ĆWICZENIE 8
OBIEG SIARKI W PRZYRODZIE

Obieg siarki

2

Rezerwuarem siarki jest siarka elementarna, siarczki metali i gips

(CaSO4), siarczany w wodach i lądach.

W obiegu siarki uczestniczą 3 grupy troficzne:



Bakterie fototroficzne – zielone bakterie siarkowe (Chlorobi),
purpurowe bakterie siarkowe (Chromatiaceae,
Ectothiorhodospirillaceae). Są to beztlenowce zasiedlające
środowiska ekstremalne.



Chemolitotrofy – Thiobacillus, utleniają siarkowodór, siarczki
i siarkę pierwiastkową.



Inne o nieustalonym statusie troficznym- bezbarwne bakterie
siarkowe – Beggiatoa, Thiotrix

Mikroorganizmy w obiegu siarki - fototrofy

3

Do tej grupy zalicza się:

1.

Zielone bakterie siarkowe (Chlorobi)

2.

Purpurowe bakterie siarkowe (Chromatiaceae i Ectothiorodospirillaceae)

Spotyka się je w osadach litoralu jezior (głównie jeziora słodkowodne -
Chlorobi) i w osadach morskich (piaszczyste strefy przybrzeżne -
Chromatiaceae lub wody silnie zasolone - Ectothiorodospirillaceae).
Odgrywają ważną rolę w biogeochemicznym obiegu S. W naturalnym
środowisku tworzą zakwity, widoczne gołym okiem. Do wzrostu wymagają
jednoczesnej obecności zredukowanych nieorganicznych związków siarki
(H2S) i światła.
Dużą ilość tych bakterii stwierdza się w matach bentosowych, które
zbudowane są z 5 warstw, a bakterie tworzą aż 4 warstwy.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – fototrofy beztlenowe

4

Bakterie te zasiedlają różne środowiska ekstremalne, jak źródła gorące,

polarne, hiperzasolone, kwaśne i alkaliczne środowiska wody i gleby.

Chromatiaceae (purpurowe bakterie siarkowe) zasiedlają źródła siarczkowe o

dość dużym nasłonecznieniu. Siarka u tych bakterii gromadzi się
wewnątrzkomórkowo.

Innym gatunkiem jest np. Thermochromatium tepidum żyjące w temp. 57 st. C

i nie jest zdolny do wzrostu w ciemnych warunkach mikroaerofilnych i
nigdy nie rośnie w obecności cyjanobakterii (wydzielany tlen). Jest
odpowiedzialny za produkcje materii organicznej wykorzystywanej przez
inne mikroorganizmy.

Z zielonych bakterii siarkowych na uwagę zasługuje Chlorobaculum tepidum,

występujący w kwaśnych jeziorach siarkowych, termofil, który dodatkowo
wiąże azot.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – Ectothiorodospirallaceae

5

Rodzina ta tworzy odrębna grupę filogenetyczną i zawiera bakterie

fototroficzne, chemoautotroficzne, halofilne, haloalkalofilne:
Ectothiorhodospira sp., Alkalilimicola sp., Arhodomonas sp.,
Halorodospira sp., Methylotermus sp., Nitrococcus sp.,
Thioalkalispira sp., Thioalkalovibrio sp., Thiorodospira sp.

Gatunki z rodzajów Ectothiorhodospira sp., Halorodospira sp. i

Thiorodospira sp.wiążą dodatkowo N2.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – Ectothiorodospirallaceae

6

Gatunki z tej rodziny utleniają zredukowane związki siarki

nieorganicznej do siarczanów, wydzielając do środowiska siarkę
elementarną. Węgiel zaś jest wiązany w cyklu Calvina i
wydzielają wodór do środowiska.

Dodatkowo, rodzaj Ectothiorodospira vacuolata wykorzystuje

octan, pirogronian, propionian, jabłczan i bursztynian jako źródło
węgla i donor elektronów.

Optymalne warunki dla tej rodziny to temperatura 30-40 st. C., pH

7,5-9,5 oraz zasolenie 1-6%.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – chemolitotrofy

7

Do tej grupy bakterii utleniających zredukowane nieorganiczne związki

siarki (siarkowodór, siarczki) należy dawniejszy rodzaj Thiobacillussp.,
który obecnie obejmuje kilka rodzajów: Thiobacillus sp.,
Acidithiobacillus sp., Halothiobacillus sp., Thermithiobacillus sp.,
Thiomonas sp., Parococcus sp..

Są to autotrofy, a część może żyć w warunkach heterotroficznych.

