Genetyczne choroby mięśnia sercowego
Kardiomiopatia przerostowa
definicja

Choroba mięśnia sercowego najczęściej uwarunkowana genetycznie

(mutacja genu kodującego jedno z białek sarkomeru sercowego),

charakteryzująca się

przerostem głównie mięśnia lewej komory,

często z asymetrycznym przerostem przegrody międzykomorowej,

zwykle z zachowaną czynnością skurczową

1 na 500 osób w ogólnej populacji osób dorosłych.

dziedziczy się autosomalnie dominująco

Zmiany genetyczne w kardiomiopatii przerostowej

Większość z około 400 dotychczas zidentyfikowanych mutacji to mutacje zmiany sensu spowodowane
zamianą jednej reszty aminokwasowej na inną; inne możliwe to delecje lub insercje

mutacja dotyczyć może któregokolwiek z 11 genów kodujących białka sarkomeru sercowego,

największa liczba mutacji (ponad połowa przypadków HCM):

Geny łańcucha ciężkiego beta-miozyny (MYH3),

genu białka C wiążącego miozynę (MYBPC3)

Genu sercowej troponiny T (TNNT2)

rzadsze mutacje:

genu tityny (TTN),

regulatorowego lekkiego łańcucha miozyny (MYL2),

zasadniczego lekkiego łańcucha miozyny (MYL3),

a-aktyny (ACTC),

a-tropomiozyny (TPM1),

sercowej troponiny I (TNNI3).

Geny modyfikujące i czynniki środowiskowe, obok mutacji będących przyczyną choroby, mogą wpłynąć na
fenotypową ekspresję HCM.

Kardiomiopatia przerostowa
Objawy podmiotowe

duszność wysiłkowa

(najczęstszy objaw),

orthopnoë,

ból dławicowy,

kołatania serca,

zawroty głowy,

omdlenia lub stany przedomdleniowe

(zwłaszcza w postaci z zawężaniem drogi odpływu lewej komory).

Kardiomiopatia przerostowa
Objawy przedmiotowe

mruk skurczowy nad koniuszkiem serca,

rozlany impuls lewej komory,

czasem dwubitne uderzenie koniuszkowe,

III (tylko w niewydolności lewej komory) lub IV ton (głównie u młodych chorych),

klik wczesnoskurczowy

(wskazujący na duże zwężenie drogi odpływu lewej komory),

szmer skurczowy, zwykle crescendo-decrescendo,

czasem chybkie, dwubitne tętno obwodowe.

Kardiomiopatia przerostowa
Przebieg naturalny

zależy od:

stopnia przerostu mięśnia,

wielkości gradientu w drodze odpływu,

skłonności do arytmii

zwłaszcza migotania przedsionków

i arytmii komorowych

Często chorzy dożywają późnego wieku, ale zdarzają się też nagłe zgony w młodym wieku i niewydolność serca

Kardiomiopatia przerostowa
Czynniki ryzyka nagłego zgonu

•

wystąpienie zatrzymania czynności serca lub trwałego częstoskurczu komorowego

•

nagły zgon sercowy u krewnego 1. stopnia

•

niewyjaśnione omdlenie przebyte niedawno

•

grubość ściany lewej komory ≥30 mm

•

nieprawidłowa reakcja ciśnienia tętniczego (wzrost <20 mm Hg lub spadek ≥20 mm Hg) podczas wysiłku
fizycznego

•

nietrwałe częstoskurcze komorowe w badaniu holterowskim lub w elektrokardiograficznej próbie

wysiłkowej

•

obecność innych czynników wpływających na ryzyko

znacznego zawężania drogi odpływu lewej komory,

efektu późnego wzmocnienia kontrastowego w MR,

> 1 mutacji genowej

Kardiomiopatia przerostowa
Badania pomocnicze

•

EKG:

patologiczny załamek Q,

zwłaszcza w odprowadzeniach znad ściany dolnej i bocznej,

sinistrogram,

nieprawidłowy załamek P

wskazuje na powiększenie lewego przedsionka lub obu przedsionków

głęboki ujemny załamek T w odprowadzeniach V2-V4

w postaci koniuszkowej HCM

•

RTG klatki piersiowej:

powiększenie lewej komory lub obu komór i lewego przedsionka, zwłaszcza gdy współistnieje
niedomykalność zastawki mitralnej.

Kardiomiopatia przerostowa
Badania pomocnicze

Echokardiografia:

znaczny przerost mięśnia sercowego,

w większości przypadków uogólniony,

zwykle obejmuje przegrodę międzykomorową oraz ścianę przednią i boczną.

u części chorych przerost tylko podstawnej części przegrody, powodujący zawężanie drogi
odpływu lewej komory,

czemu w 25% przypadków towarzyszy ruch do przodu płatków zastawki mitralnej w czasie
skurczu oraz niedomykalność tej zastawki.

w 1/4 przypadków występuje gradient między drogą odpływu lewej komory i aortą (gradient >30 mm
Hg ma znaczenie rokownicze).

badanie zalecane

w ramach wstępnej oceny chorego z podejrzeniem HCM

jako badanie przesiewowe u krewnych chorych z HCM

Kardiomiopatia przerostowa

Badania pomocnicze

•

Elektrokardiograficzna próba wysiłkowa:

do oceny ryzyka nagłej śmierci sercowej u chorych z HCM.

•

MR:

zalecany przy utrudnionej ocenie echokardiograficznej.

•

Badania genetyczne:

zalecane u krewnych 1. stopnia chorych z HCM.

Kardiomiopatia przerostowa
Badania pomocnicze

24-godzinne monitorowanie EKG metodą Holtera:

w celu wykrycia ewentualnych częstoskurczów komorowych oraz ustalenia wskazań do wszczepienia
ICD.

Koronarografia:

w przypadku bólu w klatce piersiowej, w celu wykluczenia współistniejącej choroby wieńcowej

Kardiomiopatia przerostowa
Kryteria rozpoznania

stwierdzenie za pomocą echokardiografii przerostu mięśnia sercowego

wykluczenie innych przyczyn przerostu, m.in.:

nadciśnienia tętniczego

zwężenia zastawki aortalnej

Kardiomiopatia przerostowa
Leczenie farmakologiczne

•

Chorzy bez objawów podmiotowych:

obserwacja

•

Chorzy z objawami podmiotowymi:

beta-blokery,

zwłaszcza u chorych z powysiłkowym gradientem w drodze odpływu lewej komory;

dawkę zwiększać stopniowo w zależności od obserwowane] skuteczności i tolerancji leku
(konieczna stała kontrola ciśnienia tętniczego, tętna i EKG);

w razie nieskuteczności Ca-blokery

werapamil 120-480 mg/d lub diltiazem 180-360 mg/d,

ostrożnie u chorych z zawężaniem drogi odpływu (u tych chorych nie stosuje się nifedypiny,
nitrogliceryny, glikozydów naparstnicy i ACEI)

Kardiomiopatia przerostowa
Leczenie farmakologiczne

•

Chorzy z niewydolnością serca:

leczenie farmakologiczne takie jak w kardiomiopatii rozstrzeniowej

•

Migotanie przedsionków:

przywrócenia rytmu zatokowego i jego utrzymanie:

amiodaron

(wskazany także w razie występowania arytmii komorowych)

sotalol

u chorych z przewlekłym migotaniem przedsionków przewlekle leczenie przeciwkrzepliwe

Kardiomiopatia przerostowa
Leczenie inwazyjne

•

Operacyjne wycięcie części przegrody międzykomorowej zawężającej drogę odpływu lewej komory
(miektomia, zabieg Morrowa):

u chorych, u których chwilowy gradient na tej drodze wynosi >5O mm Hg

w spoczynku

lub w czasie obciążenia wysiłkiem fizycznym

oraz występują nasilone dolegliwości niereagujące na leczenie farmakologiczne ograniczające
aktywność życiową, zwykle:

duszność wysiłkowa

ból w klatce piersiowej

•

Przezskórna alkoholowa ablacja przegrody:

wstrzyknięcie alkoholu absolutnego do przegrodowej gałęzi przeszywającej

w celu wywołania zawału serca w bliższym odcinku przegrody międzykomorowej,

wskazania takie same jak w przypadku miektomii;

skuteczność podobna jak leczenia operacyjnego

niezalecana u dorosłych ‹40. rż., u których można przeprowadzić miektomię

Kardiomiopatia przerostowa
Leczenie inwazyjne

•

Elektrostymulacja dwujamowa serca:

w celu umożliwienia intensywniejszego leczenia farmakologicznego,

ew. u chorych, u których nie można wykonać miotomii lub ablacji alkoholowej:

nie zaleca się jednak w ciężkiej postaci zawężającej HCM

•

Przeszczepienie serca:

w krańcowej niewydolności serca niepoddającej się leczeniu.

•

Wszczepienie kardiowertera-defibrylatora:

w prewencji pierwotnej

u chorych obciążonych dużym ryzykiem nagłego zgonu

w prewencji wtórnej

u chorych, którzy przebyli zatrzymanie czynności serca

z trwałym, spontanicznie pojawiającym się częstoskurczem komorowym

Kardiomiopatia przerostowa
MONITOROWANIE

ekg wysiłkowe i EKG metodą Holtera

u obciążonych dużym ryzykiem zgonu co roku,

u obciążonych małym ryzykiem co 3-5 lat

w razie wykrycia patogennej mutacji u osoby bez objawów choroby okresowe badania kontrolne (obejmujące
również EKG i TET) :

co 5 lat u dorosłych,

co 12-18 mies. u dzieci.

Arytmogenna kardiomiopatia prawej komory
(ARVC, arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy)

choroba mięśnia sercowego

postępujący zanik kardiomiocytów – głównie prawej komory, które są zastępowane przez tkankę tłuszczową i
włóknistą

elektryczna niestabilność w mięśniu sercowym,

groźne komorowe zaburzenia rytmu serca

ARVC – etiologia

proces chorobowy w przebiegu ARVC rozpoczyna się w warstwie podnasierdziowej lub śródściennej i
postępuje w kierunku wsierdzia

Zmiany obejmują

zwykle wolną ścianę prawej komory

obszary akinezy i dyskinezy

poszerzenie jamy prawej komory serca

u ponad 70% pacjentów dochodzi do zajęcia lewej komory.

stosunkowo rzadko ARVC prowadzi do rozwoju niewydolności serca

Arytmogenna kardiomiopatia prawej komory – epidemiologia

1/5000 urodzeń

choroba występuje z częstością 3–22/5000 mieszkańców

na wyspie Naxos

w regionie Veneto we Włoszech

częściej dotyczy mężczyzn niż kobiet (2,7:1),

Arytmogenna kardiomiopatia prawej komory – epidemiologia

w większości przypadków ujawnia się przed 40. rokiem życia.

12,5–25% przypadków SCD występujących między 20. a 40. rokiem życia

związek z wysiłkiem

główna przyczyna (obok kardiomiopatii przerostowej) nagłej śmierci sercowej u sportowców
oraz u młodych, pozornie zdrowych osób.

PRZYCZYNY ARVC

Zapalenie mięśnia sercowego??

U niektórych pacjentów z ARVC wykazano obecność w myocardium genomu wirusów kardiotropowych,
takich jak enterowirusy i adenowirusy

zapalenie mięśnia sercowego jest przyczyną ARVC?

czy też chory mięsień jest bardziej podatny na infekcje?

PRZYCZYNY ARVC

hipoteza apoptozy kardiomiocytów, z następczym rozwojem tkanki włóknistej i tłuszczowej.

bioptaty mięśnia sercowego od osób z niedawno rozpoznaną objawową ARVC lub z zaostrzeniem
objawów ARVC charakteryzują się wysokim wskaźnikiem apoptotycznym.

apoptoza jest pierwotną przyczyną ARVC???,

czy apoptoza jest procesem wtórnym do działania nieznanych jeszcze czynników???

PRZYCZYNY ARVC

hipoteza transdyferencjacji

kardiomiocyty mogą ulec przeprogramowaniu, a następnie zróżnicowaniu w komórki tkanki tłuszczowej

nie wiadomo jednak, jaki czynnik mógłby zainicjować takie przemiany.

Podłoże genetyczne

około 30–50% przypadków ARVC występuje rodzinnie

dziedziczy się najczęściej w sposób autosomalnie dominujący z niepełną penetracją i różną ekspresją.

zidentyfikowano kilka genów, z których 4 kodują białka wchodzące w skład desmosomów, odpowiadające za
przyleganie komórek do siebie (choroba desmosomów!)

plakoglobiny (chromosom 17)

desmoplakiny (chromosom 6)

plakofiliny (chromosom 1)

desmogleiny (chromosom 18)

Choroba z Naxos

postać ARVC skojarzona z występowaniem objawów pozasercowych:

zmiany skórne pod postacią rogowacenia dłoni i stóp (palmoplantar keratosis)

„wełniste” włosy

pierwsze przypadki opisano na greckiej wyspie Naxos

dziedziczy się w sposób autosomalnie recesywny

delecja w genie plakoglobiny (chr.17)

plakoglobina jest składnikiem desmosomów i połączeń skórno-naskórkowych

Choroba z Naxos

Podział anatomopatologiczny

typ włóknisto-tłuszczowy

typ tłuszczowy

Anatomopatologia - ARVC

Przebieg kliniczny ARVC

zróżnicowany:

mimo zaawansowanych zmian strukturalnych w prawej komorze, choroba może przebiegać

bezobjawowo,

u osób z pozornie zdrowym sercem mogą wystąpić zagrażające życiu tachyarytmie komorowe.

u około 10–20% pacjentów wraz z postępem choroby dochodzi do rozwoju niewydolności serca

początkowo prawokomorowej, a następnie obukomorowej

Objawy ARVC

w okresie dorastania i u młodych dorosłych:

zasłabnięcia (utraty przytomności)

najczęściej w czasie wysiłku fizycznego,

poprzedzone uczuciem kołatania serca

w EKG złośliwe arytmie komorowye

nagła śmierć sercowa

nietypowy ból w klatce piersiowej

zmniejszenie wydolności wysiłkowej

Spoczynkowy EKG

fala epsilon lub wydłużenie czasu trwania zespołu QRS ponad 110 ms w odprowadzeniach V1–V3.

opóźnienie procesu depolaryzacji w mięśniu prawej komory

jest cechą specyficzną dla ARVC

rejestruje się ją tylko u 10–30% pacjentów.

ujemne załamki T w odprowadzeniach V2–V3 (jeśli nie ma bloku prawej odnogi pęczka Hisa) u osób powyżej
12. roku życia.

obecność ujemnych załamków T również w odprowadzeniach lewokomorowych (V4–V6) koreluje z
zaawansowaniem procesu chorobowego i zajęciem lewej komory serca

Fala epsilon w EKG
Ujemne załamki T w V2-V3 w ekg spoczynkowym
elektrokardiograficzna próba wysiłkowa

u ponad połowy pacjentów z ARVC w czasie wysiłku udaje się sprowokować wystąpienie arytmii:

licznych dodatkowych pobudzeń komorowych i/lub

monomorficznego częstoskurczu komorowego o morfologii LBBB

echokardiografia

poszerzenie RV

ogniskowe lub rozlane zaburzenia kurczliwości RV,

obszary akinezy lub dyskinezy szczególnie w obrębie wolnej ściany RV

poszerzenie drogi odpływu RV

NMR

anatomiczno-morfologiczna ocena serca

regionalne ścieńczenie lub przerost ścian serca,

poszerzenie drogi odpływu prawej komory,

występowanie tkanki tłuszczowej i włóknistej w obrębie ścian serca

analiza czynnościowa

kurczliwość prawej komory (brak grubienia ściany RV w czasie skurczu)

regionalne zaburzenia kurczliwości prawej komory w postaci tętniaków

Biopsja mięśnia sercowego

badanie pomocnicze w diagnostyce ARVC

obarczone istotnym ryzykiem powikłań:

ryzyko perforacji wolnej ściany RV i tamponady serca.

zmiany mogą mieć charakter ogniskowy - ujemny wynik biopsji endomiokardialnej nie wyklucza
obecności choroby

kryterium ilościowe a nie jakościowe tkanki włóknistej i tłuszczowej

różnicowanie ARVC z:

kardiomiopatią rozstrzeniową,

zapaleniem mięśnia sercowego

Rozpoznanie

trudne!

u 80–85% chorych przebieg schorzenia jest niecharakterystyczny,

niewielkie zaburzenia kurczliwości prawej komory

Prawidłowy zapis EKG

kryteria rozpoznania ARVC

rozpoznajemy gdy spełnienie są

2 dużych kryteriów,

1 dużego i 2 małych

4 małych kryteriów

Kryteria diagnostyczne ARVC
1. zaburzenia czynnościowe i strukturalne w badaniach obrazowych

Duże kryteria:

duże powiększenie wymiarów i zmniejszenie frakcji wyrzutowej prawej komory bez lub jedynie z
niewielkim udziałem lewej komory

tętniaki umiejscowione w prawej komorze

duże odcinkowe powiększenie prawej komory

Małe kryteria:

łagodne uogólnione powiększenie prawej komory i/lub zmniejszenie frakcji wyrzutowej prawej komory
z prawidłową lewą komorą

łagodne odcinkowe poszerzenie prawej komory

odcinkowa hipokineza prawej komory

Kryteria diagnostyczne ARVC
2. Badanie histopatologiczne ściany prawej komory

Duże kryterium

zastąpienie prawidłowej tkanki mięśniowej przez tkankę tłuszczowo-włóknistą stwierdzane w biopsji
endomiokardialnej

Kryteria rozpoznania ARVC
3. zaburzenia repolaryzacji w EKG

Małe kryterium

odwrócone załamki T w prawokomorowych odprowadzeniach przedsercowych (V2, V3) u osób >12. rż.,
jeśli nie występuje u nich RBBB

Kryteria rozpoznania ARVC
4. Zaburzenia depolaryzacji i przewodzenia w EKG

Duże kryterium

fala epsilon lub tak zwane lokalne wydłużenie zespołów QRS w odprowadzeniach przedsercowych V1–
V3 (> 110 ms)

Małe kryterium

późne potencjały w EKG wysokiego wzmocnienia

Kryteria rozpoznania ARVC
5. Zaburzenia rytmu

Małe kryteria:

utrwalony lub nieutrwalony częstoskurcz komorowy o morfologii LBBB zarejestrowany w EKG, w 24-
godzinnej rejestracji EKG metodą Holtera lub podczas próby wysiłkowej

liczne dodatkowe pobudzenia komorowe (> 1000/24 h w badaniu holterowskim)

Kryteria rozpoznania ARVC
6. Wywiad rodzinny

Duże kryterium

rodzinne występowanie potwierdzone w badaniu autopsyjnym lub biopsji

Małe kryteria:

przedwczesne nagłe zgony (< 35. rż.) w rodzinie spowodowane najprawdopodobniej ARVC

rozpoznanie ARVC w rodzinie na podstawie powyższych kryteriów

Leczenie ARVC
Zalecenia ogólne

Rozpoznanie ARVC jest przeciwskazaniem do uprawiania sportu:

wyczynowego

oraz rekreacyjnych zajęć sportowych o średniej i dużej intensywności

Leczenie ARVC
zalecenia farmakologiczne i postępowanie zabiegowe

przeciwarytmiczne

farmakologiczne

sotalol,

amiodaron,

beta-adrenolityki,

zabiegowe

ablacja prądem o częstotliwości radiowej,

implantacja wszczepialnego kardiowertera-defibrylatora serca)

leczenie niewydolności serca

farmakologiczne

przeszczep serca

Kanały jonowe depolaryzujące i repolaryzujące w sercu
Wrodzony zespół długiego QT (LQTS)

Genetycznie uwarunkowane wydłużenie odstępu QT

częstość szacuje się na 1/5000–1/20 000 osób

liczne mutacje ponad 250 w białkach kodujących kanały jonowe - w tym 3 głównych

U 30-50% pacjentów z LQTS do tej pory nie udało się wykryć odpowiedzialnej za chorobę mutacji

Genetyczne mutacje w najczęstszych typach LQTS
Charakterystyka typów LQTS

LQTS1

U około 45% zdiagnozowanych „molekularnie” pacjentów z LQTS

mutacje w genie KvLQT1 (KCNQ1), który koduje białko kanału potasowego przewodzącego wolny prąd
potasowy IKs

Charakterystyka typów LQTS

LQTS2

mutacje w genie HERG (KCNH2), kodującym kanał dla szybkiego prądu potasowego IKr

odpowiadają za około 40% przypadków

Charakterystyka typów LQTS

LQTS3

mutacje genu SCN5A, kodującego białko kanału sodowego odpowiedzialnego za prąd depolaryzacji INa

Jest to 8–10% przypadków LQTS.

Postaci kliniczne LQTS

zespół Romano-Warda

99% przypadków,

dziedziczy się autosomalnie dominująco

pojedyncza mutacja w obrębie któregokolwiek z genów LQTS

Rozpoznanie ustala się stosując tzw. kryteria Schwartza

konieczne jest wystąpienie 2 kryteriów dużych i 2 małych.

Kryteria duże

skorygowany odstęp QT przewyższa 0,44 s

występują omdlenia wywołane stresem

w rodzinie występuje wydłużenie odstępu QT

Kryteria małe

naprzemienne załamki T

bradykardia

występują inne cechy świadczące o zaburzonej repolaryzacji komór

Postaci kliniczne LQTS

zespół Jarvell-Lange-Nielsen,

1% przypadków

dziedziczony autosomalnie recesywnie

charakteryzujący się występowaniem wrodzonej głuchoty

LQTS 1 lub LQTS 5

Postaci kliniczne LQTS

zespół Andersena

wydłużenie odstępu QT z charakterystyczną dużą falą U

zależne od potasu porażenie okresowe

Związane z LQTS7 (mutacja KCNJ2 w typie 1 (60%), typ 2 i 3 nieznany)

oraz występowanie cech dysmorficznych, takich jak:

niski wzrost,

hiperteloryzm,

mikrognacja

Klinodaktylia

zespół Timothy

istotne wydłużenia QT (często > 500 ms),

związane z LQTS8

syndaktylia palców rąk i/lub stóp,

zaburzenia odporności,

skłonność do hipoglikemii,

napadowa hipotermia

autyzm

WYDŁUŻENIE QT — CO TO OZNACZA?

