonarna naniesiona jest na odpowiednie podłoże (płytki szklane lub

aluminiowe) w postaci cienkiej warstwy. Faza ruchoma przenoszona jest w

wyniku działania sił kapilarnych.

•

technikę bibułową – fazą stacjonarną jest bibuła (100% celulozy) o izotropowym

układzie włókien, fazą ruchomą – homogenna mieszanina rozpuszczalników

zawierająca wodę. Wykonuje się techniką wstępującą (rozpuszczalnik migruje

od dolnego końca bibuły zanurzonego w eluencie) lub zstępującą (spływową;

rozpuszczalnik migruje od górnego końca bibuły zanurzonego w eluencie).

Stosowana jest głównie do rozdziału aminokwasów, peptydów, sacharydów i

nukleotydów.

W

preparatywnej

chemii

organicznej

największe

zastosowanie

mają

chromatografie: adsorpcyjna i rozdzielcza, ze względu na przydatność tych technik do

całkowitego lub częściowego rozdzielania składników mieszanin reakcyjnych.

ADSORBENTY STOSOWANE W CHROMATOGRAFII

Adsorbenty stosowane w chromatografii powinny wykazywać odpowiednią

selektywność i aktywność w stosunku do rozdzielanych substancji oraz nie mogą z nimi

reagować.

Adsorbenty można podzielić na dwie grupy:

a.

adsorbenty polarne – wykazują zmienną aktywność w zależności od zawartości w

nich wody i rozpuszczalników organicznych. Należą do nich przede wszystkim

tlenek glinu, żel krzemionkowy oraz siarczany, fosforany i węglany magnezu i

wapnia, celuloza. Adsorbują się na nich dobrze związki o charakterze polarnym.

b.

adsorbenty niepolarne – wykazują zdolność do silnego wiązania rozpuszczalników

węglowodorowych. Należą do nich węgiel aktywny, grafit, talk. Adsorpcja związków

zależy od wielkości cząsteczek i od długości łańcuchów węglowych.

Adsorbenty stosowane w chromatografii adsorpcyjnej winny charakteryzować się

szczególnie rozwiniętą powierzchnią, gdyż substancja adsorbowana wiąże się z nią pod

postacią warstewki monomolekularnej. Takie właściwości wykazują zwłaszcza tlenek

glinu i węgiel aktywny.

FARMACJA – Chemia organiczna

4

Zastosowanie tlenku glinowego jako adsorbentu z reguły ogranicza się do związków

o niezbyt wielkiej polarności. Związki silnie polarne (cukry, aminokwasy), związane z

Al

2

O

3

, z trudem ulegają elucji.

Węgiel aktywny wykazuje szczególne powinowactwo do związków aromatycznych;

ich elucja może być przeprowadzona przy użyciu rozpuszczalników o budowie

aromatycznej.

Szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków organicznych

przedstawia się następująco:

celuloza < skrobia < sacharoza < CaSO

4

< silikażel < MgO < Al

2

O

3

< węgiel aktywny.

Zdolność adsorpcyjna związków organicznych zależy więc od ich polarności oraz

wielkości i polaryzowalności cząsteczek. Poszczególne grupy związków można ułożyć w

następujący szereg, w zależności od ich wzrastającego powinowactwa do polarnych

środków adsorbujących:

chlorowcopochodne węglowodorów < etery < aminy trzeciorzędowe, związki nitrowe

< estry < ketony, aldehydy < aminy pierwszorzędowe < amidy kwasowe < kwasy

karboksylowe.

ROZPUSZCZALNIKI STOSOWANE W CHROMATOGRAFII

Podobne obserwacje odnoszą się do stosowanych rozpuszczalników. Wynika z

nich, że zaadsorbowana substancja może zostać wyparta z adsorbentu przez

rozpuszczalnik wykazujący większe powinowactwo do tego adsorbentu niż wymywana

substancja.

Rozpuszczalniki można zestawić w szereg eluotropowy według ich wzrastających

zdolności wymywania (eluowania) adsorbowanej substancji z powierzchni adsorbentu

polarnego (Tab. 1):

Tabela 1.

Szereg eluotropowy rozpuszczalników.