Nieliczne to miksotrofy.

Ich obecność w środowisku uzależniona jest odczynem, zasobnością

pokarmową, temperatura otoczenia.

Jednym z procesów w którym uczestniczą jest bioługowanie metali w

opuszczonych kopalniach, wykazują aktywność w hałdach węgla
kamiennego, odpadach zawierających siarczki, utleniając siarczki
metali do siarczanów metali rozpuszczalnych w wodzie.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – inne bakterie siarkowe

8

Tutaj należą tzw. bezbarwne bakterie siarkowe, tworzące trichomy, nitki

zawierające komórki bakterii, otoczone wspólna pochewką śluzowa (zwane
leukotiobakteriami), są to m.in. Beggiatoa i Thiothrix. Choc znajduja się
tutaj też bakterie nie tworzące trichomów, a mianowicie Thiovulum sp. i
Achromatium sp.

Beggatioa są to bakterie wskaźnikowe, występujące w wodach słodkich

zawierających sporo materii organicznej oraz siarczki lub siarkowodór.
Także spotkać je można w źródłach siarkowodorowych, kominach
hydrotermalnych, na powierzchniach osadów, polach ryżowych, w
bioreaktorach osadu czynnego, w zanieczyszczonych wodach morskich. W
warstwie tlenowo-beztlenowej utleniają siarkowodór do siarczanów,
powodując odtoksycznienie środowiska.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – inne bakterie siarkowe

9

Thiothrix sp. występuje w osadzie czynnym, stanowiąc rusztowanie dla

kłaczków tego osadu.

Achromatium sp.jest to duża jednokomórkowa bakteria, występująca w

osadach słodkowodnych i wodach zasolonych, an granicy fazy tlenowo –
beztlenowej, utlenia siarczki do siarki pierwiastkowej.

Mikroorganizmy w obiegu siarki – prokarionty redukujące
siarczany (PRS)

10

Oprócz wymienionych wcześniej typowych bakterii siarkowych jest spora

grupa prokariontów uczestnicząca w tak ważnym procesie, jakim jest
obieg siarki.

PRS, czyli prokarionty redukujące siarczany, wchodzą z innymi bakteriami w

związki syntroficzne. Jednym z rodzajów tego typu związków jest
sulfureta.

Powstaje on m.in. Pomiędzy Chromatium vinosum a Desulfovibrio

vulgaris, gdzie C . vinosum utlenia siarkowodór do siarczanów, produkując
związki organiczne dla D. vulgaris, który redukuje siarczany do siarkowodoru w
procesie oddychania siarczanowego.

PRS to grupa bezwzględnych beztlenowców, należąca zarówno do domeny

Bacteria jak i do domeny Archea. Wykorzystują siarczany, tiosiarczany,
politioniany, siarkę pierwiastkową, fumaran, azotan, dimetylosiarczek, Mn
(IV), Fe(III).

Mikroorganizmy w obiegu siarki – prokarionty redukujące
siarczany (PRS)

11

Są odpowiedzialne za redukcje 50-70%masy organicznej w osadach morskich

i oceanicznych. Są także powszechne w glebach, w strefie korzeniowej i
tam, gdzie są związki ropopochodne.

Należą tu rodziny z domeny Bacteria : Desulfobacteraceae,

Desulfobulbaceae, Desulfovibrionaceae, Desulfomicrobiaceae,
Syntrophobacteraceae, Syntrobacteraceae, Desulfarculaceae,
Desulfonatronumaceae, Desulfohalobiaceae, Peptococcaceae,
Thermodesulfobiaceae, Thermodesulfobacteriaceae, Nitrospiraceae;

z domeny Archeae: Archaeglobaceae, Thermoproteraceae.

Dwiczenie 9 - 10

Badanie grup bakterii redukujących siarczany i siarczyny.

Oznaczanie beztlenowych termofilnych bakterii przetrwalnikujących, redukujących

siarczany (Desulfotomaculum nigrificans) oraz beztlenowych bakterii

przetrwalnikujących redukujacych siarczyny (Clostridium)

Beztlenowe termofilne bakterie przetrwalnikujące,

redukujace siarczany (Desulfotomaculum nigrificans)

Fot. Desulfotomaculum nigrificans

• Gram-ujemne, petrichalnie urzęsione , proste lub

zakrzywione pałeczki o zaokrąglonych koocach, tworzące
przetrwalniki.

• Chemoorganotrofy rozwijające się w warunkach

beztlenowych.