Odstęp QT obejmuje czas trwania depolaryzacji (zespół QRS) i repolaryzacji (odcinek ST i załamek T) komórek
mięśnia sercowego

prawidłowe QTc

poniżej 440 ms u mężczyzn

poniżej 460 ms u kobiet

czas trwania fazy repolaryzacji zależy od częstości rytmu serca,

Czas trwania odstępu QT powinno się korygować względem długości cyklu serca.

wzór Bazetta:

QTc = QT/√RR.

Wydłużenie odstępu QT świadczy o spowolnieniu procesu repolaryzacji, czyli oznacza, że opóźniony jest
powrót do spoczynkowej (wyjściowej) wartości potencjału błonowego po zakończeniu depolaryzacji
kardiomiocytów.

Sprzyja to wystąpieniu wczesnych potencjałów następczych (EADs, early afterdepolarizations), które mogą
wyzwalać arytmie

Możliwe zmiany w ekg w LQTS (poza wydłużeniem odstępu QT)

zmiany kształtu załamków T

poszerzone (załamek T o szerokiej podstawie),

spłaszczone, odwrócone,

dwugarbne („wcięte”)

naprzemienności załamków T

zmiany amplitudy i/lub kształtu kolejnych załamków T

bradykardia zatokowa

bloki przedsionkowo-komorowe

migotanie przedsionków

torsade de pointes

TORSADE DE POINTES
Kryteria diagnostyczne LQTS
Prawdopodobieństwo LOTS na podstawie kryteriów

≤1 pkt — niskie prawdopodobieństwo LQTS

2–3 pkt — średnie prawdopodobieństwo LQTS

≥4 pkt — wysoce prawdopodobne rozpoznanie LQTS

Czułość kryteriów 38%!!!

Penetracja LQTS =25%!

Czynniki wpływające na występowanie objawów

LQT1

objawy występują najczęściej w czasie wysiłku (pływanie!)

LQT2

równie często w czasie wysiłku jak i w spoczynku

Głównie pod wpływem silnych emocji

głośnych dźwięków! (budzik)

LQT3

w czasie spoczynku/snu

Częściej u mężczyzn

Wyjątkowo niekorzystne rokowanie

nieskuteczne leczenie (częstość nawrotów w czasie leczenia 50%!)

niedostrzeżenie SCD u pacjenta pogrążonego we śnie

Omdlenia

omdlenia

nagła śmierć sercowa (SCD, sudden cardiac death)

Rozpoznanie pewne = genetyka

rozpoznanie bezpłatne w Gdańsku!

szczególnie ważne u nosicieli bezobjawowych!

Grupy ryzyka w LQTS
Leczenie
zalecenia ogólne

wystrzeganie się sytuacji wywołujących arytmie

unikanie głośnych bodźców dźwiękowych i zmniejszenie głośności budzika, telefonu i dzwonka do drzwi.

nie uprawiać sportów wyczynowych

przede wszystkim chorych z LQT1, w mniejszym stopniu pacjentów z podtypem 3 LQTS.

nie stosować leków wydłużających odstęp QT

lista leków wydłużających odstęp QT jest dostępna w internecie na stronie www.qtdrugs.org

Leki wydłużające czas trwania odstępu QT, których stosowanie jest przeciwwskazane u pacjentów z LQTS

Anestetyki

Enfluran, izofluran, halotan

Antybiotyki i chemioterapeutyki

Ampicylina, azytromycyna, erytromycyna, ketokonazol, klarytromycyna, metronidazol, mykonazol,
pentamidyna, trimetoprim — sulfometoksazol

Diuretyki

Indapamid

Gastrokinetyki i leki przeciwwymiotne

Cisaprid, dimenhydrynat, domperidon, metoklopramid

Leki przeciwarytmiczne

Amiodaron, chinidyna, dizopiramid, prokainamid, sotalol

Leki przeciwhistaminowe

Astemizol, difenhydramina, terfenadyna

Leki przeciwdepresyjne i psychotropowe

Amitryptylina, chloropromazyna, desipramina, doksepina, fluoksetyna, haloperidol,imipramina,
risperidon, tiorydazyna

Inne

Adrenalina, sildenafil, tamoksyfen

LECZENIE
Farmakoterapia

leki blokujące receptory beta-adrenergiczne.

preferowane są nieselektywne

nadolol

propranolol

u chorych z pochp kardioselektywne

metoprolol

atenolol

LECZENIE
Farmakoterapia

LQT2

wykazano korzystny wpływ soli potasu

LQT3

leki antyarytmiczne z grupy I według klasyfikacji Waughana-Williamsa powodują skrócenie odstępu QT

meksyletyna

flekainidu

LECZENIE
zabiegowe

Kardiostymulacja

Bradykardia

AVB

Implantacja ICD

Najskuteczniejsze leczenie!

Zespół Brugadów

Opisany przez braci Brugada (Pedro i Joseph) w 1992 roku

8 chorych bez organicznej choroby serca z nagłym zatrzymaniem krążenia w wywiadzie.

w zapisie elektrokardiograficznym (EKG)

„rzekomy” blok prawej odnogi pęczka Hisa,

któremu towarzyszy uniesienie odcinka ST w odprowadzeniach V1–V3

uwarunkowana genetycznie, dziedziczona w sposób autosomalny dominujący

charakteryzuje się

stałą lub okresową obecnością typowych i wyżej wspomnianych zmian w EKG

oraz skłonnością do komorowych zaburzeń rytmu (z migotaniem komór włącznie)

Zespół Brugadów

występowania choroby ocenia się na

5/10 000 osób w Ameryce i Europie

w Azji jest wyższa

typ 1 – 12/10 000 osób,

typ 2 i 3 – 58/1000 osób

8−krotnie częściej u mężczyzn niż u kobiet

Genetyczne uwarunkowanie zespołu Brugadów

W ok. 25% przypadków mutacja dotyczy genu kodującego podjednostkę α kanału sodowego SCN5A

tego samego, co w 3 typie LQTS, a więc w postaci LQTS o najgorszym rokowaniu

w zespole Brugadów dochodzi do osłabienia funkcji tego
genu,

a w LQTS 3 do jej wzmocnienia.

Geny, których mutacje odpowiadają za pozostałe 75% przypadków BS, nie są znane.

15% pacjentów zespół Brugadów jest wynikiem mutacji spontanicznej, a nie dziedziczenia od przodków

EKG – typy zespołu Brugadów w ekg

typ 1

wypukłe uniesienie odcinka ST ≥2 mm w co najmniej jednym odprowadzeniu z V1–V3,

po którym następuje ujemny załamek T

typ 2

siodełkowate uniesienie odcinka ST z wysokim odejściem punktu J ≥1 mm

oraz dodatnim bądź dwufazowym załamkiem T;

typ 3

siodełkowaty lub wypukły z uniesieniem
odcinka ST <1 mm.

Zmiany w ekg – okresowość!

typowe elektrokardiograficzne uniesienie odc. ST (cechy zespołu Brugadów) mogą występować tylko
okresowo.

do ujawnienia zmian w EKG może dojść

w trakcie gorączki

przy podawaniu (celowo) leków blokujących kanał sodowy

spośród leków antyarytmicznych klasy Ia i Ic najczęściej wykorzystuje się ajmalinę podawaną
dożylnie w dawce 1 mg/kg w ciągu 5 min

Zespół Brugadów – objawy kliniczne

szybkie polimorficzne częstoskurcze komorowe, prowadzące do zatrzymania krążenia i zgonu.

najczęściej w czasie snu

okresem zwiększonego ryzyka są choroby przebiegające z wysoką gorączką

Inne przyczyny uniesienia odc. ST –T w ekg spoczynkowym

•

Ostry zespół wieńcowy

•

Tętniak rozwarstwiający aorty

•

Zapalenie mięśnia sercowego

•

Guz śródpiersia uciskający prawą komorę

•

Arytmogenna dysplazja prawej komory

•

Zespół długiego QT

•

Zator tętnicy płucnej

•

Hiperkalcemia

•

Hiperkaliemia

•

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a

•

Niedobór tiaminy

•

Przedawkowanie heterocyklicznych leków przeciwdepresyjnych

•

Zatrucie kokainą

•

Wariant normy

Rozpoznanie

Zespół Brugadów można rozpoznać, jeśli zmianom w EKG towarzyszy 1 z poniższych:

udokumentowane migotanie komór lub udokumentowany polimorficzny częstoskurcz komorowy;

wyidukowany częstoskurcz komorowy w czasie programowanej stymulacji komór;

utrata przytomności

obciążający wywiad rodzinny

nagły zgon sercowy osoby poniżej 45. rż.;

zmiany typu 1 w EKG u członków rodziny;

Ocena ryzyzka zgonu w zależności od objawów i zmian w ekg w zespole Brugadów
Zespół Brugadów
Leczenie
Rodzinny wielokształtny częstoskurcz komorowy zależny od katecholamin

dziedziczona dominująco lub recesywnie,

znane 2 geny - kodujące białka biorące udział w wewnątrzkomórkowym metabolizmie wapnia -
odpowiedzialne za chorobę:

RYR2 (cardiac ryanodine receptor gene) – lokalizacja 1q (55-65% chorych)

CASQ2 (cardiac calsequestrin gene) - 1p (2% chorych)

Rodzinny wielokształtny częstoskurcz komorowy zależny od katecholamin
etiologia

Występuje z częstością 1/10000 osób

Ujawnia się zwykle w 7-9 roku życia

Rodzinny wielokształtny częstoskurcz komorowy zależny od katecholamin
objawy

charakteryzująca się omdlenia (napady VT)w odpowiedzi na

wysiłek fizyczny,

stres

10-20% chorych jako pierwszy i jedyny objaw zgon

W badaniach obrazowych nie ma uszkodzenia serca

Rodzinny wielokształtny częstoskurcz komorowy zależny od katecholamin
rokowanie i leczenie

do czynników ryzyka nagłego zgonu należą:

przebyte migotanie komór,

nagłe zgony sercowe w rodzinie

objawy w dzieciństwie

leczenie

farmakologiczne

beta – adrenolityki

flekainid

ICD

po przebytym NZK

z objawami w dzieciństwie

z dodatnim wywiadem rodzinnym

Zespół krótkiego QT (short QT syndrome QTS)

opisywany od zaledwie kilku lat

mutacje w obrębie: KCNH2 (chr.7), KCNJ2 (chr.17), KCNQ1 (chr.11)

słabo poznany

brak punktu odcięcia dla krótkiego QT

najczęściej podawana jest wartość QTc < 330 ms

obraz kliniczny:

arytmie komorowe i nagłe zgony sercowe, zwłaszcza w młodym wieku

Część przypadków nagłej śmierci noworodków można wiązać z tym zespołem

lekiem korzystnym jest chinidyna

wydłuża QT

EKG w SQTS

M

M

e

e

c

c

h

h

a

a

n

n

i

i

z

z

m

m

y

y

n

n

i

i

e

e

w

w

y

y

d

d

o

o

l

l

n

n

o

o

ś

ś

c

c

i

i

k

k

r

r

ą

ą

ż

ż

e

e

n

n

i

i

a

a

-

-

r

r

o

o

l

l

a

a

u

u

k

k

ł

ł

a

a

d

d

u

u

n

n

e

e

u

u

r

r

o

o

h

h

o

o

r

r

m

m

o

o

n

n

a

a

l

l

n

n

e

e

g

g

o

o

s

s

e

e

r

r

c

c

a

a

N

N

i

i

e

e

w

w

y

y

d

d

o

o

l

l

n

n

o

o

ś

ś

ć

ć

s

s

e

e

r

r

c

c

a

a

Zespół kliniczny spowodowany nieprawidłowością serca o charakterystycznym okresie hemodynamicznym,

któremu towarzyszy upośledzenie funkcji nerek oraz odpowiedź układu nerwowego i humoralnego.

wg Poole-Wilsona 1985

Cykl sercowy (hemodynamiczny)

Cykl sercowy (hemodynamiczny)

Przy częstotliwości rytmu serca około 70/min cykl sercowy trwa około 800 ms, z czego 1/3 przypada na skurcz
komór.

Przyspieszenie rytmu serca powoduje głównie skrócenie fazy rozkurczu i względne wydłużenie fazy skurczu,
co pogarsza napełnianie komór i wiąże się ze wzrostem oporu kompresyjnego naczyń wieńcowych.

Cykl sercowy (hemodynamiczny)

objętość końcoworozskurczowa 110-120 ml

objętość wyrzutowa

60-70 ml

objętość końcowoskurczowa

40-50 ml

Frakcja wyrzutowa lewej komory

EF (%) =

objętość wyrzutowa

/

objętość końcoworozskurczowa

x 100%

Objętość wyrzutowa

kurczliwość mięśnia sercowego

obciążenie wstępne

wielkość ciśnienia późnorozkurczowego

obciążenie następcze

wielkość ciśnienia skurczowego w komorach i aorcie lub tętnicy płucnej

częstość i miarowość rytmu serca

Cykl sercowy (hemodynamiczny)

Pojemność minutowa (rzut serca CO) - 4-5 l/min

Pojemność minutowa zależy od:

objętości wyrzutowej (pochodna kurczliwości i obciążenia następczego)

częstotliwości rytmu serca

Etiologia i patogeneza PNS

pierwotne upośledzenie kurczliwości

uszkodzenie lub utrata kardiomiocytów

zawał

zapalenie mięśnia serca

zmniejszona kurczliwość żywotnych obszarów mięśnia serca

ogłuszenie

hibernacja

Etiologia i patogeneza PNS

przeciążenie ciśnieniowe lub objętościowe komór

nadciśnienie tętnicze

wady serca

Etiologia i patogeneza PNS

upośledzenie rozkurczu

choroby osierdzia

kardiomiopatie

restrykcyjna

przerostowa

Etiologia i patogeneza PNS

tachyarytmie lub bradyarytmie

migotanie przedsionków (najczęściej)

Przyczyny przewlekłej

skurczowej

niewydolności serca

choroba niedokrwienna serca

nadciśnienie tętnicze źle kontrolowane

wady zastawkowe

kardiomiopatie

Przyczyny przewlekłej

rozkurczowej

niewydolności serca

nadciśnienie tętnicze (najczęstsza przyczyna)

choroba niedokrwienna serca

cukrzyca

kardiomiopatie

przerostowa

restrykcyjna

zaciskające zapalenie osierdzia

Niewydolność lewokomorowa

stan po zawale mięśnia sercowego

nadciśnienie tętnicze,

wada mitralna, aortalna

choroba niedokrwienna serca

Niewydolność prawokomorowa

powikłanie niewydolności lewokomorowej

pierwotne przeciążenie prawej komory

nadciśnienie płucne,

izolowana niedomykalność zastawki trójdzielnej powodująca napływ dodatkowej krwi do prawej
komory podczas rozkurczu,

zaciskające zapalenie osierdzia

zawał prawej komory

Ostra niewydolność serca

może być wywołana nagle pojawiającym się upośledzeniem kurczliwości serca

zawał serca

bądź nałożenia się dodatkowych czynników na już istniejące przeciążenie hemodynamiczne serca

częstoskurcz

objawami ciężkiej niewydolności serca są obrzęk płuc i wstrząs kardiogenny

Objawy niewydolności

lewokomorowej

Podmiotowe

duszność

kaszel

Objawy niewydolności

lewokomorowej

Przedmiotowe

trzeszczenia

rzężenia drobnobańkowe

świsty i furczenia

Objawy niewydolności

prawokomorowej

Podmiotowe

obrzęki

zlokalizowane w najniżej położonych częściach ciała

dyskomfort lub ból w jamie brzusznej

brak łaknienia

nudności i zaparcia

nykturia

Objawy niewydolności

prawokomorowej

Przedmiotowe

płyn w jamach ciała (przesięk)

powiększenie i tkliwość wątroby

stwardniała zanikowa wątroba w wieloletniej PNS

żółtaczka (niewielkiego stopnia)

nadmierne wypełnienie żył szyjnych

refluks watrobowo- szyjny

objaw Kussmaula

Objawy wspólne
prawo- i lewokomorowej

Podmiotowe

pogorszenie tolerancji wysiłku

skąpomocz (w zaawansowanej PNS)

Objawy wspólne prawo- i lewokomorowej

Przedmiotowe

bladość i ochłodzenie kończyn

objawy aktywacji współczulnej

wzmożona potliwość

sinica obwodowa

tachykardia

III ton serca (w dysfunkcji skurczowej lewej komory)

IV ton serca (w izolowanej rozkurczowej PNS)

zmniejszenie amplitudy ciśnienia tętniczego, niewielkie podwyższenie ciśnienia rozkurczowego

tętno naprzemienne lub dziwaczne

oddech Cheyne’a – Stokesa

objawy zaburzeń przepływu mózgowego

stan podgorączkowy

N

N

i

i

e

e

w

w

y

y

d

d

o

o

l

l

n

n

o

o

ś

ś

ć

ć

s

s

e

e

r

r

c

c

a

a

Istotą niewydolności serca nie są doraźne zaburzenia hemodynamiczne, lecz postępujące pogarszanie się
sprawności serca, co w konsekwencji prowadzi do

aktywacji układu współczulnego

aktywacji układu RAA

Aktywacja neurohormonalna w niewydolności serca

Dysfunkcja lewej komory prowadzi do aktywacji neurohormonalnej

systemu RAA,

układu współczulnego,

co jest korzystne w ostrej fazie.

S

S

t

t

y

y

m

m

u

u

l

l

a

a

c

c

j

j

a

a

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

e

e

r

r

g

g

i

i

c

c

z

z

n

n

a

a

Aktywacja neurohormonalna w niewydolności serca

przedłużająca się stymulacja prowadzi do stopniowego pogarszania funkcjonowania serca.

zwiększona stymulacja β-adrenergiczna jest główną przyczyną progresji niewydolności serca

uważa się, że stopień aktywacji współczulnej odwrotnie koreluje z przeżywalnością pacjentów HF

Z

Z

n

n

a

a

c

c

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

r

r

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

ó

ó

w

w

β

β

-

-

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

e

e

r

r

g

g

i

i

c

c

z

z

n

n

y

y

c

c

h

h

w

w

c

c

h

h

o

o

r

r

o

o

b

b

a

a

c

c

h

h

u

u

k

k

ł

ł

a

a

d

d

u

u

s

s

e

e

r

r

c

c

o

o

w

w

o

o

-

-

n

n

a

a

c

c

z

z

y

y

n

n

i

i

o

o

w

w

e

e

g

g

o

o

Ciągła aktywacja receptorów adrenergicznych stymuluje

remodelling lewej komory,

obumieranie komórek na drodze nekrozy lub apoptozy

retencję wody i soli.

uwalnianie reniny, a przez to i wytwarzanie angiotensyny II, co jeszcze przyspiesza progresje
niewydolności serca.

aktywacja receptorów a1 i β-adrenergicznych przez noradrenalinę może, poprzez stymulowanie
syntezy kolagenu, prowadzić do zwłóknienia oraz przerostu mięśnia sercowego.

Aktywacja układu współczulnego i RAA w przewlekłej niewydolności serca

Rodzina receptorów adrenergicznych

receptory alfa

α1A, α1B, α1D

α2A, α2B, α2C

receptory beta - 3 podtypy

β1

Β2

β3

Receptory adrenergiczne

Receptory alfa-1-adrenergiczne

występują w mięśniach gładkich

naczyń krwionośnych

różnego typu zwieraczy

przewodu pokarmowego

dróg oddechowych

nasieniowodów

Pobudzenie tego typu receptorów powoduje skurcz, co prowadzi do wzrostu oporów obwodowych i wzrostu
ciśnienia krwi

Receptory alfa-2-adrenergiczne

Umiejscowione są głównie presynaptycznie

pobudzenie ich hamuje uwalnianie substancji przekaźnikowej, np. noradrenaliny, do przestrzeni synaptycznej

Receptory beta 1

wyodrębnione przez Landsa w 1967 roku

zlokalizowane są

sercu

(beta1:beta2= 4:1)

w układzie bodźcoprzewodzącym

mięśniówce przedsionków i komór

nerkach

w aparacie przykłębuszkowym

drogach oddechowych

(beta1:beta2= 1:4)

na powierzchni gruczołów śluzowych

pneumocytach typu I i II

Receptory beta w sercu

W sercu obecne są poza receptorami β1 również receptory adrenergiczne β2 i β3 (β-AR).

Agonistami β-AR w sercu są mediatory układu współczulnego:

noradrenalina – uwalniana z zakończeń nerwowych sercowych włókien współczulnych

adrenalina – uwalniana z rdzenia nadnerczy.

Największe powinowactwo do agonistów mają jednak β1-AR, a najmniejsze β3-AR (około 100 x mniejsze)

Przy umiarkowanym poziomie aktywacji współczulnej, pobudzeniu ulegają głównie β1-AR a dwa pozostałe β-
AR włączają się dopiero w stanach znacznie zwiększonej aktywacji współczulnej

Receptory beta 1 –
efekty pobudzania w sercu

działanie

chronotropowe

dodatnie - zwiększenie częstości akcji serca

efekt

inotropowy

dodatni - wzrost kurczliwości mięśnia sercowego

efekt

dromo- i batmotropowy

dodatni - zwiększenie przewodnictwa i automatyzmu układu

bodźcoprzewodzącego

działanie

luzitropowe

- oraz wydłużenie czasu rozkurczu

Receptory beta 1 –
efekty pobudzenia w nerkach i drogach oddechowych

zwiększenie wydzielania reniny

Receptory beta 2 - lokalizacja

Drogi oddechowe

gęstość receptorów beta 2 wzrasta w kolejnych generacjach drzewa oskrzelowego, osiągając maksimum
w obrębie pęcherzyków płucnych

sercu,

mięśniówce macicy,

ścianie naczyń krwionośnych,

żołądku, jelitach, wątrobie

pęcherzu moczowym.