1.

eter naftowy

2.

cykloheksan

3.

disiarczek węgla

4.

tetrachlorek węgla

5.

toluen

6.

benzen

7.

chlorek metylenu

8.

chloroform

9.

tetrahydrofuran

10.

octan etylu

11.

aceton

12.

butan-2-on

13.

n-propanol

14.

etanol

15.

metanol

16.

woda

17.

kwas octowy

18.

pirydyna

Zastosowanie niepolarnego adsorbentu (np. węgla aktywnego) wymaga użycia

rozpuszczalników (wymienionych w powyższym szeregu eluotropowym) w odwrotnej

kolejności, a więc elucję należy rozpoczynać rozpuszczalnikami najbardziej polarnymi.

FARMACJA – Chemia organiczna

5

Najczęściej jednak stosuje się odpowiednio dobraną mieszaninę dwóch lub więcej

rozpuszczalników.

Podsumowując, przy doborze warunków chromatografii adsorbcyjnej należy więc

pamiętać o następujących zasadach ogólnych:

•

związki polarne adsorbują się silniej niż związki niepolarne,

•

chromatografowanie

substancji

polarnych

wymaga

stosowania

słabszego

adsorbentu i polarnego eluentu,

•

chromatografowanie substancji niepolarnych wymaga zastosowania silniejszego

adsorbentu i niepolarnego eluentu.

CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC – thin layer chromatography) służy jako

niezwykle efektywna i wygodna metoda szybkiej analizy jakościowej oraz w preparatyce

do rozdziału niewielkich ilości substancji. Termin ten oznacza proces chromatograficzny

prowadzony na cienkiej warstwie fazy stacjonarnej naniesionej na podłoże z płytek

szklanych lub folii aluminiowych czy polimerowych. Przede wszystkim stosuje się ją do:

a.

określania liczby składników w mieszaninie,

b.

potwierdzenia lub wykluczenia obecności danej substancji,

c.

monitorowania postępu reakcji chemicznych,

d.

znalezienia optymalnych warunków dla chromatografii kolumnowej,

e.

analizy frakcji uzyskanych techniką chromatografii kolumnowej.

Technika chromatografii cienkowarstwowej łączy w sobie dwa zjawiska: podziału

substancji między dwie różne fazy ciekłe – obowiązuje tu prawo podziału Nernsta i

adsorpcji substancji na nośniku, czyli fazie stacjonarnej. W metodzie tej substancje

chromatografowane poruszają się z różną prędkością wraz z ciekłą fazą ruchomą przez

cienką warstwę stałego adsorbentu naniesionego na płytkę. Towarzyszą temu procesy

adsorpcji i desorpcji oraz podział między ciekłą fazą organiczną i wodą, która w

niewielkich ilościach znajduje się na nośniku. W związku z tym warunki procesu są

trudne do jednoznacznej definicji i kontroli eksperymentalnej.

W chromatografii cienkowarstwowej adsorbent (zazwyczaj z dodatkiem gipsu)

nakładany jest w postaci papki na odtłuszczoną płytkę za pomocą specjalnych urządzeń

(powlekaczy). Grubość warstwy adsorbentu uzależniona jest od rodzaju przeznaczenia:

a.

do analizy jakościowej używa się płytek o grubości nośnika ok. 0.25 mm,

b.

przy analizie ilościowej grubość warstwy wynosi ok. 2 mm.

Płytki do chromatografii cienkowarstwowej można przygotowywać samodzielnie.

Jednakże dostępne w handlu gotowe produkty charakteryzują się dużo lepszą jakością

FARMACJA – Chemia organiczna

6

(równomierność warstwy nośnika, aktywność adsorbentu) z czym wiąże się lepsza

powtarzalność wyników analizy chromatograficznej.

Próbkę nanosi się na płytkę TLC w postaci roztworu o bardzo małej objętości,

tworząc małą plamkę w punkcie startowym. Płytki umieszcza się w komorze

chromatograficznej (Ryc. 1), w której na dnie znajduje się faza ruchoma. W wyniku

działania sił kapilarnych faza ruchoma wędruje w górę płytki. Jest to proces rozwijania

chromatogramu metodą wstępującą. Oddziaływanie substancji znajdujących się w próbce

z adsorbentem oraz z poruszającym się rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie się

składników próbki na płytce i poszczególne składniki tworzą oddzielne plamki. Plamki

rozdzielanych składników należy uwidocznić, by ostatecznie zidentyfikować skład próby.

Ryc. 1. Komora chromatograficzna z zanurzoną płytką.

Tok postępowania przy wykonywaniu chromatografii cienkowarstwowej jest następujący:

1.