• Termofile, rozwijają się w zakresie temperatur od 45 do

70

0

C (opt. 55

0

C), lecz mogą także adaptowad się do

powolnego wzrostu w temp. 30÷37

0

C

• Maja zdolnośd redukcji siarczanów do siarkowodoru,

wskutek wykorzystywania ich jako koocowe akceptory
elektronów w oddychaniu beztlenowym

Beztlenowe termofilne bakterie przetrwalnikujące, redukujące

siarczany (Desulfotomaculum sp.)

Fot. Desulfotomaculum auripigmenti

Fot. D. acetoxidans

Fot. D. geothermicum

• W obecności soli żelaza wytrąca się FeS, który nadaje

komórkom tych bakterii czarną barwę, co wykorzystuje
się do celów diagnostycznych

• Rosną na podłożach zawierających mleczany,

pirogroniany, glukozę albo alkohol etylowy, lecz nie w
obecności mrówczanów

• Występują w środowisku wodnym i w glebie

• Należą do organizmów, których działanie może stad się

przyczyną poważnych trudności w eksploatacji systemów
rozprowadzających wodę, zwłaszcza w warunkach
podwyższonej temperatury, ze względu na wywoływanie
anaerobowej korozji bakteryjnej żeliwa i stali

Beztlenowe termofilne bakterie przetrwalnikujące, redukujace siarczany

(Desulfotomaculum nigrificans) należą do rodziny

Peptococcaceae

• Wg I wyd. systematyki (Bergey’s manual…1984-1989)

Desulfotomaculum sp.

należy do

sekcji 13

Gram-dodatnie pałeczki i cocci tworzące endospory. Ponadto

bakterie redukujące siarczany i siarczyny

można znaleźd w

sekcji 7, 18, 20, 25

• Wg II wyd. tej systematyki (2001-2012) taksonomia Desulfotomaculum sp.

wygląda następująco:

Domena

: Bacteria

Typ

: Firmicutes

Klasa

: Clostridia

Rząd

: Clostridiales

Rodzina

: Peptococcaceae

Rodzaj

: Desulfotomaculum

Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące redukujące siarczyny

(Clostridium)

• Gram-dodatnie

, lecz w starych kulturach stają się Gram-ujemne. Gram+

komórki zabite działaniem podwyższonej temperatury stają się również

przeważnie Gram-

• Beztlenowe laseczki

tworzące

przetrwalniki

• Mogą byd

urzęsione

peritrichalnie

• Wiele gatunków to

saprofity

fermentuje cukry z wydzielaniem kwasu i gazu

oraz rozkładające celulozę i pektyny

• Wykazują

właściwości redukcji siarczynów do siarczków

, którą wykorzystuje

się do celów diagnostycznych

• Rodzaj ten obejmuje

ok. 60 gatunków

drobnoustrojów.

• Powszechnie występują

w glebie

oraz

przewodzie pokarmowym

ludzi i

zwierząt,

narządach rodnych kobiet

, a także w

wodzie

i

ściekach

• Niektóre

gatunki mają właściwości

chorobotwórcze

, uwarunkowane

wytwarzaniem silnych egzotoksyn, inne są drobnoustrojami

oportunistycznymi

Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące redukujące siarczyny

(Clostridium)

• Bakterie tej grupy powszechnie występują w środowisku (gleba, woda), a także w

kale ludzkim i niektórych zwierząt. Dzięki zdolności wytwarzanie przetrwalników są

oporne na znaczne wahania wartości czynników abiotycznych i cechuje je znaczna

odpornośd na działanie chloru i innych związków dezynfekcyjnych, stąd są one

ważnym wskaźnikiem zanieczyszczenia wody.

Ich obecnośd, przy nie stwierdzanym

występowaniu bakterii grupy coli, świadczy o dawno powstałym zanieczyszczeniu

wody odchodami.

• W wodach pitnych bakterie te nie mogą występowad, ilośd w innych rodzajach wód

nie jest normowana.

• Rodzaj Clostridium liczy ok. 60 gatunków, główni przedstawiciele to:

C. botulinum

– laseczka jadu kiełbasianego

C. perfringens

– laseczka zgorzeli gazowej

C. tetani

– laseczka tężca

C. difficile

– powodująca infekcie jelitowe szczególnie po kuracji antybiotykowej

C. ghoni

– występuje w narządach rodnych kobiet

C. tyrobutyricum

– występuje w skażonym mleku i serach, bakteria kwasu masłowego

Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące redukujące siarczyny (Clostridium)

Fot. C. botulinum

Fot. C. perfringens

Fot. C. tetani

Fot. Hodowla bakterii na
agarze z krwią (C. difficile)