Receptory beta 3

odkryte w 1990 roku przez holenderskiego badacza Johana Zaagsmę i jego współpracowników

zlokalizowane są

tkanka tłuszczowa

główne miejsce, stąd receptory te często nazywane są adipocytarnymi.

serce

mięśniówka macicy

Receptory beta 3 – efekty pobudznia

tkanka tłuszczowa

nasilenie procesów lipolizy i termogenezy

serce - rola nie jest jeszcze do końca poznana.

działanie inotropowe ujemne

wzmożona ekspresja w niewydolnym mięśniu sercowym

bezpośredni wpływ rozkurczający na śródbłonek tętnic wieńcowych

mięśniówka macicy

tokolityczne

Naturalnymi transmitterami dla przekaźnictwa β3–adrenergicznego są w jednakowym stopniu

adrenalina i

noradrenalina.

Receptory sprzężone z białkami G są glikoproteinami

W strukturze receptorów adrenergicznych sprzężonych z białkami G występuje charakterystycznych

siedem

hydrofobowych

obszarów o długości 20-25 aminokwasów przedzielonych

ośmioma

hydrofilowymi regionami

o zmiennej długości.

Każda z hydrofobowych domen tworzy

transmembranową helisę

, a łączące je

hydrofilowe pętle

wystają po

stronie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowej.

Region N-końcowy receptora znajduje się po stronie zewnątrzkomórkowej błony, natomiast fragment C-

końcowy po stronie cytoplazmatycznej.

Białka regulacyjne G

rodzina białek związanych z wewnętrzną częścią błony komórkowej

nazwa pochodzi od zdolności do wiązania i hydrolizowania trójfosforanu guanozyny (GTP).

odpowiedzialne za przeniesienie odebranego przez receptor sygnału przez błonę komórkową

i aktywację (

białko Gs-pobudzające

)

lub hamowanie (

białko Gi-hamujące

) enzymów produkujących cząsteczki tzw. przekaźnika wtórnego.

Układ białka G

Aktywacja receptora a1

prowadzi do wzrostu stężenia wapnia cytoplazmatycznego poprzez zwiększenie

stężenia IP3 i DAG

aktywacja receptora a2

dochodzi do hamowania aktywności cyklazy adenylowej i zmniejszenia stężenia

cAMP.

Przeciwny efekt obserwuje się w przypadku wszystkich receptorów

beta- adrenergicznych

— cyklaza

adenylowa jest aktywowana w wyniku czego wzrasta stężenie cAMP

Jak działa układ białka G –

aktywacja receptorów adrenergicznych

Białko G składa się z 3 podjednostek: αβγ.

nieaktywne białko G związane z GDP

przyłączenie agonisty receptora i aktywacja receptora

zamiana GDP na GTP w białku G

rozpad struktury białka G na:

podjednostkę βγ

i aktywną podjednostkę α-GTP, która odłącza się od kompleksu

Rodzaj aktywowanego przekaźnika i uruchomionego szlaku zależy od rodzaju białka:

białko Gs

stymuluje cyklazę adenylową i przyczynia się do zwiększenia stężenia cAMP,

białko Gi/o

hamuje aktywność cyklazy adenylowej i obniża stężenie cyklicznego AMP

białko Gq/11

uruchamia szlak fosfolipazy C (PLC) i stymuluje metabolizm fosfoinozytydów,

Przekaz informacji przez białko G

Gdy z częścią receptora wystającą na zewnątrz komórki wiąże się ligand – hormon, lek, białko – receptor
zmienia swój kształt

Zmiana kształtu powoduje, że jego część wyeksponowana do wnętrza komórki wiąże się z białkiem G,
aktywując je.

Białko G ulega wówczas rozpadowi na podjednostki.

Jedna z nich, podjednostka α, uruchamia kaskadę sygnałową we wnętrzu komórki,

a całe białko G odrywa się od receptora.

Gdy przy receptorze robi się miejsce, łączy się z nim kolejne białko G, które ulega aktywacji, rozpadowi na
podjednostki….

Jeden receptor może przejść wiele takich cyklów, zanim opuści go związany z nim ligand.

Aktywacja białka G
Schemat przekazywania sygnału przez receptory beta w sercu

S

S

z

z

l

l

a

a

k

k

i

i

a

a

k

k

t

t

y

y

w

w

o

o

w

w

a

a

n

n

e

e

s

s

t

t

y

y

m

m

u

u

l

l

a

a

c

c

j

j

ą

ą

r

r

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

ó

ó

w

w

β

β

1

1

-

-

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

e

e

r

r

g

g

i

i

c

c

z

z

n

n

y

y

c

c

h

h

Aktywacja β1-AR powoduje aktywację cyklazy adenylowej,

Efektem czynnościowym fosforylacji białek przez kinazę białkową A (ang. protein kinase A, PKA) w sercu jest

przyspieszenie akcji serca

przewodzenia p-k,

wzrost siły skurczu

przyspieszenie rozkurczu mięśnia sercowego

oraz szereg efektów metabolicznych.

S

S

z

z

l

l

a

a

k

k

i

i

a

a

k

k

t

t

y

y

w

w

o

o

w

w

a

a

n

n

e

e

s

s

t

t

y

y

m

m

u

u

l

l

a

a

c

c

j

j

ą

ą

r

r

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

ó

ó

w

w

β

β

2

2

-

-

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

e

e

r

r

g

g

i

i

c

c

z

z

n

n

y

y

c

c

h

h

W sercu ssaków i w sercu ludzkim β2-AR są sprzężone zarówno z białkiem Gs, jak i z białkiem Gi.

Jednakże w zdrowym sercu w sumie przewagę mają efekty związane z aktywacją cyklazy adenylowej i
zwiększoną produkcją cAMP.

B

B

e

e

t

t

a

a

-

-

b

b

l

l

o

o

k

k

e

e

r

r

y

y

Przewlekła zwiększona stymulacja sercowego układu β-adrenergicznego jak wykazano jest toksyczna dla serca i

może leżeć u podstaw patogenezy zastoinowej niewydolności serca.

Stosowanie leków blokujących te receptory w leczeniu osób po zawale zmniejsza ich śmiertelność i ryzyko

wystąpienia powtórnego zawału.

Wykazano, że blokada receptora β1-adrenergicznego w znacznym stopniu poprawia stan pacjenta z niewydolnością

serca.

Leki beta - adrenolityczne

Nieselektywne - są to leki blokujące zarówno receptory beta-1 jak i beta-2 adrenergiczne.

Selektywne - są to leki oddziałujące tylko na receptory beta-1 adrenergiczne.

blokujące zarówno receptory beta, jak i alfa

Karwedilol - blokuje zarówno receptory beta 1 jak i receptory beta 2. Jego dodatkowe działanie
polega na blokowaniu receptora alfa 1.

Beta-blokery mające dodatkowe działania poza blokowaniem receptorów beta

nebiwolol, selektywny beta-bloker o dodatkowym działaniu rozkurczającym naczynia poprzez
zwiększanie stężenia tlenku azotu

Układ RAA

U

U

k

k

ł

ł

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

i

i

n

n

a

a

-

-

a

a

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

a

a

-

-

a

a

l

l

d

d

o

o

s

s

t

t

e

e

r

r

o

o

n

n

(

(

R

R

A

A

A

A

S

S

)

)

renina

gen reniny znajduje się na chromosomie 1q

produkowany w aparacie przykłębuszkowym nerki;

syntetyzowana w postaci preproreniny ulegającej przekształceniu do proreniny, a następnie do
reniny,

przechowywana w ziarnistościach

bodźcami do uwalniania reniny przez nerki są:

spadek ciśnienia w tętniczkach nerkowych,
zmniejszenie ładunku jonów sodowych i chlorkowych w okolicy plamki

gęstej

aktywacja receptora adrenergicznego β1 na komórkach aparatu

przykłębuszkowego.

U

U

k

k

ł

ł

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

i

i

n

n

a

a

-

-

a

a

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

a

a

-

-

a

a

l

l

d

d

o

o

s

s

t

t

e

e

r

r

o

o

n

n

(

(

R

R

A

A

A

A

S

S

)

)

renina

enzym o działaniu peptydazowym,

przekształca angiotensynogen w dekapeptyd angiotensynę (1-10), zwaną angiotensyną I

aktywność reniny we krwi najczęściej oznacza się, stosując metodę radioimmunologiczną i wyraża jako
tzw.

aktywność reninową osocza (ARO)

określającą ilość angiotensyny I wytworzonej pod wpływem

reniny w danej objętości osocza w ciągu godziny (ng/ml/h)

U

U

k

k

ł

ł

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

i

i

n

n

a

a

-

-

a

a

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

a

a

-

-

a

a

l

l

d

d

o

o

s

s

t

t

e

e

r

r

o

o

n

n

(

(

R

R

A

A

A

A

S

S

)

)

Konwertaza angiotensyny (ACE)

enzym przekształcający (konwertujący) angiotensynę (1-10) w angiotensynę (1-8), zwaną
angiotensyną II

rozkłada także bradykininę.

ACE jest związana (produkowana) z komórkami śródbłonka w całym układzie krążenia, ale jej
aktywność jest największa w krążeniu płucnym

U

U

k

k

ł

ł

a

a

d

d

r

r

e

e

n

n

i

i

n

n

a

a

-

-

a

a

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

a

a

-

-

a

a

l

l

d

d

o

o

s

s

t

t

e

e

r

r

o

o

n

n

(

(

R

R

A

A

A

A

S

S

)

)

angiotensyna II

substancja czynna, uwalniana do krwi lub produkowana lokalnie,

najlepiej poznane są receptory AT1 i AT2,

w różnych narządach sklonowano także receptory AT3 i AT4;

fizjologicznie stymuluje głównie receptory AT1,

u osób z niewydolnością serca lub nadciśnieniem tętniczym stymuluje także receptory AT2

aldosteron

hormon produkowany przez korę nadnerczy w wyniku stymulacji receptora AT1,

działa z kolei poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych

rodzaje układu RAA

systemowy RAA

zależny głównie od aktywności aparatu przykłębuszkowego w nerkach

tkankowe układy RAA

Angiotensynogen i renina mają długi okres półtrwania

są klasycznymi czynnikami osoczowymi

Angiotensyna I i angiotensyna II mają krótki okres półtrwania

działają głównie lokalnie, w miejscu powstania

Tkanowe układy RAAS

lokalizacja:

w mięśniu serca,

ścianie naczyń krwionośnych,

nerkach,

nadnerczach

ośrodkowym układzie nerwowym.

działanie

autokrynne

- wytworzona lokalnie angiotensyna II pobudza receptory tej samej komórki

parakrynne

- wytworzona lokalnie angiotensyna II pobudza receptory komórek sąsiadujących

Układ renina-angiotensyna-aldosteron
udział w patogenezie chorób:

układu sercowo-naczyniowego:

zawał mięśnia sercowego

kardiomiopatie

migotanie przedsionków

niewydolność serca

miażdżyca

regulacji fibrynolizy

angiotensyna II zwiększa poziom PAI-1, (główny inhibitorem fibrynolizy)

produkcja zarówno konwertazy angiotensyny i angiotensyny jest znacznie zwiększona miejscu, w
którym naczynie jest uszkodzone.

pełni rolę prozapalną

Angiotensynogen

Produkowany w obrębie

hepatocytów wątroby,

mózgu,

serca,

ścian naczyń,

nerkach

nadnerczach.

Gen angiotensynogenu zlokalizowany jest na chromosomie 1q

ACEI – enzym konwertujący

jest karboksydazą dipeptydową

2 formy

w tkankach w formie związanej z błoną komórkową

lub w formie rozpuszczalnej w płynach ustrojowych

ACEI – enzym konwertujący

Konwertuje

angiotensynę I do angiotensyny II - odcina od angiotensyny I C-końcowy dipeptyd His-Leu

angiotensyny 2-10 w angiotensynę III

bradykininę odcinając z jej C-końca dipeptyd Phe-Arg, co prowadzi do jej inaktywacji

bradykinina

stymuluje produkcję i wydzielanie prostacykliny, tlenku azotu i
tkankowego aktywatora plazminogenu t-PA,

ma działanie wazorelaksacyjne, przeciwpłytkowe i fibrynolityczne

ACEI – enzym konwertujący

Gen kodujący enzym znajduje się na chromosomie 17

opisano polimorfizm insercja/delecja (I/D) w obrębie intronu 16 genu enzymu przekształcającego,
prowadzący do powstania trzech genotypów: DD, ID oraz II.

W badaniach klinicznych wykazano, że genotyp DD enzymu przekształcającego angiotensynę jest
nie tylko związany z większą aktywnością omawianego enzymu w osoczu, ale również między
innymi z większym ryzykiem:

zawału mięśnia serca

nagłego zgonu sercowego

restenozy po angioplastyce tętnic wieńcowych

Z

Z

n

n

a

a

c

c

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

A

A

C

C

E

E

w

w

c

c

h

h

o

o

r

r

o

o

b

b

a

a

c

c

h

h

u

u

k

k

ł

ł

a

a

d

d

u

u

k

k

r

r

ą

ą

ż

ż

e

e

n

n

i

i

a

a

Niekorzystny wpływ tego enzymu na układ krążenia jest dwojaki:

generuje powstawanie angiotensyny II,

hydrolizuje bradykininę do nieaktywnych związków

znosi jej korzystny wpływ na śródbłonek naczyń

W

W

p

p

ł

ł

y

y

w

w

z

z

w

w

i

i

ę

ę

k

k

s

s

z

z

o

o

n

n

e

e

j

j

a

a

k

k

t

t

y

y

w

w

n

n

o

o

ś

ś

c

c

i

i

A

A

C

C

E

E

w

w

c

c

h

h

o

o

r

r

o

o

b

b

a

a

c

c

h

h

u

u

k

k

ł

ł

a

a

d

d

u

u

k

k

r

r

ą

ą

ż

ż

e

e

n

n

i

i

a

a

zwiększonego wytwarzania angiotensyny II i w konsekwencji rozwój miażdżycy

zwiększona ekspresja ACE w makrofagach kumulujących się wokół osłabionej pokrywy włóknistej blaszki -
może przyczyniać się do zmniejszenia stabilności blaszki miażdżycowej.

zwiększona ekspresja i aktywność ACE w obrębie „przerośniętej” komory serca oraz w komórkach mięśni
gładkich naczyń szczurów z uszkodzonym śródbłonkiem.

ACEI

Stosowanie inhibitorów ACE (ACE-I) przyczynia się do

zmniejszenia częstości występowania incydentów niedokrwiennych

poprawy funkcjonowania śródbłonka.

zmniejszają poziom angiotensyny II, a przez to i endoteliny,

obniżają stężenie reaktywnych form tlenu

zwiększają stężenie rozszerzającej naczynia i stymulującej produkcję i uwalnianie NO bradykininy i
prostacykliny.

zmniejszenie hipertrofii serca,

zapobiega rozszerzeniu i remodelingowi komory po przebytym zawale mięśnia sercowego.

Angiotensyna I

peptyd o słabych właściwościach biologicznych,

powstaje wskutek działania reniny na produkowany w wątrobie

A

A

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

y

y

5 postaci angiotensyn powstających z jednego substratu, tj. angiotensynogenu.

Angiotensyny różnią się liczbą aminokwasów, rodzajem receptora oraz aktywnością biologiczną.

A

A

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

y

y

renina katalizuje powstawanie dekapeptydu angiotensyny I

angiotensyna I jest substratem dla względnie nieswoistej proteazy – konwertazy, katalizującej przekształcenie
angiotensyny I w oktapeptyd – angiotensynę II (ang-1-8).

A

A

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

y

y

angiotensyna II może powstać

z angiotensyny I pod wpływem proteazy – konwertazy, katalizującej przekształcenie angiotensyny I w
oktapeptyd – angiotensynę II

z angiotensyny I pod wpływem enzymów: chymaza, tonina lub katepsyna G

bezpośrednio z angiotensynogenu pod wpływem enzymów :

tonina,

elastaza,

katepsyna G

enzym generujący angiotensynę II wrażliwy na chymostatynę – CAGE

A

A

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

y

y

z angiotensyny II może powstać

peptyd siedmioaminokwasowy – angiotensyna-2-8 (tzw. angiotensyna III), poprzez odcięcie kwasu
asparaginowego od oktapeptydu

lub sześcioaminokwasowy – angiotensyna-3-8 (zwana również angiotensyną IV).

angiotensyna V określano jako angiotensyna-1-7

polipeptyd złożony z 7 N-końcowych aminokwasów angiotensyny I i II,

Angiotensyna I (1-10 )

nie wydaje się posiadać znaczenia fizjologicznego,

ulega szybkiemu przekształceniu przez ACE

Rola angiotensyny II w powstawaniu nadciśnienia tętniczego

skurcz naczyń i upośledzenie rozkurczu

bezpośrednia stymulacja komórek mięśni gładkich

zwiększa wydzielanie substancji kurczących naczynia:

endoteliny i amin katecholowych (w naczyniach)

wazopresyny (z przysadki mózgowej)

zmniejsza biodostępność tlenku azotu (NO),

upośledzenie wazodylatacji naczyń

zwiększenie objętości wewnątrznaczyniowej wody

na drodze stymulacji kory nadnerczy do wydzielania aldosteronu

dodatnie działanie ino- i batmotropowe na serce

Angiotensyna II a układ hemostazy

aktywacja procesów zakrzepowych

zwiększa ekspresję czynnika tkankowego (TF)

nasila aktywację i agregację płytek krwi

pobudzenie receptorów płytkowych dla angiotensyny II prowadzi do:

uwrażliwienia płytek na działanie płytkowych agonistów

stymuluje uwalnianie płytkowych czynników

hamowanie układu fibrynolitycznego

nasila syntezę PAI – 1

Angiotensyna II a miażdzyca

Nasila powstwanie oxLDL

zwiększanie w makrofagach aktywności oksydazy NADPH wytwarzającej reaktywne formy tlenu

nasilenie lipoksygenazy

oxLDL

osłabiają tworzenie NO,

zwiększają wytwarzanie reaktywnych form tlenowych

indukują syntezę endotelialnych cząstek adhezyjnych (E-selektyna, ICAM-1, VCAM-1), chemokin i
czynników wzrostu mięśni gładkich

nasila przyswajanie cząstek ox-LDL przez makrofagi i tworzenie komórek piankowatych poprzez regulację „w
górę” receptorów:

LOX-1 (lectin-like oxidized LDL receptor) zlokalizowanego na powierzchni komórek śródbłonka i
makrofagów

„scavenger” (CD36)

Funkcje angiotensyny II

pobudza pragnienie i wydzielanie wazopresyny

w naczyniach krwionośnych nasila uwalnianie związków o działaniu

wazopresyjnym (endotelina, aminy katecholowe)

naczyniorozkurczowym (bradykinina, tlenek azotu, prostacyklina),

w sercu – przerost kardiomiocytów i uwalnianie czynników wzrostowych (powodujących włóknienie mięśnia
sercowego

w nerkach – uwalnianie cytokin (TGF-b), chemokin (MCP-1) i czynników wzrostowych (PDGF)

Angiotensyna II

Angiotensyna II

Angiotensyna III (2-8)

podobne właściwości co angiotensyna1-8

stymuluje

syntezę aldosteronu

procesy zapalne (poprzez receptor AT2)

receptor angiotensyny 2-8

różni się od receptora AT1 i AT2.

struktura nie została jeszcze dokładnie poznana

Angiotensyna IV 3-8

może powstać

z angiotensyny III

lub z angiotensyny II.

Działanie:

poprzez AT1 wywołuje skurcz naczyń,

Poprzez receptor AT4 wzmaga produkcję PAI-1

Angiotensyna V 1-7

działanie przeciwstawne do występującego po podaniu angiotensyny II

pobudza syntezę i uwalnianie wazodylatacyjnie działających prostaglandyn

potęguje efekty metaboliczne bradykininy i wzmaga syntezę tlenku azotu

działanie angiotensyny-1-7 na komórki jest pośredniczone przez receptory inne niż AT2

angiotensyna-1-7 ulega rozłożeniu przez enzym konwertujący

Receptory dla angiotensyny II

Receptorami dla angiotensyny II są receptor AT

1

i AT

2

obecność receptorów zarówno AT

1

jak i AT

2

stwierdzono w:

sercu

naczyniach krwionośnych,

płucach

nerkach

nadnerczach

wątrobie

ośrodkowym układzie nerwowym

powierzchni monocytów/makrofagów.

ekspresja receptorów AT

2

jest najbardziej zaznaczona w życiu płodowym

stymulacja receptorów AT1 vs AT2

Efekt pobudzenia AT 1 i AT2 jest antagonistyczny

AT1

humoralne

hormonalne

sercowo-naczyniowe

nerkowe

i nerwowe

AT2

działanie antyproliferacyjne

proapoptotyczne

wazodylatacja

działanie natriuretyczne

R

R

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

y

y

d

d

l

l

a

a

a

a

n

n

g

g

i

i

o

o

t

t

e

e

n

n

s

s

y

y

n

n

y

y

I

I

I

I

–

–

r

r

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

A

A

T

T

1

1

sprzężony jest z białkiem Gq,

jego aktywacja prowadzi do stymulacji fosfolipazy C (PLC), a w dalszej kolejności do powstania IP3 i
DAG, mobilizacji Ca

2+

i aktywacji białkowej kinazy C (PKC).