Przygotowanie płytki

Należy zaznaczyć miękkim ołówkiem grafitowym (ostrożnie, by nie zdrapać adsorbentu)

linię startu, która powinna znajdować się na węższym boku płytki w odległości 8-15 mm

od krawędzi.

2.

Naniesienie substancji na płytkę

Za pomocą specjalnych mikropipet lub kapilar na linii startu nanosi się substancję w

postaci ok. 0.5-3%-ego roztworu (w łatwo lotnym rozpuszczalniku). Zbyt duże ilości

naniesionych substancji prowadzą do pogorszenia efektu rozdzielania, a mianowicie do

tworzenia tzw. „ogonów”. Średnica powstałej plamki powinna być jak najmniejsza (1.5-2

mm, maksymalnie 5 mm) i znajdować się około 15 mm od bocznej krawędzi płytki.

Plamkę naniesionej próbki należy odpowiednio wysuszyć.

3.

Rozwijanie chromatogramu

Rozwijanie chromatogramu prowadzi się w specjalnych komorach chromatograficznych,

w ostateczności można używać dużych słoi ze szczelną pokrywką (Ryc. 2).

Ryc. 2. Komory chromatograficzne.

FARMACJA – Chemia organiczna

7

Do komory wlewamy rozpuszczalnik do wysokości ok. 0.5 cm zwracając przy tym uwagę,

aby poziom rozpuszczalnika znajdował się poniżej linii startowej na płytce. Wewnątrz

komory ustawia się bibułę, która nasiąkając rozpuszczalnikiem utrzymuje nasycenie

komory jego parami. Płytkę wstawiamy do komory linią startową do dołu i zakrywamy

szczelnie pokrywą. Gdy rozpuszczalnik osiągnie wysokość ok. 1 cm od górnej krawędzi

płytki, wyjmujemy ją z komory i pozostawiamy do wyschnięcia. Ołówkiem zaznaczamy

linię, do której dotarł rozpuszczalnik („czoło rozpuszczalnika”).

4.

Wywoływanie chromatogramu

Wywoływanie chromatogramów przeprowadza się w przypadku związków barwnych w

świetle widzialnym. Dla związków z grupami chromoforowymi stosuje się naświetlanie

promieniowaniem ultrafioletowym. Związki bezbarwne wywołujemy przez wstawienie

chromatogramu do pojemnika z jodem. Większość związków, z wyjątkiem nasyconych

węglowodorów i chlorowcopochodnych, tworzy z parami jodu barwne kompleksy,

ukazujące się w postaci brunatnych lub fioletowych plam. Niekiedy można

chromatogramy spryskiwać odpowiednimi roztworami substancji, które reagują z

rozdzielanymi związkami (Ryc. 3). W temperaturze pokojowej lub po ogrzaniu pojawiają

się barwne produkty.

Ryc. 3. Przykładowe spryskiwacze stosowane

w chromatografii.

5.

Identyfikacja substancji

Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, który określa położenie

substancji na chromatogramie, jest współczynnik opóźnienia R

f

(ang. retardation factor).

Jest to stosunek drogi migracji substancji (a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (b):

R

f

= a/b. Inaczej mówiąc, substancje rozdzielane identyfikuje się na podstawie stosunku

szybkości

przemieszczania

się

badanej

substancji

do

szybkości

wędrowania

rozpuszczalnika (Ryc. 4).

Ryc. 4. Ilustracja pomiaru współczynnika R

f

:

a = odległość od linii startu do środka plamy;

b = odległość od linii startu do czoła rozpuszczalnika.

Współczynnik R

f

w danych warunkach doświadczalnych oraz w danym układzie

chromatograficznym jest wartością stałą i charakterystyczną dla danej substancji, choć

jako kryterium tożsamości związku nie może być stosowany bezpośrednio, a tylko w

porównaniu z substancją wzorcową, naniesioną na tym samym chromatogramie. Układ

x

x

x

b

a'

a''

a'''

FARMACJA – Chemia organiczna

8

rozwijający (faza ruchoma) musi być tak dobrany, aby była wyraźna różnica pomiędzy R

f

analizowanych związków, aby związki nie zostawały na miejscu nałożenia plamki, oraz

aby nie migrowały z czołem rozpuszczalnika (wtedy wartość R

f

wynosi 1).