R

R

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

A

A

T

T

2

2

Receptor AT2 jest sprzężony z fosfatazą fosfotyrozynową i występuje głównie w przedsionkach serca,
nabłonku naczyń, macicy, jajnikach, rdzeniu nadnerczy, trzustce oraz komorach.

R

R

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

A

A

T

T

2

2

Ekspresja receptorów dla angiotensyny II w sercu jest odmienna:

receptory AT1 są w przewadze w zdrowym sercu,

w przypadku niewydolności receptory AT1 ulegają regulacji w dół, podczas gdy ekspresja AT2 wzrasta

R

R

e

e

c

c

e

e

p

p

t

t

o

o

r

r

A

A

T

T

2

2

Lokalizacja AT2 w śródmiąższowych fibroblastach w sercu może sugerować, że może on także brać udział w
rozwoju stanu zapalnego i zwłóknienia.

Pomimo, iż zazwyczaj receptorowi AT2 przypisuje się pośredniczenie w działaniu antyproliferacyjnym

i w

procesie apoptozy, może on również odgrywać rolę w stymulacji wzrostu komórkowego.

Alodsteron – miejsce syntezy

Aldosteron jest hormonem produkowanym przez

warstwę kłębkowatą kory nadnerczy,

komórki śródbłonka

mięśniówki gładkiej ściany naczyniowej (VSMC).

Zwiększenie syntezy aldosteronu

zachodzi pod wpływem takich czynników jak:

angiotensyna II

jony potasu

hormon adrenokortykotropowy

endotelina 1

spadek objętości krążącej krwi

obniżenie ciśnienia tętniczego

zmniejszenie stężenia sodu (Na) w organizmie

wzrost aktywności układu adrenergicznego

Działanie aldosteronu
Alodsteron
Adosteron

Swoje działanie hormon może wywierać

bezpośrednio

poprzez receptory mineralokortykoidowe (MR)

receptory błonowe ?

pośrednio

na drodze zwiększania ekspresji

angiotensyny II

endoteliny

aktywacji COX-2,

zwiększenia stresu oksydacyjnego

Aldosteron – receptor MR

swoisty receptor cyto-plazmatyczny,

należy do nadrodziny receptorów jądrowych.

zlokalizowany

w sercu,

naczyniach krwionośnych

mózgu

receptory jądro-we po przyłączeniu hormonu, przemieszczają się z cytoplazmy do jądra komórkowego i
tam regulują procesy transkrypcji genów i translacji, prowadzą-ce do syntezy białek odpowiedzialnych
za transport jonów przez błonę komórkową

mechanizm związany z akty-wacją receptora MR określany jest mianem genomowego.

teoria dotycząca pozagenomowego mechanizmu działania aldosteronu

niegenomowe działa-nie aldosteronu ujawnia się już w ciągu kilku minut

nie jest blokowane przez klasycznych antagonistów receptora MR - spironolakton, kanrenon i eplerenon

wynika z obecności recep-tora błonowego

o właściwościach odmiennych od znanych receptorów jądrowych.

nie zidentyfi-kowano jeszcze receptora błonowego,

wykazano, że jego aktywacja prowadzi do uruchomienia szlaków wtórnych przekaźników, takich jak:
diacyloglicerol i trifosforan inozytolu, jony wapnia oraz cykliczny adenozynomonofosforan

Aldosteron w niewydolności serca

synteza aldosteronu jest zwiększona w sercach pacjentów z niewydolnością serca

jego stężenie jest 10 razy większe niż w stanach fizjologicznych

korelacja między podwyższonym stężeniem aldostero-nu w osoczu a wzrostem śmiertelności wśród
pacjentów z niewydolnością serca (badanie Consensus)

Działanie aldosteronu w układzie sercowo - naczyniowym

aldosteron ak-tywuje receptory MR umiejscowione w sercu, naczyniach krwionośnych i mózgu, a efektem
biologicznym pobudze-nia tych receptorów jest m.in.

włóknienie serca i naczyń krwionośnych,

działanie proarytmiczne,

prozapalne,

uszko-dzenie śródbłonka naczyniowego

potwierdzano skuteczność blokady receptora MR w ograniczaniu niekorzystnych działań aldostero-nu w
obrębie układu sercowo-naczyniowego

nieselektywny an-tagonista - spironolakton,

Selektywny antagonista - eplere-non

Działanie aldosteronu - włóknienie

miejscowe wytwarzanie aldosteronu bez-pośrednio pobudza wytwarzanie kolagenu typu I i III przez
fibroblasty

włóknienie może być konsekwencją

zapalenia i uszkodze-nia ścian naczyń,

ogniskowej martwicy okołonaczyniowej

zwiększenia przez aldosteron

syntezy endoteliny,

syntezy in-hibitora aktywatora plazminogenu (PAI-1),

syntezy konwertazy an-giotensyny (ACE),

ekspresji receptorów AT1

re-ceptorów bradykininy B

2

Aldosteron a tlenek azotu

Badania eksperymentalne i kliniczne dowodzą, że zarówno ostra, jak i chroniczna infuzja aldosteronu

upośledza ekspresję śródbłonkowej syntazy NO (eNOS)

zwiększa degra-dacja NO

Aldosteron a stres oksydacyjny

Jak wykazują badania eksperymentalne, osłabionej przez aldosteron aktywności NO towarzyszy zwykle
nasilenie stresu oksydacyjnego wyrażone zwiększoną ekspresją oksydazy NADPH - głównego źródła
reaktywnych form tlenu (ROS).

Zależność między aldosteronem a układem współczulnym

Nadciśnienie tętnicze monogenowe

Kategorie nadciśnienia tętniczego

Przyczyny nadciśnienia tętniczego
Nadciśnienie monogenowe

Rodzinny hiperaldosteronizm

Zespół Liddle’a

Zespół Gordona

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów

Zespół Liddle’a

Opisany po raz pierwszy przez Liddle’a i wsp. w 1963r.

Liddle GW, Bledsoa T, Coppage WS. A familial renal disorder simulating primery aldosteronism but with
negligible aldosterone secretion. Trans Assoc Am Physician 1963; 76:199-213

16 –latka (również brat i siostra 14 i 19 lat)

z ciężkim nadciśnieniem tętniczym i zasadowicą metaboliczną

Z niskim poziomem aldosteronu mimo stosowania diety niskosodowej

Z wysokim stosunkiem stężenia sodu/potasu w ślinie i pocie

Prawidłowe stężenia metabolitów glikokortykosteroidów w moczu

Bez efektu leczenie spironolaktonem

Losy probanda
Przyczyna zespołu Liddle’a
Przyczyna

mutacje w obrębie genu nabłonkowego kanału sodowego (ENaC)

Mutacje w genie 16

SCNN1G

gen jest położony na ramieniu krótkim (p) chromosomu 16

w pozycji 12.

SCNN1B

gen jest położony na ramieniu krótkim (p) chromosomu 16

w pozycji 12.2 -12.1.

Jaka jest normalna funkcja genu SCNN1?

Kodowanie podjednostki

gamma (SCNN1G)

beta (SCNN1B)

Genetyczne zmiany w zespole Liddle’a

w obrębie C- końcowego fragmentu wewnątrzcytoplazmatycznego ENaC bogatego w prolinę (PY (Pro-Pro-x-
Tyr))

miejsca wiązania ENaC do ligazy (E3) Nedd4

lub delecje C-końcowego fragmentu podjednostki β lub γ

Jak działa ligaza Nedd4 w warunkach prawidłowych?
Skutek mutacji genów SCNN1

zwiększona ekspresja nabłonkowych kanałów sodowych (ENaC) na powierzchni komórek poprzez
zmniejszenie ich łączenia z ligazą Nedd4-2 (E3)

Defekt wiązania ligazy w zespole Liddle’a
Wzmożona ilość ENaC
Efekt metaboliczny mutacji
Epidemiologia

Rozpoznawana zwykle w młodym wieku

Czasami u osób po 50 r.ż. !

Około rodzin opisanych na świecie (2000r.)

Obraz kliniczny

nadciśnienie tętnicze

u osób młodych, często w dzieciństwie

powikłania sercowo – naczyniowe nadciśnienia

Rozpoznanie

wywiad

Dodatni wywiad rodzinny !

(HA w młodym wieku u członków rodziny)

badania dodatkowe

Mała aktywność reninowa osocza

Zmniejszone stężenie aldosteronu w osoczu

Zasadowica metaboliczna

Hipokaliemia – nie u wszystkich!

Rozpoznanie

kliniczne

gwałtowana poprawa po zastosowaniu amiloridu/triamterenu

normotensja

normokaliemia

brak reakcji na leczenie spironolaktonem

u osób starszych – osłabienie mięśni!

genetyczne

potwierdzenie mutacji w genie kodującym jednostkę gamma lub beta ENaC

po potwierdzeniu poddać badaniom przesiewowym również członków rodziny

wykluczenie wtórnych przyczyn nadciśnienia tętniczego

Różnicowanie

pierwotny hiperaldostrenonizm (głownie GRA)

wtórne przyczyny nadciśnienia tętniczego:

zespół Cushinga

zespół Conna

Leczenie
Pierwotny hiperaldosteronizm (PA)

Po raz pierwszy opisany przez Conna (stad nazwa zespół Conna) w 1955 r.

Conn opisał zespół spowodowany nadmiernym wydzielaniem aldosteronu przez gruczolaka nadnercza
(30-50% przypadków PA)

Inne przyczyny:

jednostronny lub obustronny rozrost kory nadnerczy (>50%)

Hiperaldostronizm rodzinny

nowotwory:

rak kory nadnerczy

ektopowe wydzielanie aldosteronu przez tkankę nowotoworwą

Synteza aldosteronu
Aldosteron – rola

działanie ujawnia się przede wszystkim w obrębie nerek (cewkę dalsza nefronów)

regulacja gospodarki wodno-elektrolitowej

zwiększanie zwrotnego wchłaniania sodu

wzrost wydzielanie do światła cewki jonów potasowych i wodorowych

Aldosteron – miejsce działania
Epidemiologia
pierwotny hiperaldosteronizm

Pierwotny hiperaldosteronizm jest najczęstszą przyczyną wtórnej postaci nadciśnienia tętniczego

dotyczy około 5%-15% chorych na nadciśnienie tętnicze

Hiperaldosteronizm rodzinny

Hiperaldosteronizm rodzinny typ 1

Hiperaldosteronizm rodzinny typ 2

Hiperaldosteronizm rodzinny typ 3

Epidemiologia rodzinnego hiperaldosteronizmu

Typ1

Bardzo rzadka choroba

<1% chorych z pierwotnym hiperaldosteronizmem

Typ 2

Częstszy niż typ 1

Występuje u około 3% ludzi z pierwotnym hiperaldosteronizmem

Typ3

Dotychczas wykazany tylko u 1 rodziny

Jakie geny są związane

z hiperaldosteronizmem rodzinnym typu 1?

Typ 1 jest spowodowany nieprawidłowym połączeniem dwóch podobnych genów CYP11B1 i CYP11B2

Nazwa genu CYP11B1 to:

cytochrom P450, rodzina 11, podrodzina B, polipeptyd 1

Nazwa genu CYP11B2 to:

cytochrom P450, rodzina 11, podrodzina B, polipeptyd 2

Oba geny należą do tej samej rodziny nazywanych CYP (cytochrome P450)

Jaka jest normalna funkcja tych genów?

Gen CYP11B1 odpowiada za kodowanie enzymu 11-beta-hydroxylazy.

Enzym uczestniczy w produkcji hormonów: kortyzolu i kotykosteronu

Gen CYP11B2 koduje inny enzym - syntazę aldosteronową

Odpowiada za produkcję aldosteronu

Lokalizacja genów CYP11B

Oba geny są zlokalizowane blisko siebie na chromosomie 8

CYP11B1 jest położony na ramieniu długim (q) chromosomu 8 w pozycji 21.

CYP11B2 jest położony na ramieniu długim (q) chromosomu 8 w pozycji 21-22

Chimeryczny gen w rodzinnym hiperaldosteronizmie typu 1

U ludzi z rodzinną postacią hiperaldosteronizmu typu 1 dochodzi do połączenia obu genów CYP11B z
wytworzeniem genu chimerycznego.

ACTH i odpowiedź na glikokortykosteroidy

Regulatorowy region genu CYP11B1 jest w normalnych warunkach aktywowany przez hormon
adrenokortykotropowy (ACTH).

Gen chimeryczny, posiadający regulatorowy region CYP11B1, jest również wrażliwy na ACTH

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 1 odpowiada więc na leczenie glikokortykosteroidami:

zmniejszają stężenie ACTH

wtórnie dochodzi do zmniejszenia produkcji aldosteronu z normalizacją ciśnienia tętniczego

Rodziny hiperaldosteronizm typu 1 – objawy

Ciężkie nadciśnienie tętnicze w młodości

Zdarzają się również postaci normotensyjne lub z łagodnym nadciśnieniem

Zwiększona śmiertelność z powodów powikłań sercowo – naczyniowych w młodym wieku

średni wiek pierwszego incydentu 32 lata!

Przyśpieszony rozwój powikłań narządowych

Nawet przed rozwojem ciężkiego nadciśnienia tętniczego

Farmakologiczne potwierdzenie hiperaldosteronizmu rodzinnego typu 1

Najlepszym dowodem GRA znaczny spadek stężenie aldosteronu w osoczu w ciągu kilku dni od zastosowania
deksametazonu

Test jest uznawany za dodatni przy zmniejszeniu stężenia aldosteronu poniżej 4 ng/dl po 4 dniach
leczenia deksametazonem w dawce 0.5 mg co 6 godzin

Test nie służy jako test screenigowy w rodzinach z podejrzeniem rodzinnego hiperaldosteronizmu
typu 1

Wysoki odstetek wyników fałszywie dodatnich

Testy genetyczne rodzinnego hiperaldosteronizmu typu 1

Pozwalają zidentyfikować chimeryczny gen CYP11B1/B2

Wskazane u wszystkich chorych z:

pierwotnym hiperaldosteronizmem przed 20 rokiem życia

wywiadem rodzinnym pierwotnego hiperaldosteronizmu i incydentami udarów w młodym wieku (<40
r.ż.)

oraz

niską aktywnością osoczową reniny

podwyższonymi lub prawidłowymi stężeniami aldosteronu w osoczu

niską/prawidłową kaliemią

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 1 - leczenie

deksametazon

0,5 do 0.75 mg/d

wykazano skuteczność niższych dawek leku w niektórych przypadkach (unikanie powikłań
posterydowych!)

Antagoniści receptora mineralokortykoidowego (jako dodatek do GKS):

amilorid

spironolakton

blokuje przyłączanie się aldosteronu do receptora (MCR).

Diuretyki tiazydowe

nie są zalecane jako leki 1 rzutu

rozważyć terapię łączoną ze spironolaktonem (mogą poprawić kontrolę HA)

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 2

postać nieodpowiadająca na leczenie glikokortykosteroidami

jest nie do odróżnienia od postaci nierodzinnego hiperaldosteronizmu

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 2 - genetyka

Nieznane molekularne podstawy rodzinnego hiperaldosteronizmu typu 2

Część badań sugeruje związek z ramieniem krótkim chromosomu 7, pozycji 22.5

Wymaga dalszych badań – nie wszystkie rodziny wykazuje związek tej postaci z podaną lokalizacja
mutacji

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 2 - rozpoznanie

Potwierdzenie pierwotnego hiperaldosteronizmu u co najmniej 2 członków rodziny

Wykluczenie rodzinnego hiperaldosteronizmu typu 1 (GRA)

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 2

Efektywnym lekiem jest spironolakton

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 3

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 3 spowodowany jest mutacją genu KCNJ5 na chromosomie 11q24

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 3

nowa postać rodzinnego hiperaldosteronizmu

wyjątkowo wysokie wartości tego hormonu

typowy jest przerost nadnerczy!

nadciśnienie oporne na agresywne leczenie farmakologiczne

skutecznym leczeniem jest obustronna adrenalektomia

Rodzinny hiperaldosteronizm - podsumowanie

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 1

Nadciśnienie pojawia się już w dzieciństwie

Może być leczony GKS, stad nazwa tej postaci hiperaldosteronizm poddający się leczeniu
glikokortykosteroidami (glucocorticoid-remediable aldosteronism - GRA)

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 2

Nadciśnienie pojawia się u młodych dorosłych

Nie odpowiada na leczenie GKS

Rodzinny hiperaldosteronizm typu 3

Typowe jest powiększenie nadnerczy (nawet 6-krotne).

Nadciśnienie jest wyjątkowo trudne do leczenia i zwykle skutkuje rozwojem powikłań narządowych

niewydolność serca,

nefropatia nadciśnieniowa

Clinical and Biochemical Phenotypes of Familial Forms of Hyperaldosteronism

Zespół Gordona

Określany jako pseudohiperaldosteronizm typu II

Pierwszy opis dwóch Australijczyków przedstawiony przez Gordona w 1964 i 1970

opisany u około 100 chorych (2013)

Zespół Gordona – objawy

Dotyczy zwykle dzieci (10-20 rok życia)

Ciężkie nadciśnienie tętnicze

Osłabienie mięśniowe

Upośledzenie umysłowe

Niski wzrost

Nieprawidłowości zębów

Zespół Gordona - patogeneza

Niejasna

Upośledzony transport K+ do komórki w wyniku uogólnionego efektu błonowego?

Nadmierne wchłanianie Na+ i Cl- w cewce bliższej

Hiperwolemia

Nadciśnienie tętnicze

Wtórnie zmniejszenie aktywności reninowej osocza

Upośledzenie wrażliwości nerek na działanie przedsionkowego peptydu natriuretycznego

Zespół Gordona – badania laboratoryjne

hiperkaliemia

hiperchloremia

kwasica

zmniejszona aktywność reninowa osocza

normo – lub hipoaldosteronizm

czasami hiperkalciuria

Zespół Gordona – genetyka

Niejasna

Dziedziczenie autosomalne dominujące

Sugeruje się związek z mutacjami w:

chromosomie 1q31-42, (PHA2A)

chromosomie 17p11-q21 (PHA2B)

Mutacje zmiany sensu genu WNK kinazy 4

chromosomie 12p13 (PHA2C)

delecja w 1 intronie genu WNK kinazy 1

Mutacja nieznana

Zmiany jonowe w zespole Gordona

Wzmożona aktywność kotransportera Na

+

-Cl

-

(NCC)

Odpowiada za reabsorpcję Na+ i Cl-

Wzmożona aktywność ENaC

Odpowiada za reabsorbcję Na+

Zwiększona reabsorpcja przezkomórkowa Cl –

Zmniejszona aktywność ATP-zależnego kanału potasowego (ROMK)

Odpowiada za K+ wydzielanie

Mutacje WNK w zespole Gordona

Geny WNK kinazy 4 i 1 odpowiadają za ekspresje wielu kanałów jonowych, głównie w cewkach dalszych nerek,
ale mechanizm niejasny

WNK4

Zmniejsza aktywność kotransportera Na

+

-Cl

-

(NCC)

Zmniejsza aktywność ROMK

Zmniejsza aktywność ENaC

Zwieksza przezkomórkową reabsorbcje Cl-

WNK 1 (działa hamująco na WNK4), ale:

Zwiększa aktywność NCC

Zwiększa aktywność ENaC

Zmniejsza aktywność ROMK

Zwiększa przezkomórkową reabsorbcje Cl-

Zespół Gordona – leczenie

Ograniczenie spożycia soli kuchennej

Diuretyki tiazydowe w niskich dawkach

W większości przypadków normalizacja ciśnienia tętniczego

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów

dziedziczenie autosomalne, recesywne

mutacja w obrębie genu kodującego dehydrogenazę 11β hydroksysteroidową typu 2 (11β-HSD2)

izoenzym obecny głównie w cewkach nerkowych

odpowiedzialny za przekształcenie kortyzolu w nieczynny kortyzon.

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów

istota choroby

dehydrogenaza 11b-hydroksysteroidowa typu 2, przekształca kortyzolu do kortyzonu mającego śladowe
powinowactwo do receptorów mineralokortykoidowych

w warunkach prawidłowych jedynie aldosteron jest fizjologicznym agonistą receptora
mineralokortykoidowego,

w warunkach in vitro powinowactwo do tego receptora jest zbliżone dla aldosteronu i kortyzolu

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów

Kortyzol nagromadzony w dużych ilościach w cewkach nerkowych blokuje dostęp aldosteronu do receptora
mineralokortykoidowego (RM),

kompleks kortyzol-RM nie podlega kontroli układu renina-angiotensyna i jest przyczyną wystąpienia objawów
nadmiaru mineralokortykoidów

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów
blokada receptora

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów –
czynniki wywołujące objawy

Objawy zespołu pozornego nadmiaru mineralokortykoidów (AME) mogą być wywołane działaniem
inhibitorów 11β-HSD2

produkty spożywcze:

kwas glicyretynowy zawarty w lukrecji (Glycerrhiza glabra),

powszechnie stosowana w przemyśle cukierniczym i farmaceutycznym,

flawonoid – naringenina

zawarty w soku grejpfrutowym

u osób wrażliwych i predysponowanych spożycie soku grejpfrutowego w ilości 250 mL na
dzień przez 7 dni powoduje istotne zahamowanie 11β-HSD2

polifenole

w herbacie

leki

karboneksolon

podawany pacjentom podczas leczenia wrzodów żołądka

furosemid

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów
objawy

mała masa urodzeniowa

konsekwencja:

niedoboru dehydrogenazy 11b-hydroksysteroidowej w łożysku

zwiększonego przenikania glukokortykosteroidów przez barierę łożyskową i ich kumulacji w
organizmie płodu

spowolnienie rozwoju fizycznego w dzieciństwie,

nadciśnienie tętnicze,

polidypsja,

poliuria

bóle i osłabienie mięśniowe

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów -
nadciśnienie tętnicze

Stopień nadciśnienia koreluje z aktywnością dehydrogenazy 11b-hydroksysteroidowej

u homozygot

Ciężki przebieg kliniczny

Powikłania naczyniowe (również mózgowe)

Zgony w młodym wieku (dzieciństwo lub pokwitanie)

u heterozygot

manifestacja kliniczna w postaci izolowanego nadciśnienia tętniczego o późnym początku i
łagodnym przebiegu

nie towarzyszą inne objawy kliniczne

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów
badania dodatkowe

hipokaliemia,

obniżoną aktywność reninową osocza

niskie stężenie aldosteronu w surowicy

brak wzrostu ciśnienia po podaniu aldosteronu

wynik wysycenia receptora mineralokortykoidowego przez endogenny kortyzol

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów
rozpoznanie

zwiększony stosunek wolnego kortyzolu do wolnego kortyzonu

ocena biologicznego okresu półtrwania kortyzolu

u chorych wynosi około 120–190 minut, u osób zdrowych około 80 minut

klinicznie:

nieobecność wzrostu ciśnienia tętniczego pod wpływem podawania aldosteronu, przy zachowanej
reakcji na ACTH i kortyzol (nasilają nadciśnienie)

Pozorny nadmiar mineralokortykoidów
leczenie

dieta ubogosodowa

zablokowanie receptora mineralokortykoidowego

Spironolakton

eplerenon

pobudzenie aktywności nerkowej dehydrogenazy 11b-hydroksysteroidowej u pacjentów z częściowo
zachowaną aktywnością tego enzymu

kaptopril (ACEI)

suplementacja potasu

deksametazon

Zablokowanie ACTH – obniżenie stężenie kortyzolu – zmniejszenie wiązania z MR

Deksametazon nie działa sam na MR!

mukowiscydoza

i hemochromatoza

Mukowiscydoza

•

inaczej: zwłóknienie torbielowate, ang. cystic fibrosis – CF

•

najczęściej występująca w populacji rasy białej choroba wywołana mutacją pojedynczego genu

•

dziedziczenie autosomalne recesywne

•

nieuleczalna, prowadząca do istotnego skrócenia okresu życia chorych

Dziedziczenie autosomalne recesywne

MUKOWISCYDOZA

mucus = śluz

+

viscid = lepki

choroba lepkiego śluzu

Rys historyczny

•

po raz pierwszy zidentyfikowana jako oddzielna jednostka nozologiczna w 1938 r. przez Dorothy Hansine
Andersen (1901 - 1963)

•

określona jako torbielowate zwłóknienie trzustki

•

niektóre jej objawy ("słony pocałunek") znane były jednak od dawna

•

gen mukowiscydozy wyizolowano w 1989r.

Struktura białka CFTR

•

zbudowane jest z dwóch homologicznych połówek, połączonych domeną regulatorową

•

dwie domeny wiążące nukleotydy (ang. nucleotide binding domain, NBD),

•

domena regulatorową (R),

•

dwie domeny wewnątrzbłonowe.

CFTR nieprawidłowy transport Cl- przez nabłonki

Lokalizacja genu CFTR

•

mutacje genu, położonego na długim ramieniu 7 chromosomu, kodującego białko CFTR (błonowy regulator
przewodnictwa ang. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

Częstość poszczególnych mutacji

Najczęstsza mutacja genu CFTR

•

najczęstszą mutacją jest delecja trzech par zasad, powodująca utratę fenyloalaniny w pozycji 508 łańcucha
polipeptydowego. Mutacja ta jest określana jako ∆F508 i stanowi prawie 70% wszystkich mutacji.

•

dziecko chorujące na mukowiscydozę o genotypie F508del/G542X odziedziczyło od jednego z rodziców kopię
genu CFTR z mutacją F508del, a od drugiego kopię genu CFTR z mutacją G542X.

Mutacje CFTR – klasy

•

Mutacje klasy I

•

powodują brak syntezy produktu białkowego.

•

Mutacje klasy II

•

powodują defekt produktu białkowego, który zostaje zniszczony w proteasomie.

•

Mutacje klasy III

•

powodują powstanie produktu białkowego, który dostaje się na powierzchnię komórki, jednak
regulacja jego działania jest nieprawidłowa.

•

Mutacje klasy IV

•

powodują nieprawidłowy transport jonów chloru.

•

Mutacje klasy V

•

są najczęściej spowodowane mutacjami promotorowymi lub miejsc splicingowych i powodują
zmniejszoną ilość mRNA, jednak zachowują obecność pewnej liczby cząsteczek białka w komórce.

•

Mutacje klasy VI

•

powodują przyspieszony obrót kanału chlorkowego

Korelacja genoptyp-fenotyp

I, II, III – mutacje silne

IV, V – mutacje łagodne

Współistnienie mutacji

•

Obecność drugiej mutacji może mieć efekt:

•

kompensujący do pierwszej

•

Przykładem na to może być mutacja R553Q, która w pewnym stopniu niweluje wpływ mutacji
δF508

•

pogłębiający chorobę

•

dwie "łagodne" mutacje R347H i D979A, które występując razem powodują ciężki stan
chorobowy

Epidemiologia

•

w populacjach europejskich, przeciętnie 1 na 25 osób jest nosicielem chorego genu CFTR

•

1/2500 urodzeń (w Polsce ok. 1/2300)

•

Afro-Am:

1: 17 000

•

Azja- Am: 1: 90 000

•

średni czas życia 28 lat

•

ok. 30% dożywa >18 r.ż

Klasyfikacja wg WHO

•

CF z objawami ze strony układu oddechowego,

•

CF z objawami z przewodu pokarmowego,

•

CF z objawami ze strony innych narządów,

•

CF nieokreślona

Choroby zależne od mutacji CFR

•

izolowane objawy u chorych, u których zidentyfikowano przynajmniej jedną mutację genu CFTR i nie są
klasyfikowane jako mukowiscydoza:

•

przewlekłe zapalenie trzustki,

•

alergiczna aspergilloza oskrzelowo-płucna,

•

rozsiane rozstrzenie oskrzeli,

•

uogólnione zapalenie oskrzelików,

•

izolowana azoospermia spowodowana wrodzoną niedrożnością nasieniowodów (CBAVD),

•

stwardniające zapalenie dróg żółciowych,

•

przejściowa hipertrypsynogenemia noworodków

Mukowiscydoza - rozpoznanie

•

potwierdzenie dysfunkcji białka CFTR:

•

próba potowa

•

badanie molekularne

•

pomiar potencjałów elektrycznych błony śluzowej nosa

•

oraz przynajmniej 1 z:

•

występowanie CF u rodzeństwa i/lub rodziców,

•

co najmniej jeden objaw kliniczny występujący w chorobie

•

dodatni wynik badania przesiewowego noworodków w kierunku mukowiscydozy

Wykrywanie nosicieli i diagnostyka prenatalna

•

wykrywanie nosicieli:

•

niewielka ilość krwi lub wymaz z policzka do badań genetycznych

•

pozwala na wykrycie większości najczęstszych zmian w genie CF

•

badanie prenatalne (przedurodzeniowe)

•

na podstawie badania płynu owodniowego lub kosmówki

•

wynik zależy od pewności czy osoba badana jest prawdziwym biologicznym ojcem nienarodzonego ☺

Test potowy

•

podstawowy i czuły test - wstępne rozpoznanie CF

•

próbki zawierające co najmniej 100 mg potu

•

co najmniej dwa odrębnie wykonane badania

•

chorego diagnozuje zwiększone stężenie sodu (powyżej 60mmol/l) oraz chloru w pocie (powyżej 70 mol/l, u
niemowląt > 40 mmol/l).

Test potowy – wyniki fałszywie dodatnie

•

wyparowanie potu z bibuły

•

zanieczyszczeniem próbki

•

Inne niż mukowiscydoza choroby:

•

nerkowopochodna moczówka prosta,

•

zapalenie skóry o znacznym nasileniu,

•

choroba Addisona,

•

dysplazja ektodermalna,

•

glikogenoza I typu

Test potowy - wyniki fałszywie ujemne

•

złe rozcieńczenie próbki

•

znaczne niedożywienie i obrzęki u chorych na CF

Test potowy – wyniki graniczne

•

wartości chlorków w pocie mogą prawidłowe lub graniczne (40–60 mmol/l)

•

kilka % chorych na CF

•

o rozpoznaniu decyduje wówczas

•

obraz kliniczny

•

i badania mutacji genu CFTR

Badania molekularne

•

ostateczne potwierdzenie rozpoznania mukowiscydozy

•

identyfikacja mutacji w obydwu allelach genu CFTR

•

negatywny wynik badania molekularnego nie wyklucza rozpoznania CF ze względu na heterogenność
mutacji – obecnie liczba poznanych mutacji wynosi ponad 1900

•

wykrycie dwóch mutacji genu CFTR bez klinicznych objawów choroby nie upoważnia do rozpoznania
mukowiscydozy!

•

osoby te powinny być pod opieką poradni CF (stan pre-CF?)

Pomiar przeznabłonkowej różnicy potencjałów w przewodach nosa

•

ang. transepithelial nasal potential difference, NPD

•

w przypadkach wątpliwych

•

pomiar polega na elektrofizjologicznym badaniu błony śluzowej nosa, który umożliwia ocenę czynności
kanałów chlorkowych przed i po podaniu amiloridu (substancja otwierająca dodatkowy kanał chlorkowy).

•

u chorych stwierdza się zwiększoną, bardziej ujemną, różnicę potencjałów śluzówki nosa (poniżej – 40 mV) niż
u zdrowych (powyżej – 30 mV), co jest związane z zaburzeniami funkcji kanału chlorkowego.

•

badanie to należy wykonać dwukrotnie

podwyższone stężenie immunoreaktywnej

trypsyny lub trypsynogenu – (IRT)

•

badanie przesiewowe noworodków - w oddziale noworodkowym każdy noworodek w Polsce ma pobierane
kilka kropel krwi z piętki, na specjalną bibułę.

•

stosuje się oznaczanie immunoreaktywnego trypsynogenu (IRT) w suchej kropli krwi

•

u chorych noworodków poziom trypsyny we krwi jest kilkakrotnie wyższy w porównaniu z dziećmi zdrowymi i
utrzymuje się przez pierwszy okres życia, a następnie spada co jest związane z niewydolnością
zewnątrzwydzielniczą trzustki.

•

wymaga wykonania badań weryfikacyjnych

•

test potowy

•

badanie molekularne mutacji genu CFTR występujących w populacji polskiej

•

jedynie u 2-10% noworodków z nieprawidłowym wynikiem IRT po wykonaniu badania
genetycznego stwierdza się mukowiscydozę

Diagnostyka - test przesiewowy IRT
Schemat diagnostyki w kierunku CF

Podsumowanie wartości diagnostyki

prawidłowa próba potowa nie wyklucza mukowiscydozy

badanie genetyczne może potwierdzić, ale nie wykluczyć mukowiscydozę

pacjenci z obrazem klinicznym sugerującym mukowiscydozę powinni być leczeni jak pacjenci z
potwierdzoną mukowiscydozą mimo ujemnej próby potowej czy ujemnego badania genetycznego

Objawy kliniczne – okres płodowy i noworodkowy

•

zwapnienia w jamie otrzewnowej płodu

•

poszerzenie jelita cienkiego płodu w USG

•

niedrożność smółkowa

•

przedłużająca się żółtaczka pozawątrobowa

•

CF u krewnych I stopnia

Objawy kliniczne - okres niemowlęcy i poniemowlęcy

•

Przewlekły i napadowy kaszel

•

Infekcje wirusowe i nadkażenia bakteryjne

•

Poranne oczyszczanie drzewa oskrzelowego z wydzieliny nagromadzonej w nocy

•

Nawracające zapalenia płuc

•

Przewlekłe zakażenia dróg układu oddechowego

•

St. aureus

•

Ps.aeruginosa

•

Aspergliloza płucna 11%!

•

Astma wczesnodziecięca

•

Zmiany w rtg płuc

•

Niedodma

•

rozdęcie

•

Bardzo słony pot

•

Hipoproteinemia i obrzęki

•

Objawy zespołu złego wchłaniania (celiakia?)

•

Wypadanie śluzówki odbytnicy

•

Obiawy niedoboru witamin rozpuszczalnych w tłuszczach

Objawy kliniczne - okres dzieciństwa i dorośli

•

Marskość żółciowa wątroby

•

Kamica żółciowa u dzieci

•

Nadciśnienie wrotne, żylaki przełyku

•

Nawracające zapalenie trzustki

•

Cukrzyca

•

Niedobór wzrostu i masy ciała

•

Nawracające obrzęki ślinianek

•

Zapaść podczas upałów

•

Opóźnione dojrzewanie płciowe

•

Niepłodność mężczyzn (wrodzona niedrożność nasieniowodów – azoospermia)

Objawy z dróg oddechowych

•

Polipy nosa 20%

•

Przewlekłe zapalenie zatok obocznych nosa 90%

Patomechanizm zmian w drogach oddechowych

Zmiany w płucach -

•

u chorych na CF wydzielina jest 30-60 razy bardziej gęsta i lepka niż w normie

•

zaczopowanie pęcherzyków płucnych i oskrzelików, prowadzi do powstania zmian o charakterze rozedmowo-
niedodmowym

Odsetek zakażeń w CF zależenie od wieku

•

gęsta wydzielina drzewa oskrzelowego staje się wyjątkowo korzystnym podłożem do kolonizacji i wzrostu
bakterii:

•

Staphylococcus aureus

•

Haemophilus influenzae

•

Pseudomonas aeruginosa

•

Pseudomonas capacia

Zmiany w płucach

•

rozstrzenie oskrzeli

•

krwioplucie

•

palce pałeczkowate

Porównanie

płuca zdrowego (L) i chorego na mukowiscydozę (R)

Ślinianki

•

przejściowe zwiększenie objętości ślinianek

•

zwłaszcza podżuchwowych

•

około 90% chorych

•

w większości przypadków nie wymagające leczenia

•

żucie gumy

•

jedzenie cytryny

•

w nielicznych przypadkach przyczyną obrzęku może być kamica przewodu ślinowego

•

leczenie chirurgiczne

Niewydolność zewnątrzwydzielnicza trzustki

•

u około 85-90% chorych na CF

•

obniżenie aktywności lipazy oraz trypsyny lub całkowitego ich braku

•

klinicznie ujawnia się w postaci biegunki tłuszczowej

•

Stolce są liczne, obfite, cuchnące z niestrawionymi resztkami pokarmowymi

•

Stolec zawiera widoczne kropelki tłuszczu pływa na wodzie, jest trudny do sprania z pieluszek, kolor
jaśniejszy

Niewydolność zewnątrzwydzielnicza trzustki

•

powstawanie obrzęków w wyniku hipoproteinemii

•

rozwój objawów klinicznych wynikających z niedoboru witamin rozpuszczalnych w tłuszczach – A, D, E, K,

•

niedokrwistość z niedoboru żelaza

•

niedobór wzrostu i masy ciała pomimo dobrego łaknienia

Niewydolność wewnątrzwydzielnicza trzustki

•

wystąpienie cukrzycy

•

do 10r.ż – 1 %; do 30r.ż – 50%

•

wynik włóknienia

Refluks przełykowy

•

25% chorych (częściej u dzieci <2 r.ż)

•

przyczyny:

•

zmniejszone napięcie dolnego zwieracza przełyku

•

opóźnione opróżnianie żołądka

•

osłabienia działania przeciwrefluksowego odnóg przepony

Uszkodzenie wątroby u noworodków

•

przedłużająca się żółtaczka noworodków

•

pierwszy objaw dysfunkcji watroby

•

wywołana obturacją przewodów żółciowych zalegającym, zagęszczonym i odwodnionym śluzem w
wewnątrzwątrobowych przewodach żółciowych

Uszkodzenie wątroby u dorosłych

•

żółciowa marskość wątroby

•

wynik przewlekłej cholestazy (zaczopowania)

•

występuje u 25% chorych na CF w badaniach biopsyjnych,

•

objawy kliniczne tylko u 2-5%

•

nadciśnienie wrotne – żylaki przełyku, splenomegalia

Wypadanie odbytu

•

20% chorych

•

najczęściej diagnozowane pomiędzy 6 i 36 miesiącem życia dziecka

•

przyczyny:

•

zmniejszenia napięcia zwieracza odbytu,

•

uporczywy kaszel,

•

biegunki

•

długotrwałe zaparcia i rozdęcia odbytnicy przez masy kałowe

Układ kostno-stawowy

•

napadowe zapalenie stawów (episodic arthritis)

•

etiologia przypuszczalnie immunologiczna

•

u około 5%.

•

płucna przerostowa osteoartropatia

•

ból, który przy nasilaniu się utrudnia chodzenie

Niepłodność

•

niedrożność nasieniowodów

•

powstaje w późnym okresie rozwoju płodowego

•

u około 95-98% mężczyzn obturacyjna azoospermia i niepłodność

•

rozwojowo prawidłowa budowa anatomiczna układu rozrodczego

•

nie zapewnia zajścia w ciążę z powodu utrudnionej penetracji plemników w nadmiernie lepkim i gęstym śluzie
szyjkowym

Leczenie

•

kompleksowe:

•

leczenie żywieniowe,

•

terapię niewydolności zewnątrzwydzielniczej trzustki,

•

profilaktykę i leczenie choroby oskrzelowo-płucnej,

•

leczenie powikłań CF

Leczenie żywieniowe

•

jak najdłuższe karmienie piersią

•

diety wysokoenergetyczne (130-150% zapotrzebowania u rówieśników)

•

nocne uzupełnianie niedoborów kalorycznych

•

zgłębnik nosowo – żołądkowy

•

PEG

•

dostarczanie odpowiedniej ilości NaCl (zwłaszcza w czasie upałów):

•

dosalanie potraw

•

NaCl w opłatki

•

stała podaż ADEK

•

enzymy trzustkowe u chorych z objawami niewydolności zewnątrzwydzielniczej trzustki

Leczenie objawów płucnych

•

fizykoterapia

•

antybiotykoterapia

•

leki mukolityczne

•

leki rozszerzające oskrzela

•

β-mimetyki

•

leki p/zapalne

•

GKS

•

NLPZ

•

makrolidy

•

tlenoterapia

•

szczepienia ochronne

•

H. influenzae

•

Str. pneumoniae

•

p/grypie

Drenaż

:

FIZJOTERAPIA: 15-20 min; 2-3x dziennie

-

Niemowlę: drenaż ułożeniowy + oklepywanie

-oklepywanie: „odklejenie”

wydzieliny

-ucisk: wspomaga wydłużony

wydech i przeniesienie

wydzieliny z obwodu

w kierunku tchawicy

-Od 3 roku życia: wprowadzanie metod z czynną współpracą

*Prowokowanie do śmiechu

Terapia przewlekła - inhalacje

Za pomocą

aerozoloterapii

podawane są następujące leki:

- leki mukolityczne,

- antybiotyki,

- przeciwzapalne,

- rozszerzające oskrzela a także roztwory soli fizjologicznej (hipotoniczne i hipertoniczne).

30 – 60 minut przed drenażem oskrzeli

Inhalacje z soli hipertonicznej 5-6% NaCl – ma działanie wykrztuśne

Dornaza alfa (Pulmozyme) = Ludzka rekombinowana DN–aza (rhDN-aza)-

upłynnia wydzielinę oskrzelową

wskazania:

•

potwierdzona mukowiscydoza

•

obecność choroby oskrzelowo-płucnej

•

dobra współpraca chorego w czasie zabiegów inhalacyjnych

i fizjoterapeutycznych.

•

w przypadku stwierdzenia zakażenia

Pseudomonas aeruginosa

Hemochromaztoza

•

najczęstsza choroba genetyczna

•

1:200 do 1:400 osób

•

dziedziczenie autosomalne recesywne

•

nosicielstwo to ok. 5-20% populacji

•

rozprzestrzenienie zawdzięczamy Wikingom ☺

Rys historyczny

•

1865 – Trousseau, pierwszy opis choroby - triada objawów:

•

nadmierna pigmentacja skóry

•

marskość wątroby

•

cukrzycę

•

1889 - Recklinghausen po raz pierwszy użył terminu„hemochromatoza” jako nadmierną pigmentację z
zawartością żelaza w tkankach.

•

1935 - Sheldon opisał ponad 300 przypadków hemochromatozy, sugerując wrodzony, dziedziczny charakter
schorzenia

•

1977 - Simon z zespołem określił typ dziedziczenia choroby

•

1996 - Feder i wsp. odkryli gen HFE

Mutacje genu HFE

•

zlokalizowany na krótkim ramieniu chromosomu 6p21.3

•

opisano 2 mutacje genu HFE:

•

C282Y – zamiana cysteiny na tyrozynę w pozycji 282 łańcucha polipeptydowego

•

H63D - podstawienie histydyny w miejsce kwasu aspartamowego w pozycji 63

Mutacja C282Y

•

heterozygoty często bezobjawowe

•

homozygoty objawowe w 10-25%

•

ale osoby z fenotypem HHC to w 60-96% właśnie homozygoty C282Y

•

najczęściej występuje w krajach Europy północnej, rzadziej w krajach śródziemnomorskich i USA

mutacja genu HFE - H63D

•

sama mutacja H63D występuje w populacji rasy kaukaskiej z częstością 15–20%

•

większość heterozygot bezobjawowych

•

homozygoty są rzadkością

•

homozygotyczni nosiciele mają objawy łagodnego spichrzania żelaza, głównie pod postacią zaburzeń
biochemicznych parametrów gospodarki żelazowej

•

głównie Indie i kraje Azji Mniejszej

•

istotne znaczenie w przypadku mieszanych heterozygot C282Y/H63D

•

spodziewane ryzyko wystąpienia objawów patologicznego gromadzenia żelaza szacowane jest na 1–
2%

Mechanizm choroby

•

gen HFE odpowiada za kontrolę wchłaniania żelaza w komórkach nabłonka jelit

•

zmiana informacji genetycznej prowadzi do zwiększonego pobierania żelaza z treści pokarmowej i do jego
stopniowego gromadzenia w tkankach i narządach, co (nieleczone), może po latach wywołać uszkodzenia
narządów organizmu.