W praktyce rzadko udaje się odtworzyć warunki chromatografii tak, by uzyskać

identyczne wartości R

f

, gdyż zależą one od, nawet niewielkich, zmian w następujących

czynnikach:

a.

wymiary ziaren adsorbentu,

b.

skład

rozpuszczalnika

i

stopień

nasycenia

atmosfery

komory

parami

rozpuszczalnika,

c.

aktywacja i warunki przechowywania płytek,

d.

grubość warstwy adsorbentu,

e.

temperatura otoczenia.

Do zalet chromatografii cienkowarstwowej można zaliczyć:

a.

krótki czas wykonania chromatogramu,

b.

dobry rozdział związków,

c.

wygodną obserwację we wszystkich stadiach rozdziału,

d.

dużą

szybkość

przepływu

rozpuszczalnika,

co

skraca

czas

rozwijania

chromatogramu.

Chromatografia cienkowarstwowa znalazła również zastosowanie w preparatyce. W

wersji preparatywnej TLC rozdział mieszaniny prowadzi się na płytkach o grubszej, na

przykład 2 mm, warstwie adsorbentu. Rozdzielaną mieszaninę nanosi się nie punktowo,

ale w linii na długości kilkunastu centymetrów. Po rozdziale warstwę adsorbentu

zawierającą wyodrębniony składnik mieszaniny zeskrobuje się, a sam składnik

ekstrahuje (wypłukuje) rozpuszczalnikiem i po zatężeniu oraz odsączeniu adsorbentu

otrzymuje w stanie czystym.

W ostatnich latach opracowano nowy sposób rozwijania chromatogramów na

cienkich warstwach w pozycji poziomej (Ryc. 5). Sposób ten wymaga mniejszej ilości

układu rozwijającego i umożliwia wielokrotne użycie płytek.

Ryc. 5. Komora pozioma do chromatografii

cienkowarstwowej.

SĄCZENIE MOLEKULARNE

Sączenie molekularne po raz pierwszy zostało wprowadzone w roku 1959 przez

Pera Flodina i Jerkera Poratha. Jest to rodzaj chromatografii cieczowej, w której

FARMACJA – Chemia organiczna

9

wykorzystuje się fizyczne i chemiczne właściwości odpowiednio spreparowanego

polisacharydu znanego pod nazwą Sephadex (SEparation PHArmacia DEXtran). Technika

ta umożliwia analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą

cząsteczkową.

Sephadex jest handlową nazwą złoża stanowiącego poprzecznie usieciowane

łańcuchy dekstranu (roślinnego polisacharydu glukozy), w którym występują wiązania

α

-1,6-,

α

-1,3-,

α

-1,4-glikozydowe. Żel ten ma postać granulek o średnicy 10-300 µm.

Cząsteczki sefadeksów zawierają liczne grupy hydroksylowe, dlatego substancje te łatwo

pęcznieją w wodzie i roztworach elektrolitów, gdyż cząsteczki wody bez przeszkód wnikają

w przestrzenie sieci molekularnej. Usieciowanie wpływa na zdolność wchłaniania wody,

co decyduje o właściwościach rozdzielczych żelu. Cząsteczki te posiadają trójwymiarową

strukturę sieci przestrzennej. Im więcej tworzy się „oczek” tej sieci, tym są one mniejsze.

Produkowane są złoża, w których stopień usieciowienia określa cyfra znajdująca się przy

dużej literze „G” (od G-10 do G-200), przy czym im większa cyfra tym niższe

usieciowienie. Im mniejszy stopień usieciowania, tym więcej wody wchłania sefadeks. Na

przykład 1 g sefadeksu G-10 wiąże 1 g wody (usieciowanie jest wyjątkowo gęste i

przestrzenie małe). Natomiast 1 g sefadeksu G-200 wiąże 20 g wody, co wskazuje na duże

„oczka” sieci.

Jeśli przez kolumnę wypełnioną sefadeksem przepływa roztwór zawierający

cząsteczki o różnej wielkości, to molekuły większe od największych przestrzeni sieci bez

przeszkód wypływają z kolumny, omijając ziarna żelu. Cząsteczki o mniejszych

rozmiarach przenikają do wnętrza sieci przestrzennej, tym głębiej, im mniejsze są ich

wymiary w porównaniu ze średnicą „oczek”. Usuwanie tych cząsteczek z wnętrza ziaren

sefadeksu jest tym trudniejsze im mniejsze są te cząsteczki. Z tego względu rozdział

składników mieszaniny na sefadeksie przebiega w kolejności malejących rozmiarów

cząsteczek poszczególnych składników, co pokrywa się z ich malejącymi masami

cząsteczkowymi (Ryc. 6).