Zmiany genetyczne a zaburzenia wchłaniania Fe

•

mutacja genu HFE prawdopodobnie prowadzi do zmniejszonego wychwytu przez enterocyty żelaza związanego
z transferyną krwi krążącej, a następnie do paradoksalnego wewnątrzkomórkowego niedoboru żelaza

•

kompensacyjny wzrost wchłaniania jonów żelazowych przez enterocyty prowadzi do jego nadmiaru w
organizmie i odkładania w narządach miąższowych

Hemochromatozy

Epidemiologia

•

M>K

•

wpływ innych czynników:

•

wiek,

•

płeć,

•

spożycie alkoholu,

•

zakażenia wirusami hepatotropowymi

Płeć a wiek rozwoju objawów

•

dobowa dieta dostarcza zwykle 10 mg Fe2+, z czego w dwunastnicy i początkowym odcinku jelita czczego
wchłania się około 10%.

•

za wartość graniczna, po zdeponowaniu której zaczynają się ujawniać toksyczne właściwości żelaza, uznano 20
g.

•

mężczyźni z pierwotna hemochromatoza kumulują 0,6 g żelaza rocznie,

•

kobiety kumulują około 0,15 g/rok

•

z powodu miesiączkowania, porodów, jak i laktacji kobieta traci od 15 do 30 g Fe w ciągu życia

•

u mężczyzn zwykle objawy występują około 50 r.ż.,

•

u kobiet kilka do kilkunastu lat po ustaniu czynności hormonalnej jajników

Etanol a pierwotna hemochromatoza

•

Etanol

•

zaburza wewnątrzkomórkową równowagę powodując obniżenie cytoplazmatycznego pH i uwalnianie
Fe3+ z połączeń z ferrytyną

•

zwiększa jelitowe wchłanianie jonu żelazowego

Objawy

•

przewlekłe zmęczenie

•

uszkodzenie wątroby objawiające się hepatomegalią i umiarkowanym wzrostem aktywności aminotransferaz

•

niespecyficzne bóle stawów

zespół trzech A, czyli artralgii, astenii, aminotransferaz

•

czasem szare zabarwienie skóry

Powikłania narządowe w hemochromatozie

Rozpoznanie

•

objawy kliniczne

•

parametry gospodarki żelaza

•

badanie genetyczne

Rozpoznanie

•

podwyższony poziom ferrytyny i żelaza w surowicy krwi

•

podwyższony poziom wysycenia transferryny żelazem

•

wysycenie transferyny u kobiet powyżej 50%, a u mężczyzn powyżej 60% jest swoistym i czułym
wykładnikiem nadmiaru żelaza u chorych bez objawów klinicznych

•

potwierdzenie następuje po badaniu genetycznym próbki krwi lub śliny.

•

obecnie szacuje się, że przeciętnie mija około 10 lat od wystąpienia objawów do ustalenia rozpoznania

oznaczenia stężenia żelaza i wysycenia transferyny w surowicy

•

żelazo

•

transferryna

•

wysycenie transferryny nie powinno przekraczać 45%,

•

zafałszowane obniżenie tej wartości może być chorób zapalnych

•

ferrytyna

•

znacznie podwyższone stężenie tego białka w surowicy zwykle ściśle koreluje z nadmiernym
gromadzeniem żelaza w tkankach.

•

w przypadkach, gdy ferrytyna przekracza 1000 ng/ml obserwuje się istotny wzrost ryzyka włóknienia
wątroby

Biopsja wątroby

•

Wskazania:

•

hepatomegalia,

•

podwyższone aktywności aminotransferaz,

•

stężenie ferrytyny przekraczające 1000 ng/ml,

•

u osób >40 r.ż.

•

Złotym standardem pozostaje ilościowe oznaczenie metodą spektrofotometryczną zawartości żelaza w
bioptacie

•

niezalecana u młodych chorych po potwierdzeniu genetycznym

Ocena stężenia żelaza w wątrobie

1. HIC (hepatic iron concentration),

•

prawidłowe wartości HIC<36 μmol/g suchej tkanki wątrobowej

•

do rozpoznania hemochromatozy konieczne HIC >80 umol/g

2. HII (hepatic iron index; HIC/wiek),

•

uwzględnia wiek pacjenta w szacowaniu zasobów żelaza

•

wartość nie powinna przekraczać 1,9

3.Metoda półilościowej oceny depozytów żelaza

•

wykorzystuje barwienie preparatów wycinka wątroby błękitem pruskim

•

szacowanie ilości żelaza w badaniu histopatologicznym najczęściej według skali punktowej 0–4
punktów

Algorytm rozpoznania
Diagnostyka u rodziny

•

podstawowe badania biochemiczne

•

powinny być przeprowadzone u rodzeństwa

•

badanie genetyczne

•

uzasadnione, jeśli mutacja została zidentyfikowana

Leczenie

•

leczenie, jak w niewielu innych chorobach, jest proste i tanie

•

sprowadza się do pozwalających pozbyć się nadmiaru żelaza powtarzanych do końca życia chorego
krwioupustach

•

można wykonywać w warunkach ambulatoryjnych, a nawet w domu chorego.

•

odpowiednia częstotliwość zabiegów praktycznie wstrzymuje postęp choroby

Krwioupusty

•

niezbędne, gdy ferrytyna przekracza wartość 1000 ng/ml

•

cel: obniżenie stężenia ferrytyny do około 30 ng/ml (wg niektórych autorów pożądane są jeszcze mniejsze
stężenia – 10 ng/ml) i wysycenia transferyny <50%.

•

jedna jednostka 450 ml krwi oznacza usunięcie 200–250 mg żelaza z organizmu i zmniejszenie stężenia
ferrytyny o prawie 30 ng/ml

Wskazania do krwioupustów -
osoby z objawami hemochromatozy
oraz homozygoty C282Y i heterozygoty mieszane C282Y/H63D

Częstość wykonywania kriwioupustów

•

nie określono

•

uważa się, że początkowo należy usuwać ok. 1l krwi/tydzień

•

po osiągnięciu stężenia ferrytyny 80–100 ng/ml zaleca się terapię podtrzymującą z wydłużeniem okresu między
kolejnymi krwioupustami u mężczyzn do 3–4 miesięcy, u kobiet do 6 miesięcy

Deferoksamina

•

jako zła alternatywa? dla krwioupustów

•

dawka stosowana w hemochromatozie usuwa zaledwie kilkanaście gramów żelaza/dobę!

•

100 mg leku chelatuje tylko ok. 8mg Fe

3+

Leczenie – zalecenia ogólne

•

unikanie suplementacji żelaza

•

unikanie suplementacji witaminy C w dużych dawkach

•

niespożywanie produktów bogatych w żelazo:

•

czerwonego mięsa,

•

wątróbek

•

win czerwonych!

Przeszczep wątroby

•

złe doświadczenia w tej grupie chorych

•

częściej rozwijają powikłania kardiologiczne

•

wyższa śmiertelność po zabiegu niż w innych grupach - głównie z powodu zakażeń bakteryjnych i
grzybiczych

•

tylko 58% chorych przeżywa rok po transplantacji

Rokowanie

•

nieleczona nieuchronnie prowadzi do śmierci!

•

leczona przed wystąpieniem powikłań narządowych nie ma wpływu na czas przeżycia

P

P

o

o

d

d

s

s

t

t

a

a

w

w

o

o

w

w

e

e

t

t

e

e

c

c

h

h

n

n

i

i

k

k

i

i

m

m

o

o

l

l

e

e

k

k

u

u

l

l

a

a

r

r

n

n

e

e

Ź

Ź

r

r

ó

ó

d

d

ł

ł

e

e

m

m

k

k

w

w

a

a

s

s

ó

ó

w

w

n

n

u

u

k

k

l

l

e

e

i

i

n

n

o

o

w

w

y

y

c

c

h

h

m

m

o

o

g

g

ą

ą

b

b

y

y

ć

ć

k

k

o

o

m

m

ó

ó

r

r

k

k

i

i

p

p

r

r

a

a

w

w

i

i

e

e

w

w

s

s

z

z

y

y

s

s

t

t

k

k

i

i

c

c

h

h

t

t

k

k

a

a

n

n

e

e

k

k

:

:

Krew obwodowa:

zabieg pobrania jest mało inwazyjny,

z leukocytów uzyskuje się dużo DNA/RNA

erytrocyty nie nadają się, bo nie zawierają jądra!

Wymaz z jamy ustnej:

do prostych testów genetycznych

Wycinek skóry i założenie hodowli fibroblastów:

dla szczegółowych i długotrwałych badań

Złuszczone komórki płodu pobierane podczas amniocentezy (nakłucie igłą jamy owodni zwykle pod
kontrolą USG)

do badań prenatalnych

Komórki guza, szpik kostny:

do badań onkologicznych

Płyn ustrojowy, surowica, płyn mózgowo-rdzeniowy, plwocina, popłuczyny oskrzelowe, bioptaty
tkankowe:

do wykrywania czynników zakaźnych

Nasienie:

kryminalistyka, ustalanie ojcostwa

I

I

z

z

o

o

l

l

a

a

c

c

j

j

a

a

D

D

N

N

A

A

przygotowanie materiału biologicznego

dezintegracja i liza komórek

inaktywacja nukleaz komórkowych

oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów komórkowych zagęszczenie preparatu
DNA

usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych

strącanie wyizolowanego DNA w obecności kationów jednowartościowych za pomocą etanolu

I

I

z

z

o

o

l

l

a

a

c

c

j

j

a

a

D

D

N

N

A

A

rozdzielenie komórek, rozbicie/strawienie ścian komórkowych

homogenizacja - (fizyczne zniszczenie struktury tkankowej i komórkowej materiału
biologicznego)

mechaniczna

w ciekłym azocie: rozcieranie materiału biologicznego w ciekłym azocie - kryształki

lodu, tworzące się w tkankach podczas gwałtownego zamrażania, niszczą ściany i inne
struktury komórkowe uwalniając zawartości komórek

trawienie chitynazą

I

I

Z

Z

O

O

L

L

O

O

W

W

A

A

N

N

I

I

E

E

D

D

N

N

A

A

–

–

l

l

i

i

z

z

a

a

k

k

o

o

m

m

ó

ó

r

r

e

e

k

k

◦

Odwirowane komórki poddawane są lizie.

◦

Komórki ulegają lizie pod wpływem:

niejonowych

lub jonowych detergentów (SDS, sarkozyl, Triton X-100),

rozpuszczalników organicznych,

roztworów alkalicznych (liza alkaliczna)

lub wysokiej temperatury (liza termiczna).

Stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w
pH<8.0).

I

I

Z

Z

O

O

L

L

A

A

C

C

J

J

A

A

D

D

N

N

A

A

–

–

o

o

c

c

z

z

y

y

s

s

z

z

c

c

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

D

D

N

N

A

A

c

c

z

z

y

y

l

l

i

i

u

u

s

s

u

u

n

n

i

i

ę

ę

c

c

i

i

e

e

b

b

i

i

a

a

ł

ł

e

e

k

k

,

,

l

l

i

i

p

p

i

i

d

d

ó

ó

w

w

,

,

c

c

u

u

k

k

r

r

ó

ó

w

w

Do usuwania białek stosujemy trawienie proteinazą K oraz z ekstrakcję fenolem i chloroformem.

Lipidy usuwamy dzięki ekstrakcji chloroformem. Ekstrakcję chloroformem wykonujemy przeważnie
bezpośrednio po ekstrakcji fenolem, gdyż chloroform oprócz lipidów i białek usuwa z fazy wodnej również
resztki fenolu.

Polisacharydy usuwamy wytrącając DNA CTABem (bromek haksadecylotrimetyloamoniowy)

Polifenole, które w postaci utlenionej tworzą wiązania kowalencyjne z DNA, usuwane są dzięki obecności
PVP (poliwinylopirolidon) w buforze ekstrakcyjnym.

RNA trawimy RNAzą lub wytrącamy z wykorzystaniem LiCl.

strącanie DNA

◦

wynika z konieczności oddzielenia DNA od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji czyli
detergentów, soli, inhibitorów.

◦

Składniki te, po spełnieniu swojej funkcji, muszą zostać dokładnie usunięte z preparatu, gdyż ich
obecność w preparacie uniemożliwiałaby późniejsze wykorzystanie DNA do prac wykonywanych z
enzymami, np. enzymami restrykcyjnymi, polimerazami, kinazami.

◦

Sole i detergenty usuwamy wytrącając DNA w etanolu lub izopropanolu. W celu zwiększenia wydajność
wytrącania DNA, do preparatu dodajemy dodatkowo octan amonu, potasu lub sodu

I

I

Z

Z

O

O

L

L

A

A

C

C

J

J

A

A

D

D

N

N

A

A

-

-

p

p

r

r

z

z

e

e

c

c

h

h

o

o

w

w

y

y

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

D

D

N

N

A

A

DNA zawiesza się w lekko zasadowym buforze z dodatkiem EDTA, który wiąże jony dwuwartościowe, np.
Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+ - jony te są kofaktorami wielu enzymów nukleolitycznych stanowiących zagrożenie
dla przechowywanego DNA.

DNA w buforach należy przechowywać w +4 (do miesiąca) lub –20 st. C (nawet przez kilka miesięcy)

O

O

c

c

e

e

n

n

a

a

i

i

l

l

o

o

ś

ś

c

c

i

i

i

i

j

j

a

a

k

k

o

o

ś

ś

c

c

i

i

w

w

y

y

i

i

z

z

o

o

l

l

o

o

w

w

a

a

n

n

e

e

g

g

o

o

D

D

N

N

A

A

•

Przed przystąpieniem do izolacji należy zawsze wziąć pod uwagę to czy ilość DNA, jaką jesteśmy w stanie
uzyskać po izolacji daną techniką, będzie wystarczająca dla dalszych prac.

•

Jeżeli celem izolacji jest np. wykonanie amplifikacji PCR, wówczas ze względu na dużą czułość tej
reakcji, do jednego testu wystarczy ok. 50-500ng DNA. Taką ilość DNA można uzyskać np. z wymazów

nabłonka błon śluzowych. Jeżeli natomiast przygotowujemy materiał genetyczny do wykonania testu
hybrydyzacji, musimy uzyskać co najmniej 10 μg DNA. Takie ilości DNA najczęściej izoluje się z krwi.

Po otrzymaniu DNA należy oznaczyć: zawartość, czystość i jakość DNA

Z

Z

a

a

w

w

a

a

r

r

t

t

o

o

ś

ś

ć

ć

D

D

N

N

A

A

wylicza się w ug/ml wg wzoru:

Z =A260 x 50 x R

Gdzie:

A260 – absorbancja
50 stały współczynnik (1 jednostka absorbancji – 50ug DNA)
R - rozcieńczenie

S

S

p

p

e

e

k

k

t

t

r

r

o

o

f

f

o

o

t

t

o

o

m

m

e

e

t

t

r

r

i

i

a

a

Spektrofotometria absorpcyjna dzieli się na

◦

absorpcjometrię w świetle widzialnym (kolorymetrię)

◦

absorpcjometrię w nadfiolecie i podczerwieni

Podstawowym kryterium tej metody jest selektywna absorpcja promieniowania świetlnego przez roztwór
badanej substancji.

Absorpcja promieniowania z zakresu ultrafioletu zależy od struktury cząsteczki.

Absorpcja promieniowania powoduje przejścia elektronów ze stanów podstawowych na wyższe poziomy
energetyczne – stany wzbudzone.

Jeżeli na próbkę (o grubości l) pada promieniowanie monochromatyczne (promieniowanie o jednej długości
fali) o natężeniu I

0

to część tego promieniowania zostanie rozproszona I

x

, część zostanie zaabsorbowana I

a

, a

część przejdzie przez badaną próbkę I

T

.

◦

I

0

= I

a

+ I

x

+ I

T

Stosunek natężenia wiązki promieniowania po przejściu przez absorbujące środowisko I

T

do natężenia

wyjściowego I

0

wyrażony w procentach nazywamy transmitancją (T = I

T

/ I

0

). Z kolei pojęcie absorbancji (A)

definiujemy jako logarytm dziesiętny z odwrotności transmitancji

O

O

c

c

e

e

n

n

a

a

i

i

l

l

o

o

ś

ś

c

c

i

i

i

i

j

j

a

a

k

k

o

o

ś

ś

c

c

i

i

D

D

N

N

A

A

Analiza jakościowa:

◦

maksimum absorbancji białek, częstego zanieczyszczenia DNA przy izolacji manualnej, wynosi 280 nm,

◦

zanieczyszczenia organiczne posiadają najwyższą absorbancję poniżej 240 nm. Przyjęto więc arbitralnie
230nm jako długość fali dobrze określającą stopień zanieczyszczeń rozpuszczalnikami organicznymi.

◦

maksimum absorbancji dla kwasów nukleinowych (A260)

Miarą stopnia czystości kwasów nukleinowych jest stosunek A260/230 oraz A260/280. Przyjmuje się, że
czyste DNA (100%) ma A260/280>1,8 i A260/230>1,8 (2,0), akceptowalna czystość wynosi 1,6 – 1,8.

Najprościej rzecz ujmując oznacza to, że absorbancja przy maksimum dla kwasów nukleinowych (A260) jest
2x większa niż absorbancja tła i zanieczyszczeń.

E

E

l

l

e

e

k

k

t

t

r

r

o

o

f

f

o

o

r

r

e

e

z

z

a

a

Elektroforeza to przemieszczanie się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym. Ujemnie naładowane
cząsteczki wędrują w kierunku elektrody (+), a dodatnio naładowane - w kierunku elektrody (-).

W biologii molekularnej używa się dwóch rodzajów żeli:

◦

agarozowych

◦

i poliakrylamidowych.

E

E

l

l

e

e

k

k

t

t

r

r

o

o

f

f

o

o

r

r

e

e

z

z

a

a

w

w

ż

ż

e

e

l

l

u

u

a

a

g

g

a

a

r

r

o

o

z

z

o

o

w

w

y

y

m

m

Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów, w postaci handlowej jest białym lub lekko żółtym
proszkiem.

Jest to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt heksozy

Agaroza rozpuszcza się bardzo łatwo w gotującej się wodzie i pozostaje w stanie płynnym aż do temperatury
około 40°C. Poniżej tej temperatury zestala się w postaci porowatego żelu.

Elektroforeza w żelu to standardowa metoda rozdziału cząsteczek DNA różnej długości.

Ma wiele zastosowań:

w analizie RFLP,

oczyszczaniu pojedynczych fragmentów do klonowania czy sekwencjonowania,

badaniu produktów PCR

służy do rozdzielania cząsteczek RNA.

Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział
elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA,
pH 8) lub TAE×1(40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8).

Ż

Ż

e

e

l

l

a

a

g

g

a

a

r

r

o

o

z

z

o

o

w

w

y

y

-

-

p

p

o

o

r

r

y

y

Rozmiary porowatości można regulować stosując agarozę w różnych stężeniach. Im wyższe jest stężenie
agarozy, tym drobniejsze są pory (od 100-300 nm średnicy)

Stężenie żelu determinuje rozmiar fragmentów DNA, które można rozdzielić, np. żelu 0,3% używa się do
cząsteczek między 5-50 kb, a żelu 5% do cząsteczek 100-500 kb.

Zwykle przygotowuje się żele o stężeniach agarozy z przedziału 0,4-4,0%.

Elektroforezę przeprowadza się w żelu, będącym siecią porów przez które cząsteczki DNA musza się
przeciskać, aby dotrzeć do anody. Krótsze cząsteczki są słabiej zatrzymywane przez pory niż cząsteczki
dłuższe, a więc wędrują przez żel szybciej.

Ż

Ż

e

e

l

l

e

e

a

a

g

g

a

a

r

r

o

o

z

z

o

o

w

w

e

e

–

–

w

w

a

a

d

d

y

y

i

i

z

z

a

a

l

l

e

e

t

t

y

y

•

Zalety

•

łatwość i szybkość ich przygotowania

•

możliwość separacji dużych makromolekuł np. DNA

•

Wady:

•

słaba wytrzymałość mechaniczna żeli - wyschnięte żele rozsypują się pod wpływem bardzo niewielkich
sił.

•

słaba rozdzielczość frakcji DNA różniącego się poniżej 5% wielkości.

E

E

L

L

E

E

K

K

T

T

R

R

O

O

F

F

O

O

R

R

E

E

Z

Z

A

A

W

W

Ż

Ż

E

E

L

L

U

U

A

A

G

G

A

A

R

R

O

O

Z

Z

O

O

W

W

Y

Y

M

M

Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w

polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody.

Im dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłużej odnajduje ona drogę poprzez pory żelu.

Jeżeli umieścimy DNA w żelu agarozowym i przyłożymy niskie napięcie to prędkość migracji DNA o różnych
ciężarach cząsteczkowych jest proporcjonalna do napięcia.

Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr)

B

B

a

a

r

r

w

w

i

i

e

e

n

n

i

i

e

e

D

D

N

N

A

A

bromek etydyny to fluorochrom, który wiąże się z DNA na zasadzie interkalacji - termin interkalacja (z łac.
intercalare) oznacza „wsuwać się”, jest zarezerwowany dla specyficznego sposobu wiązania polegającego na
wsuwaniu się płaskich heterocyklicznych, aromatycznych układów pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie
DNA.

Bromek etydyny jest związkiem bardzo często wykorzystywanym w biologii molekularnej, fluoryzuje na
kolor pomarańczowo-czerwony umożliwiając tym samym uwidocznienie prążków DNA w żelu w trakcie
elektroforezy.

Podczas pacy z bromkiem etydyny należy zachować szczególną ostrożność gdyż jest on związkiem o silnym
działaniu mutagennym i karcynogennym.

Innym barwnikiem DNA jest:

◦

SYBR Green, którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niż EtBr,

◦

kwasy nukleinowe oraz oligonukleotydy można również wybarwić srebrem, a czułość detekcji zbliżona
jest do 10 ng DNA na prążek.

Wszystkie ww. znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV

E

E

L

L

E

E

K

K

T

T

R

R

O

O

F

F

O

O

R

R

E

E

Z

Z

A

A

W

W

Ż

Ż

E

E

L

L

U

U

P

P

O

O

L

L

I

I

A

A

K

K

R

R

Y

Y

L

L

O

O

A

A

M

M

I

I

D

D

O

O

W

W

Y

Y

M

M

Elektroforezy w żelu poliakryloamidowym używa się do rozdziału cząsteczek DNA otrzymanych podczas
sekwencjonowania metodą terminacji łańcucha. Nie można tutaj zastosować elektroforezy w żelu
agarozowym, gdyż metoda ta nie ma wystarczającej rozdzielczości, to znaczy zdolności odseparowania od
siebie jednoniciowych cząsteczek DNA różniących się długością o jeden nukleotyd.

Żele poliakryloamidowe mają mniejsze pory niż żele agarozowe, co umożliwia dokładniejszy rozdział
cząsteczek DNA w zakresie wielkości. 10-1500 bp.

Żel poliakrylamidowy zbudowany jest z łańcuchów monomerów akrylamidu poprzecznie połączonych z
cząsteczkami N, N’-metylenobisakryloamidu (bis-akrylamid).

Reakcję polimeryzacji, będącą w istocie wolnorodnikową reakcją polimeryzacji, można zainicjować
chemicznie lub fotochemicznie. Przy chemicznej inicjacji procesu najczęściej stosuje się nadsiarczan amonu
w obecności katalizatora N,N,N’,N’-tetrametyletylenodiaminy (TEMED).

Żele poliakryloamidowe dodatkowo zawierają mocznik, którego właściwości denaturujące zapobiegają
tworzeniu się dwuniciowych fragmentów DNA.

E

E

l

l

e

e

k

k

t

t

r

r

o

o

f

f

o

o

r

r

e

e

z

z

a

a

p

p

o

o

l

l

i

i

a

a

k

k

r

r

y

y

l

l

a

a

m

m

i

i

d

d

o

o

w

w

a

a

D

D

N

N

A

A

Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niż 1000 par zasad.

W żelach tych można efektywnie rozdzielać także jednoniciowe fragmenty DNA i RNA.

Elektroforezę w żelach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a więc
migracja cząsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siły ciążenia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzują się
spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracją w żelu.

Rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1.

DNA w żelu poliakrylamidowym można wybarwiać za pomocą np. EtBr lub Sybr Gold.

M

M

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

b

b

i

i

o

o

l

l

o

o

g

g

i

i

i

i

m

m

o

o

l

l

e

e

k

k

u

u

l

l

a

a

r

r

n

n

e

e

j

j

Reakcja łańcuchowej polimerazy- PCR

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

Elektroforeza w żelu

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Mikromacierze (technologie „chip” DNA)

Sekwencjonowanie

Klonowanie DNA

A

A

n

n

a

a

l

l

i

i

z

z

a

a

z

z

a

a

p

p

o

o

m

m

o

o

c

c

ą

ą

r

r

e

e

a

a

k

k

c

c

j

j

i

i

P

P

C

C

R

R

Ł

Ł

a

a

ń

ń

c

c

u

u

c

c

h

h

o

o

w

w

a

a

r

r

e

e

a

a

k

k

c

c

j

j

a

a

p

p

o

o

l

l

i

i

m

m

e

e

r

r

a

a

z

z

y

y

-

-

P

P

C

C

R

R

Najważniejsza technika biologii molekularnej

Metoda opracowana w latach 80-tych XXw. W 1993 r. Kary Mullis otrzymał za opracowanie jej założeń
Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Pozwala uzyskać ze złożonej mieszaniny fragmentów DNA, np. całego genomu człowieka, miliardy kopii
ściśle określonego fragmentu DNA

Metoda PCR polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy fragmentu DNA, ograniczonego dwoma
oligonukleotydowymi starterami. Dlatego niezbędnym warunkiem przeprowadzenia takiej syntezy jest
znajomość znajomość sekwencji krótkich odcinków DNA po każdej stronie sekwencji przeznaczonej do
powielenia → startery.

O tym, który fragment będzie namnożony decydują startery, krótkie (15-30 bp) jednoniciowe fragmenty
DNA o znanej sekwencji, które przyczepiają się do matrycy DNA definiując fragment ulegający amplifikacji;
startery syntetyzuje się chemicznie.

Amplifikacja może odbywać się z minimalnej ilości wyjściowego DNA, nawet z 1 cząsteczki

Reakcja zachodzi w jednej probówce, która poza matrycowym genomowym DNA, komplementarnymi
starterami i termostabilną polimerazą DNA (polimeraza Taq) zawiera substraty do syntezy DNA w formie
trifosforanów nukleotydów, MgCl

2

oraz bufor .

Etapy cyklu reakcji PCR: denaturacja, hybrydyzacja i elongacja

Liczba cykli jest uzależniona od wymaganej krotności powielenia wyjściowego DNA

T

T

e

e

c

c

h

h

n

n

i

i

k

k

a

a

P

P

C

C

R

R

ETAP I DENATURACJA DNA 90-95°C

◦

Na początku reakcji próbka jest podgrzewana, aby rozpleść dwuniciową cząsteczkę DNA.

ETAP II PRZYŁĄCZENIE STARTERÓW 50-60°C

◦

Próbkę schładza się do temperatury, w której do odpowiedniej nici mogą przyłączyć się startery.

ETAP III ELONGACJA (POLIMERYZACJA DNA) 72°C

◦

próbka jest ponownie ogrzewana, tym razem jedynie do temperatury, w której najlepiej działa
termostabilna polimeraza DNA.

◦

W tym momencie rozpoczyna się wydłużanie startera. W ten sposób tworzą się odcinki o sekwencji
komplementarnej do badanego DNA i zaczynające się od startera.

cały cykl zmian temperatury powtarza się określoną ilość razy, tak by uzyskać odpowiednią ilość produktu.

Po zakończeniu reakcji produkt lub produkty (gdyż często celowo lub przez przypadek otrzymujemy więcej

niż jeden produkt) rozdzielane są elektroforetycznie w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, co pozwala
na ustalenie ich długości.

Ł

Ł

a

a

ń

ń

c

c

u

u

c

c

h

h

o

o

w

w

a

a

r

r

e

e

a

a

k

k

c

c

j

j

a

a

p

p

o

o

l

l

i

i

m

m

e

e

r

r

a

a

z

z

y

y

-

-

P

P

C

C

R

R

Kolejny cykl rozpoczyna się wzrostem temperatury w celu przerwania reakcji amplifikacji i ponownej
denaturacji podwójnej helisy DNA. Wraz z kolejnymi powtórzeniami cyklu liczba syntetyzowanych
fragmentów narasta wykładniczo → 2

n

(n-liczba cykli)

Po 30-40 cyklach uzyskuje się amplifikację wybranego fragmentu DNA nawet klika milionów razy.

Uzyskany materiał może być w poddawany analizie hybrydyzacyjnej, restrykcyjnej lub może być
sekwencjonowany.

N

N

a

a

j

j

w

w

a

a

ż

ż

n

n

i

i

e

e

j

j

s

s

z

z

e

e

o

o

d

d

m

m

i

i

a

a

n

n

y

y

t

t

e

e

c

c

h

h

n

n

i

i

k

k

i

i

P

P

C

C

R

R

Asymetryczny PCR

- celem asymetrycznego PCR jest amplifikacja jednoniciowego DNA o określonej długości.

Real Time PCR

Amplifikacja allelo-specyficzna

(ASA - allelo-specific amplification)

Wewnętrzny PCR

(nested PCR)

Multipleksowy PCR

(multiplex PCR)

Różnicowy PCR

(differential PCR)

Amplifikacja nieznanych sekwencji

A

A

m

m

p

p

l

l

i

i

f

f

i

i

k

k

a

a

c

c

j

j

a

a

a

a

l

l

l

l

e

e

l

l

o

o

-

-

s

s

p

p

e

e

c

c

y

y

f

f

i

i

c

c

z

z

n

n

a

a

(

(

A

A

S

S

A

A

-

-

a

a

l

l

l

l

e

e

l

l

o

o

-

-

s

s

p

p

e

e

c

c

i

i

f

f

i

i

c

c

a

a

m

m

p

p

l

l

i

i

f

f

i

i

c

c

a

a

t

t

i

i

o

o

n

n

)

)

Podstawą tej odmiany techniki PCR jest założenie, że niekomplementarność nukleotydów przy końcu 3' jednego

lub obu stosowanych primerów zapobiega elongacji końca 3' primera przez polimerazę Taq. Oczywistym
jest więc, że można tutaj stosować tylko polimerazy DNA pozbawione aktywności 3'-5' egzonukleazy.

Wydajna inicjacja syntezy DNA w takim PCR jest determinowana przez sekwencję ostatniego lub dwóch ostatnich

nukleotydów na końcu 3' primerów.

Jeśli są one komplementarne do matrycy, to badane allele są wydajnie amplifikowane, a przy braku

komplementarności dla innych alleli, amplifikacja ich jest zahamowana.

Zaleca się stosowanie krótkich primerów (np. 14 nt). Każdy allel musi być testowany w oddzielnej probówce

reakcyjnej. Stąd, ASA wymaga bezwzględnie koamplifikacji kontrolnego DNA dla sprawdzenia możliwego
zahamowania reakcji. Stosowanie takiej kontroli jest kluczowe w tej metodzie, ponieważ brak produktu w
reakcji ma takie same znaczenie diagnostyczne jak jego obecność.

A

A

S

S

A

A

j

j

e

e

s

s

t

t

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

ą

ą

w

w

y

y

k

k

r

r

y

y

w

w

a

a

n

n

i

i

a

a

p

p

o

o

l

l

i

i

m

m

o

o

r

r

f

f

i

i

z

z

m

m

u

u

a

a

l

l

l

l

e

e

l

l

i

i

,

,

i

i

s

s

t

t

n

n

i

i

e

e

n

n

i

i

a

a

p

p

u

u

n

n

k

k

t

t

o

o

w

w

y

y

c

c

h

h

m

m

u

u

t

t

a

a

c

c

j

j

i

i

i

i

j

j

e

e

s

s

t

t

w

w

y

y

k

k

o

o

r

r

z

z

y

y

s

s

t

t

y

y

w

w

a

a

n

n

a

a

d

d

o

o

:

:

wyjaśniania mechanizmu badanej choroby,

wyjaśniania ewolucyjnych powiązań między gatunkami,

badania mechanizmu działania substancji mutagennych,

wykrywania sprzężonych z chorobą genów w diagnostyce pewnych chorób,

badania zasad powstawania oporności przeciw chemioterapeutykom u mikroorganizmów,

badania powiązań genetycznych.

A

A

m

m

p

p

l

l

i

i

f

f

i

i

k

k

a

a

c

c

j

j

a

a

a

a

l

l

l

l

e

e

l

l

o

o

-

-

s

s

p

p

e

e

c

c

y

y

f

f

i

i

c

c

z

z

n

n

a

a

E

E

n

n

z

z

y

y

m

m

y

y

r

r

e

e

s

s

t

t

r

r

y

y

k

k

c

c

y

y

j

j

n

n

e

e

Odkryte w 1970 (Arbert, Nathanson, Smith)

Tną DNA na fragmenty

Występują w komórkach bakteryjnych i sinic, gdzie pełnią funkcję obronną – niszczą obce DNA (np. wirusów)

Ponieważ odpowiadają za zjawisko ograniczania (restrykcji) – stąd inna nazwa restryktazy

E

E

n

n

z

z

y

y

m

m

y

y

r

r

e

e

s

s

t

t

r

r

y

y

k

k

c

c

y

y

j

j

n

n

e

e

Dzielą się na III grupy

◦

grupa I – rozpoznają specyficzne sekwencje nukleotydów, ale przecinają cząsteczkę DNA w miejscach
odległych od tej sekwencji – bez znaczenia w biotechnologii

◦

grupa II i III – przecinają cząsteczkę DNA w obrębie rozpoznaje sekwencji (powstaje zawsze taka sama
ilość fragmentów)

W praktyce wykorzystuje się głównie grupę II

E

E

n

n

z

z

y

y

m

m

y

y

r

r

e

e

s

s

t

t

r

r

y

y

k

k

c

c

y

y

j

j

n

n

e

e

n

n

a

a

z

z

w

w

e

e

n

n

i

i

c

c

t

t

w

w

o

o

Nazwy enzymów pochodzą od nazwy:

◦

rodzajowej (litera pierwsza)

◦

gatunkowej (2 następne litery)

organizmu z którego zostały wyizolowane

Cyfra rzymska oznacza kolejny rodzaj enzymu wyizolowany z danego gatunku bakterii

Przykład:

◦

HIND III (Haemophilus influenzae serotyp D),

◦

ALU I (Arthrobacter luteus),

◦

Kpn I (Klebsiella pneumoniae)

A

A

n

n

a

a

l

l

i

i

z

z

a

a

r

r

e

e

s

s

t

t

r

r

y

y

k

k

c

c

y

y

j

j

n

n

a

a

Maja one zdolność specyficznego rozpoznawania sekwencji DNA, składających się z 4-8 nukleotydów i
przecinania nici DNA w określonym miejscu tej sekwencji lub w ściśle określonej odległości od niej.

E

E

n

n

z

z

y

y

m

m

y

y

r

r

e

e

s

s

t

t

r

r

y

y

k

k

c

c

y

y

j

j

n

n

e

e

–

–

z

z

a

a

s

s

t

t

o

o

s

s

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

Uzyskuje się powtarzalne fragmenty DNA potrzebne do m.in.:

◦

sporządzania map chromosomów

◦

klonowania genów

◦

porównywania DNA różnych organizmów

P

P

o

o

l

l

i

i

m

m

o

o

r

r

f

f

i

i

z

z

m

m

d

d

ł

ł

u

u

g

g

o

o

ś

ś

c

c

i

i

f

f

r

r

a

a

g

g

m

m

e

e

n

n

t

t

ó

ó

w

w

r

r

e

e

s

s

t

t

r

r

y

y

k

k

c

c

y

y

j

j

n

n

y

y

c

c

h

h

–

–

R

R

F

F

L

L

P

P

Allele polimorficzne lub zmiany rodzaju mutacji, najczęściej typu punktowego, często prowadzą do zanikania
lub powstawania nowych miejsc w cząsteczce DNA, rozpoznawanych i przecinanych przez dany enzym
restrykcyjny.

Zjawisko to wykorzystuje się do detekcji tych zmian za pomocą analizy restrykcyjnej. Najczęściej analiza ta
jest poprzedzona namnożeniem przy użyciu metody PCR danego regionu DNA (PCR-RFLP) np. określonego
egzonu badanego genu, gdzie występują różnice w sekwencji nukleotydów, determinujące zmienność
polimorficzną.

Uzyskany produkt amplifikacji jest następnie poddawany działaniu określonego enzymu restrykcyjnemu.
Wielkość i liczba fragmentów DNA, uzyskiwanych w wyniku trawienia danej cząsteczki DNA, jest zależna od
liczby miejsc o sekwencji rozpoznawalnej przez dany enzym restrykcyjny.

Fragmenty cząsteczek DNA można łatwo rozdzielić, stosując metodę elektroforezy w żelach agarozowych lub
poliakrylamidowych, w których fragmenty DNA poddane działaniu pola elektrycznego wędrują z prędkością
zależną od ich masy.

W ostatecznym efekcie uzyskuje się charakterystyczny dla danego allelu obraz prążków na żelu

P

P

C

C

R

R

-

-

R

R

F

F

L

L

P

P

a

a

n

n

a

a

l

l

i

i

z

z

a

a

ż

ż

e

e

l

l

u

u

M

M

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

h

h

y

y

b

b

r

r

y

y

d

d

y

y

z

z

a

a

c

c

j

j

i

i

Polega na łączeniu się ze sobą sekwencji nici kwasu nukleinowego

Wyróżnia się techniki:

◦

Southern blotting (południowa technika bibułowa) – hybrydyzacja DNA/DNA

◦

northern blotting (północna technika bibułowa) – hybrydyzacja DNA/RNA

◦

Western blotting (zachodnia) - dotyczy białek

M

M

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

h

h

y

y

b

b

r

r

y

y

d

d

y

y

z

z

a

a

c

c

j

j

i

i

Wykorzystują zdolność łączenia się jednoniciowych cząsteczek kwasów nukleinowych o całkowicie lub
częściowo komplementarnej sekwencji w struktury dwuniciowe

Jedna z nici reprezentuje badany kwas nukleinowy, a druga pełni funkcje znakowanej sondy

Hybrydyzacja Southerna

Wykrywanie swoistego fragmentu DNA przez sondę DNA znakowaną izotopem
promieniotwórczym lub barwnikiem fluorescencencyjnym

Hybrydyzację Notherna

Rozdział cząsteczek mRNA i badanie ekspresji genów

Hybrydyzacja northern (ang. northern blotting) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca detekcji

kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających
transkrypcji w komórce.

Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southerna:

* RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (elektroforezie) na żelu
* po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz utrwala na niej
* membranę z RNA inkubuje się z sondą, tzn. cząsteczką DNA lub RNA, która po pierwsze jest komplementarna

do poszukiwanej sekwencji, a po drugie daje się łatwo wykryć

* po inkubacji i odpłukaniu nadmiaru sondy przeprowadza się detekcję, czyli uwidacznianie sondy, która

związała się do poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.

Jeżeli nie interesuje nas długość wykrywanego RNA, krok pierwszy (elektroforezę) można pominąć. Wówczas RNA

nanosi się bezpośrednio na membranę.

Sonda daje na ogół sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału

po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.

F

F

I

I

S

S

H

H

–

–

f

f

l

l

u

u

o

o

r

r

e

e

s

s

c

c

e

e

n

n

c

c

y

y

j

j

n

n

a

a

h

h

y

y

b

b

r

r

y

y

d

d

y

y

z

z

a

a

c

c

j

j

a

a

i

i

n

n

s

s

i

i

t

t

u

u

Technika umożliwia wykrywanie specyficznych sekwencji DNA w chromosomach, pojedynczych komórkach i

tkankach.

Składa się z kilku etapów:
- Przygotowanie wysokiej jakości preparatów histologicznych (polega na usunięciu cytoplazmy i utrwaleniu jąder

komórkowych na szkiełku podstawowym)

- Denaturacja preparatów 70% formamidem o temp. 70ºC
- Dodanie sond molekularnych znakowanych flouroscencyjnie
- Płukanie nadmiaru sond
- Detekcja za pomocą trzech przeciwciał związanych z fluorochromami (popularnymi znacznikami

fluorescencyjnymi, używanymi do znakowania sond są rodamina i fluoresceina, a także kumaryna).

F

F

I

I

S

S

H

H

Za pomocą wyznakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej wykrywane są określone sekwencje
DNA w badanym materiale. Najczęściej stosowane fluorochromy:

• FITC – (izotiocyjanian fluoresceiny) – zielona fluorescencja;

• TRITC – (izotiocyjanian tetrametylorodaminy) – czerwona fluorescencja;

• AMCA – (amino-methylcoumarin-acetic acid) – niebieska fluorescencja.

Dzięki kombinacjom tych trzech fluorochromów można uzyskać większą liczbę barw. Aby określić położenie
sygnału stosuje się kontrastowe barwienie jądra i chromosomów.

Z

Z

a

a

s

s

t

t

o

o

s

s

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

F

F

I

I

S

S

H

H

Technika FISH może być wykorzystana do badania wielu typów komórek i tkanek.
Mogą to być limfocyty (jądra metafazowe oraz interfazowe) uzyskane w wyniku hodowli komórkowej, jak również

w bezpośrednim rozmazie krwi, rozmazy szpiku kostnego, preparaty moczu, komórki guzów
nowotworowych, blastomery, polocyty, czy amniocyty.

Technikę FISH stosuje się chętnie w przypadkach, gdy zawodzi klasyczna analiza cytogenetyczna, innymi słowy gdy

w badaniu kariotypu niemożliwe jest ustalenie dokładnego rodzaju bądź miejsca powstania mutacji w
genomie. Zastosowanie unikalnych sond umożliwia zlokalizowanie miejsc pęknięć chromosomów czy
określenie rodzaju translokacji.

FISH jest również narzędziem w badaniu anomalii genetycznych, będących markerami nowotworów

(cytogenetyka onkologiczna).

Metoda ta, obok techniki PCR, jest także nieocenioną pomocą w diagnostyce preimplantacyjnej, gdzie badanie

pojedynczej komórki polocytu czy blastomeru pozwala uniknąć podania zarodka, któremu jeden lub oboje
rodzice przekazali określone wady genetyczne . W badaniach prenatalnych z wykorzystaniem amniocytów
jako analizowanego materiału, możliwe jest określenie wady genetycznej płodu.

Hybrydyzacja fluorescencyjna jest także z powodzeniem wykorzystywana do detekcji mikroorganizmów w

materiale biologicznym.