Ryc. 6. Mechanizm separacji cząsteczek

na podstawie wielkości i kształtu przy

zastosowaniu sączenia molekularnego [1].

FARMACJA – Chemia organiczna

10

Tok postępowania przy wykonywaniu sączenia molekularnego jest następujący:

1.

Przygotowanie żelu

Należy odważyć odpowiednią ilość żelu do żaroodpornego naczynia i dodać roztwór

pełniący rolę eluentu. Całość trzeba ogrzewać do wrzenia przez pewien czas, celem

usunięcia zaadsorbowanego powietrza i napęcznienia żelu, po czym pozostawić do

swobodnego ochłodzenia.

2.

Przygotowanie kolumny

Szklaną rurę należy umieścić pionowo w statywie i zamknąć dolny wylot przy pomocy

polietylenowego wężyka i zaciskacza. Na dno kolumny układa się odrobinę waty, przy

zamkniętym zaciskaczu wlewa niewielką porcję rozpuszczalnika, przez otwarcie

zaciskacza wpuszcza się rozpuszczalnik do przewężenia kolumny, po czym zamyka

zaciskacz. Długą bagietką należy wycisnąć powietrze z waty i następnie wlać jednorodną

zawiesinę żelu do kolumny. Wierzch żelu zabezpieczyć trzeba krążkiem bibuły filtracyjnej,

po czym upakować żel w kolumnie przez otwarcie zaciskacza i przepuszczenie przez

kolumnę porcji rozpuszczalnika o objętości równej objętości złoża żelu.

3.

Naniesienie próbki substancji

Próbkę substancji w postaci roztworu (wskazane jest sporządzenie roztworu w

rozpuszczalniku przeznaczonym do elucji) należy nanieść na powierzchnię żelu za

pomocą odpowiedniej pipety. Trzeba wykonywać to bardzo ostrożnie, tak by nie zburzyć

wierzchniej warstwy żelu (substancja jest wtedy wymywana równomiernie). Otwierając

wylot kolumny należy poczekać do całkowitego wniknięcia próbki w żel, zamknąć wylot i

nanieść niewielką porcję rozpuszczalnika, spłukując resztki substancji z wewnętrznych

ścianek kolumny, znów poczekać aż wniknie, po czym wprowadzić delikatnie kolejną

porcję fazy ruchomej.

4.

Zbieranie frakcji

Od momentu naniesienia substancji oczyszczanej do całkowitego jej wyeluowania należy

zbierać wypływające frakcje w ściśle określonych objętościach do niewielkich naczyń

(probówki, kolby stożkowe).

5.

Wyznaczenie współczynnika podziału – szczególnie w analizie ilościowej mieszanin

związków naturalnych o dużej masie cząsteczkowej, takich jak białka, peptydy, enzymy,

hormony, kwasy nukleinowe, itp.

Pytania sprawdzające:

1.

Wymień techniki chromatograficzne zależne od stanu skupienia fazy ruchomej.

2.

Wymień typy chromatografii zależne od stanu skupienia fazy stacjonarnej.

FARMACJA – Chemia organiczna

11

3.

Podaj rodzaje chromatografii zależne od rodzaju zjawisk odpowiedzialnych za

podział substancji.

4.

Jakie znasz rodzaje chromatografii? Jakie są między nimi różnice?

5.

Wymień znane adsorbenty stosowane w chromatografii.

6.

Podaj szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków

organicznych.

7.

Co to jest szereg eluotropowy?

8.

Podaj szereg 5 rozpuszczalników według ich wzrastających zdolności wymywania

adsorbowanej substancji z powierzchni adsorbentu polarnego.

9.

Co to jest współczynnik R

f

? Jak się go wyznacza?

10.

Scharakteryzuj sefadeksy. Co oznaczają symbole G-10 i G-25?

11.

Omów zasadę rozdziału substancji na sitach molekularnych.

12.

Podaj zalety chromatografii cienkowarstwowej.

13.

Jakie są kryteria doboru rozpuszczalnika do chromatografii?

14.

Opisz krótko technikę chromatografii preparatywnej.

Literatura:

[1]

Mariusz Rosiński, Dorota Piasecka-Kwiatkowska, Jerzy R. Warchalewski, Przegląd

metod separacji i oczyszczania białek przydatnych w badaniach i analizie żywności,

ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2005, 3 (44), 5-22.