M

M

i

i

k

k

r

r

o

o

m

m

a

a

c

c

i

i

e

e

r

r

z

z

e

e

D

D

N

N

A

A

(

(

m

m

i

i

c

c

r

r

o

o

a

a

r

r

r

r

a

a

y

y

s

s

,

,

D

D

N

N

A

A

c

c

h

h

i

i

p

p

)

)

„Chip” DNA zaprojektowano, by umożliwić przeprowadzenie jednocześnie wielu eksperymentów

hybrydyzacyjnych. Jego głównym zastosowaniem jest poszukiwanie polimorfizmów, takich jak SNP
(polimorfizmy punktowe) i porównywanie populacji RNA z różnych komórek. Może być także stosowany w
nowych metodach sekwencjonowania DNA.

C

C

o

o

t

t

o

o

j

j

e

e

s

s

t

t

m

m

i

i

k

k

r

r

o

o

m

m

a

a

c

c

i

i

e

e

r

r

z

z

?

?

Mikromacierze to szklane lub plastikowe płytki wielkości mikroskopowego szkiełka podstawowego, na
których w znanej kolejności (w rzędach i kolumnach tworzących submacierze),

◦

metodą kontaktową lub piezoelektryczną (podobną do tej stosowanej w drukarkach atramentowych)
nanoszone zostają jednoniciowe sondy cDNA (w przypadku macierzy cDNA)

◦

lub metodą fotolitografii syntetyzowane są bezpośrednio na płytkach kilkudziesięcionukleotydowe
sondy, w przypadku mikromacierzy oligonukleotydowych, tzw. chipów DNA

M

M

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

w

w

y

y

t

t

w

w

a

a

r

r

z

z

a

a

n

n

i

i

a

a

m

m

a

a

c

c

i

i

e

e

r

r

z

z

y

y

Metody wytwarzania mikromacierzy:
1) mikromacierze drukowane – gotowe sondy
(oligonukleotydy, cDNA, fragmenty produktów PCR)
nanoszone na szklaną powierzchnię przez drukarkę – robota pipetującego, wyposażoną w specjalne cienkie igły
2) macierze oligonukleotydowe – krótkie sekwencje
oligonukleotydowe syntetyzowane bezpośrednio na
powierzchni macierzy

M

M

i

i

k

k

r

r

o

o

m

m

a

a

c

c

i

i

e

e

r

r

z

z

e

e

D

D

N

N

A

A

(

(

m

m

i

i

c

c

r

r

o

o

a

a

r

r

r

r

a

a

y

y

s

s

,

,

D

D

N

N

A

A

c

c

h

h

i

i

p

p

)

)

Podstawą działania mikromacierzy jest tak, jak w tradycyjnej hybrydyzacji Southerna, komplementarność kwasów

nukleinowych.

Mikromacierz zawiera sekwencje komplementarne do badanych sekwencji. Próbkę kwasu nukleinowego

wyznakowuje się (jednym lub dwoma znacznikami fluorescencyjnymi) i hybrydyzuje z mikromacierzą

Cząsteczki wyznakowanego kwasu nukleinowego wiążą się do komplementarnych sekwencji. Obraz sczytuje się

ilościowo (za pomocą lasera lub mikroskopu). Intensywność sygnału dla poszczególnych sond mikromacierzy
jest proporcjonalna do ilości kwasu nukleinowego o danej sekwencji w próbce.

Z mikromacierzami DNA hybrydyzuje się cDNA zsyntetyzowany na matrycy badanego RNA, cRNA uzyskany na

podstawie cDNA lub DNA (dla mikromacierzy genotypujących).

Schemat przebiegu doświadczenia:
* zebranie próbki i izolacja RNA (standardowo kilka mikrogramów, zaawansowane techniki amplifikacji

pozwalają użyć RNA z zaledwie kilkuset komórek)

* synteza cDNA na matrycy wyizolowanego RNA
* synteza wyznakowanego cRNA na podstawie cDNA (lub wyznakowanie cDNA)
* hybrydyzacja wyznakowanego kwasu nukleinowego z mikromacierzą
* płukanie mikromacierzy, w celu usunięcia niesparowanych sekwencji
* skanowanie obrazu mikromacierzy
* przekształcenie obrazu w zbiór danych wartości ekspresji dla każdej sondy

M

M

i

i

k

k

r

r

o

o

m

m

a

a

c

c

i

i

e

e

r

r

z

z

e

e

c

c

D

D

N

N

A

A

RNA po izolacji jest przepisywany na komplementarny jednoniciowy DNA, przy pomocy enzymu – odwrotnej
transkryptazy (RT-PCR).

Do powstających cząsteczek DNA włączane są znakowane nukleotydy – posiadające barwnik
fluorescencyjny, co umożliwia późniejszą wizualizację i oszacowanie ilości cząsteczek.

Jedną z istotnych zalet mikromacierzy cDNA jest to, że znakując dwie próby różnymi barwnikami możemy
zbadać i porównać ekspresję genów w próbie eksperymentalnej i kontrolnej – na przykład w zmienionej
chorobowo i w zdrowej tkance.

Takie dwie próby miesza się i poddaje procesowi hybrydyzacji, podczas którego wyznakowane odcinki cDNA
łączą się komplementarnie z sondami na mikromacierzy. Połączone z sondami cDNA fluorochromy, pod
wpływem impulsów światła wzbudzanego przez lasery w skanerze emitują falę elektromagnetyczną, która
odczytywana jest przez specjalne wysokoczułe detektory i zamieniana na sygnał elektroniczny – obraz, który
podlega dalszej analizie.

W wyniku skanowania macierzy uzyskuje się oddzielne obrazy dla każdej próby, na których spoty świecą
umownymi kolorami na zielono (Cy-3, A555) i na czerwono (Cy-5, A647).

obróbka danych przebiega w komputerze - przy pomocy odpowiedniego oprogramowania (np. ScanAlyze)
wczytujemy oba uzyskane obrazy

Następnie oba obrazy nakładamy na siebie.

Na tak uzyskanym obrazie poszczególne próbki będą miały kolor (odcienie) od czerwonego poprzez żółty do
zielonego.

Interpretacja takiego obrazu jest następująca (dla ustalenia uwagi rozważony zostanie następujący problem:
zbadano ekspresję genów w komórkach zdrowych (próbka odniesienia) - cDNA wyizolowane z tych komórek
barwiono znacznikiem Cy3 i w komórkach nowotworowych (próbka testowa) - znacznik Cy5 ):

przewaga koloru zielonego w danym punkcie świadczy o tym, że gen reprezentowany przez ten punkt jest
bardziej aktywny (powstaje więcej białka kodowanego przez ten gen) w komórkach zdrowych (próbka
odniesienia).

Sytuacja odwrotna występuje gdy punkt jest czerwony, taki kolor świadczy o tym, że w większym stopniu
uległy hybrydyzacji do tego punktu cząsteczki cDNA zabarwione Cy5, czyli cDNA pochodzące z komórek
nowotworowych.

W sytuacji gdy punkt jest żółty można stwierdzić, że cDNA z obu próbek w jednakowym stopniu uległo
hybrydyzacji do tego punktu płytki genowej.

Z

Z

a

a

s

s

t

t

o

o

s

s

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

i

i

k

k

r

r

o

o

m

m

a

a

c

c

i

i

e

e

r

r

z

z

y

y

w

w

m

m

e

e

d

d

y

y

c

c

y

y

n

n

i

i

e

e

:

:

Poznawanie mechanizmów chorobotwórczych, np. wykorzystując mikromacierze wykryto m.in. geny
związane ze stwardnieniem rozsianym, ciężką dziecięcą dystrofią siatkówki

Identyfikacja wskaźników pozwalających na ocenę ryzyka rozwoju chorób

Określenie nowych obiektów, na których powinno koncentrować się działanie leków

Postawienie dokładniejszej diagnozy i dostosowanie leczenia do indywidualnego przypadku pacjenta

Diagnostyka chorób zakaźnych, np. detekcja i identyfikacja rodzaju wirusa, wykrywanie genów
odporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych

Onkologia, np. odróżnienie łagodnej formy raka prostaty od formy złośliwej

S

S

E

E

K

K

W

W

E

E

N

N

C

C

J

J

O

O

N

N

O

O

W

W

A

A

N

N

I

I

E

E

SEKWENCJONOWANIE

- to ustalenie rodzaju i kolejności nukleotydów, składających się na zapis informacji w DNA.

Na podstawie sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku, które jest
kodowane przez dany gen

Metody sekwencjonowania:

Metoda terminacji łańcucha

, zwana również metodą Sangera lub dideoksy

Metoda chemicznej degradacji DNA

, nazywana metodą Maxama i Gilberta.

Metoda sekwencjonowania oparta jest na zdolności do rozdziału jednoniciowych cząsteczek DNA, różniących się

między sobą długością tylko o jeden nukleotyd, poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. Co
oznacza, że możliwe jest rozdzielanie cząsteczek o dł. 10-1500 nukleotydów do postaci prążków widocznych
na żelu.

M

M

e

e

t

t

o

o

d

d

a

a

M

M

a

a

x

x

a

a

m

m

a

a

-

-

G

G

i

i

l

l

b

b

e

e

r

r

t

t

a

a

metoda częściowej, chemicznej degradacji oczyszczonego fragmentu DNA (wyznakowanego radioaktywnie)
z zastosowaniem 4 różnych związków, które rozszczepiają cząsteczki w specyficznych miejscach
poszczególnych nukleotydów

Po przeprowadzeniu każdej z 4 niezależnych reakcji otrzymuje się pulę różnej długości fragmentów DNA,
które rozdziela się elektroforetycznie w żelu poliakryloanidowym

Aktualnie technika ta jest rzadko stosowana

S

S

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

M

M

a

a

x

x

a

a

m

m

a

a

-

-

G

G

i

i

l

l

b

b

e

e

r

r

t

t

a

a

S

S

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

ą

ą

S

S

a

a

n

n

g

g

e

e

r

r

a

a

pierwszym zsekwencjonowanym w ten sposób genomem w historii był genom wirusa, bakteriofaga MS2,
który opisano w magazynie Nature w roku 1972.

Sekwencjonowanie Sangera opiera się na twierdzeniu, że możliwe jest kopiowanie niemal w nieskończoność
pojedynczej nici DNA bazując na komplementarności zasad azotowych ją budujących - naprzeciwko tyminy
leży zawsze adenina, zaś naprzeciwko guaniny – cytozyna.

sekwencje cząsteczki jednoniciowego DNA określa się dzięki enzymatycznej syntezie komplementarnych
łańcuchów polinukleotydowych, a reakcje są zatrzymywane losowo w pozycjach określonych nukleotydów

Proces przeprowadza się w 4 probówkach. W każdej z nich znajduje się matryca ze starterem, nukleotydy A,
C, G, T oraz jeden z czetrech rodzajów nukleotydów pozbawiony grupy 3'hydroksylowej (tzw. dideoksy ATP,
CTP, GTP, TTP)

Polimeraza DNA przesuwając się wzdłuż nici DNA wykonuje zatem kopię nici, która kończy się albo, gdy
polimeraza dojdzie do jej końca albo też gdy do mechanizmu wpadnie zmodyfikowana cegiełka, która
powoduje blokadę.

Następnym etapem sekwencjonowanie jest rozdzielenie czterech różnych mieszanin na jednym żeli
poliakrylamidowych w sąsiednich liniach. Na żelu widać tylko te fragmenty, które zwierają oznakowane
cegiełki – czyli np. rozdział mieszaniny z oznakowaną tyminą pokaże nam tylko te fragmenty nici, które
kończą się na tyminie.

nici kończące się poszczególnymi rodzajami cegiełek znajdują się w oddzielnych mieszaninach, w istocie
każda z mieszanin da wynik pokazujący miejsce tylko jednego rodzaju cegiełek. Gdy zestawimy koło siebie
wyniki dla każdej z nich otrzymamy obraz, z którego już z łatwością wydedukować możemy naszą sekwencję

S

S

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

ą

ą

S

S

a

a

n

n

g

g

e

e

r

r

a

a

S

S

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

ą

ą

S

S

a

a

n

n

g

g

e

e

r

r

a

a

S

S

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

ą

ą

S

S

a

a

n

n

g

g

e

e

r

r

a

a

Materiałem wyjściowym do sekwencjonowania jest pula identycznych jednoniciowych cząsteczek DNA.

Pierwszym etapem reakcji jest przyłączenie krótkich oligonukleotydów w tym samym miejscu każdej
cząsteczki. Oligonukleotydy te wykorzystywane są jako startery do syntezy nowej nici DNA,
komplementarnej do matrycy

Reakcja syntezy nici katalizowana jest przez polimerazę DNA

wymaga, jako substratów czterech trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) oraz
małe ilości dideoksyrybonukleotydów (ddNTP) wyznakowanych fluorochromem, które hamują elongację ze
względu na występowanie wodoru zamiast grupy hydroksylowej w pozycji 3’.

Efektem dodania do reakcji np. ddATP jest losowe zakończenie (terminacja) syntezy nowej nici w jednym z
miejsc T matrycowego DNA.

Pulę cząsteczek zakończonych ‘A’ nanosi się an pierwsza ścieżkę żelu, a obok nanosi się cząsteczki
zakończone T, G, C.

Mieszaninę jednoniciowych produktów syntezy DNA wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi
poddaje się elektroforezie w żelu, co uszeregowuje je rosnąco w zależności od ich długości (uzyskuje się
drabinkę fragmentów DNA różniących się jednym nukleotydem.) i odczytuje się rodzaj włączonego ddNTP
technikami fluorescencyjnymi.

Z

Z

n

n

a

a

c

c

z

z

e

e

n

n

i

i

e

e

m

m

e

e

t

t

o

o

d

d

y

y

s

s

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

c

c

j

j

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

a

a

D

D

N

N

A

A

• rekonstrukcja filogenezy
• genomika
• filogeografia
• ocena bioróżnorodności
• ewolucja eksperymentalna
• medycyna sądowa
• medycyna
Znaczenie sekwencjonowania ciągle rośnie a nowe metody pozwalają na skokowe zwiększenie wydajności i

zmniejszenie kosztów – genomika personalna, ale też ogromne perspektywy dla badania gatunków
niemodelowych.

N

N

o

o

w

w

e

e

s

s

e

e

k

k

w

w

e

e

n

n

a

a

t

t

o

o

r

r

y

y

Rozdział w kapilarach, a nie w żelu poliakryloamidowym

96 kanałów – 96 sekwencji (2 godziny); 1000 sekwencjowań w ciągu doby

Sekwencjonowanie cykliczne (Sears i wsp. 1992)

Wyróżnia się dwiema cechami, których nie ma metoda tradycyjna:

materiałem wyjściowym jest dsDNA (np. produkty PCR)

nie ma konieczności klonowania przed sekwencjonowaniem

wystarcza niewielka ilość DNA

Pirosekwencjonowanie

R

R

o

o

l

l

a

a

c

c

i

i

e

e

m

m

n

n

e

e

j

j

m

m

a

a

t

t

e

e

r

r

i

i

i

i

D

D

N

N

A

A

Nasze skłonności do chorób w większości wcale nie znajdują się w genach - przypuszcza się, że zapisane są
one w tzw. ciemnej materii DNA (introny)

Materiał ten na pierwszy rzut oka jest śmietnikiem i nie koduje niczego

Jak szukać informacji, jeśli nie wiemy, co jest śmieciem, a co nie?

S

S

z

z

t

t

u

u

c

c

z

z

n

n

a

a

b

b

a

a

k

k

t

t

e

e

r

r

i

i

a

a

W maju 2010 Craig Venter poinformował o stworzeniu pierwszej komórki, której kod genetyczny został w
całości wyprodukowany przez człowieka w laboratorium

Bakteria ta ma przetwarzać dwutlenek węgla na paliwo

Venter postanowił opatentować swoją metodę naukową

K

K

l

l

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

D

D

N

N

A

A

Klonowanie zrewolucjonizowało nauki biologiczne w latach 70. umożliwiając badanie pojedynczych genów.
Szeroki zakres zastosowań klonowania można podzielić na trzy kategorie:

Izolowanie genów i innych sekwencji DNA do metod in vitro, takich jak hybrydyzacja z sondą i
sekwencjonownie DNA

Tworzenie zmodyfikowanych wersji genów do ponownego wprowadzenia do organizmu w celu
badania ekspresji genu i jego regulacji

Przenoszenie genów do innego organizmu w celu otrzymania dużych ilości białka kodowanego przez
ten gen lub modyfikacji fenotypu biorcy

K

K

l

l

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

Klonowaniem DNA nazywa się wyodrębnianie i namnażanie fragmentów kwasów nukleinowych za
pośrednictwem wektorów, którymi są z reguły cząsteczki plazmidów lub wirusów, liczące kilka tyś. par
nukleotydów.

Przed klonowaniem wektory poddaje się zwykle zabiegom biotechnologicznym, polegającym na dołączeniu
krótkiego fragmentu kwasu nukleinowego (łącznika) zawierającego wiele miejsc rozpoznawanych przez
różne enzymy restrykcyjne oraz geny oporności na antybiotyki.

Obecność łącznika ułatwia wprowadzenie do wektora fragmentu obcego DNA

geny oporności na antybiotyki ułatwiają selekcję odpowiednich klonów.

W procesie klonowania zwielokrotnienie kopii danego fragmentu DNA otrzymuje się w wyniku
samopowielania cząsteczki wektora wraz z włączonym w jego strukturę obcym fragmentem kwasu
nukleinowego.

W jednej z klasycznych technik klonowania i tworzenia banków fragmentów genomu wykorzystywanym
wektorem są plazmidy.

W pierwszym etapie klonowania DNA chromosomowy jest cięty wybranym enzymem restrykcyjnym. Tym
samym enzymem są cięte cząsteczki wektora.

Następnie oba preparaty miesza się i dodaje ligazę – enzym, który łączy fragmenty DNA.

Otrzymuje się w ten sposób populację plazmidów z włączonymi w ich strukturę różnymi odcinkami
klonowanego DNA.

W celu namnożenia wystarczy niewielką część tak przygotowanej mieszaniny wprowadzić do komórek biorcy
(np. bakterii) w warunkach umożliwiających plazmidom swobodną replikację i wyselekcjonować te klony,
które zawierają plazmid z poszukiwanym fragmentem DNA.

Ostatnim etapem jest izolacja, na masową skalę DNA plazmidowego zawierającego pożądany odcinek DNA i
wycięcie go ze struktur plazmidu.

Wielkość klonowanych w plazmidach fragmentów DNA nie przekracza z reguły 10 kpz. Większe fragmenty
DNA mogą być klonowane na innych wektorach: bakteriofagi, sztuczny chromosom drożdżowy (YAC).

K

K

l

l

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

z

z

a

a

r

r

o

o

d

d

k

k

ó

ó

w

w

s

s

s

s

a

a

k

k

ó

ó

w

w

Dzięki temu możliwe jest uzyskanie wielu identycznych osobników. Wzbudza to ogromne zainteresowanie m.in.

hodowców mających nadzieje na stworzenie jak największej liczby zwierząt o pożądanych cechach.

METODY
1. Metoda izolacji blastomerów.
2. Metoda agregacji blastomerów.
3. Metoda podziału zarodków.
4. Metodą transplantacji jąder komórek zarodkowych.

Metoda izolacji blastomerów.
W miarę kolejnych podziałów zygoty powstaje wiele komórek potomnych - blastomerów. Początkowo każdy z

nich jest taki sam i teoretycznie posiada możliwość utworzenia wszystkich pozostałych komórek. Znaczy to,
że w tym stadium z każdego blastomeru może powstać cały organizm. Doświadczalnie zostało to
potwierdzone dla stadium nie przekraczającego ośmiu blastomerów. Jest to także uzależnione od gatunku.

M

M

e

e

t

t

o

o

d

d

a

a

t

t

r

r

a

a

n

n

s

s

p

p

l

l

a

a

n

n

t

t

a

a

c

c

j

j

i

i

j

j

ą

ą

d

d

e

e

r

r

k

k

o

o

m

m

ó

ó

r

r

e

e

k

k

z

z

a

a

r

r

o

o

d

d

k

k

o

o

w

w

y

y

c

c

h

h

•

Jest to jedyna metoda pozwalająca na uzyskanie klonów liczących większą liczbę osobników.

•

Usuwane są oba przedjądrza zygoty lub chromosomy z niezapłodnionych oocytów a następnie
wprowadzane są na ich miejsce jądra z blastomerów zarodków.

•

Wprowadzenie uzyskuje się rożnymi metodami : mikrochirurgiczną transplantacją , metodą fuzji
komórkowych czego odmianą jest elektrofuzja itd.

K

K

l

l

o

o

n

n

o

o

w

w

a

a

n

n

i

i

e

e

t

t

e

e

r

r

a

a

p

p

e

e

u

u

t

t

y

y

c

c

z

z

n

n

e

e

Proces klonowania terapeutycznego polega na wprowadzeniu jądra "dorosłej" komórki do "pustej" (pozbawionej

własnego jądra) komórki jajowej. Taka hybryda może następnie stworzyć nowy zarodek identyczny
genetycznie z dawcą jądra komórkowego.

Klonowanie terapeutyczne - po co?

Aby z powstałych zarodków pozyskiwać komórki macierzyste.

Komórki te potrafią przekształcić się w dowolną tkankę organizmu, np. we włókna nerwowe, komórki krwi
czy włókna mięśni.

Komórki macierzyste mogą stać się niewyczerpanym źródłem tkanek zastępczych. Początkowo niewielkie
grupy komórek wszczepiano by do organizmu w celu naprawy uszkodzeń, np. po zawale serca.

Docelowo z komórek macierzystych można by hodować całe narządy.

wątroba,

krew (przeszczep szpiku,)

siatkówka (retinopatie)

mózg (choroba Parkinsona , Alzheimera)

serce

skóra