Fot. C. difficile

Beztlenowe bakterie przetrwalnikujace redukujące

siarczyny (Clostridium) należą do rodziny

Clostridiaceae

• Wg I wyd. systematyki (Bergey’s manual…1984-1989)

Clostridium sp.

należy do

sekcji 13

Gram-dodatnie pałeczki i cocci tworzące endospory. Ponadto bakterie

wykorzystujące związki siarki można znaleźd w sekcjach

7, 18, 20, 25

• Wg II wyd. tej systematyki (2001-2012) taksonomia

Clostridium sp.

wygląda

następująco:

Domena

: Bacteria

Typ

: Firmicutes

Klasa

: Clostridia

Rząd

: Clostridiales

Rodzina

: Clostridiaceae

Rodzaj

: Clostridium

Oznaczanie bakterii redukujących

siarczany i siarczyny w wodzie

1.

Przygotowanie próbki do badao

Wodę do badao mikrobiologicznych pobiera się zgodnie z następującymi normami:
•

PN-74/C-04620/00. Woda i ścieki. Pobieranie próbek. Postanowienia ogólne i zakres normy.

Norma zawiera m.in. wytyczne ogólne, które obejmują takie zagadnienia jak: warunki prowadzenia

badao, zagadnienia dotyczące wyposażenia pracowni mikrobiologicznej, zagadnienia dotyczące

mycia szkła laboratoryjnego, unieszkodliwiania kultur drobnoustrojów, zasady wykonywania analiz

itp.

•

PN-74/C-04620/01. Woda i ścieki. Pobieranie próbek. Naczynia, przyrządy i urządzenia.

Przedmiotem arkusza normy są naczynia, przyrządy i urządzenia stosowane do pobierania i

przechowywania próbek wody i ścieków oraz sposoby przygotowywania naczyo, przyrządów i

urządzeo.

•

PN-74/C-04620/02. Woda i ścieki. Pobieranie próbek wód do analizy fizycznej, chemicznej oraz

bakteriologicznej. Norma zawiera zakres stosowanie metody, a także zagadnienia dotyczące

częstotliwości pobierania próbek, miejsca pobierania próbek oraz sposobu pobierania próbek.

Próbki wody należy rozcieoczyd przez posiewami. Przy posiewie próbki, jak i jej rozcieoczenia należy

zachowad warunki jałowości

Wykrywanie beztlenowych termofilnych bakterii przetrwalnikujących,

redukujących siarczany (Desulfotomaculum nigrificans) matodą hodowli na

pożywce płynnej

1. Zakres stosowania metody

Metodę stosuje się do wykrywania w wodzie i w osadach

powstających w środowisku wodnym bakterii

(Desulfotomaculum nigrificans)

2. Zasada metody

Wykrywanie tych bakterii polega na posianiu odpowiedniej

objętości próbki wody lub osadu na pożywkę płynną z

mleczanem sodowym i prowadzeniu hodowli w warunkach

beztlenowych, w temperaturze 55

0

C przez określony czas.

W wyniku rozwoju bakterii wydziela się siarkowodór i wytrąca

osad o barwie od szarej do czarnej

Wykrywanie beztlenowych termofilnych bakterii przetrwalnikujących,

redukujących siarczany (Desulfotomaculum nigrificans) metodą hodowli na

pożywce płynnej

Wykonanie oznaczenia

• Przygotowad odpowiednią liczbę oznakowanych probówek z

pożywką.

• Dobraną objętośd badanej próbki posiad za pomocą pipety w

taki sposób żeby uniknąd natlenienia pożywki. Następnie

wprowadzid na powierzchnię zaszczepionej pożywki 3 ml

jałowej płynnej parafiny w celu odcięcia dostępu powietrza

• Posiane próbki umieścid w cieplarce i inkubowad w

temperaturze 55

0

C przez 4 – 7 dni.

• W przypadku braku oznak wzrostu po tym czasie , inkubację

należy kontynuowad przez następne dni (maksymalnie do 1

miesiaca) i ponownie odczytad wyniki.

Wykrywanie beztlenowych termofilnych bakterii przetrwalnikujących,

redukujących siarczany (Desulfotomaculum nigrificans) metodą hodowli na

pożywce płynnej

Odczyt wyników

• O dodatnim wyniku badania świadczy ciemny nalot na

ściankach probówki oraz szaroczarny, gąbczasty osad na dnie.

W miarę rozwoju kultur warstwa nalotu i osadu grubieje,

przybierając barwę czarną

• Po usunięciu korków z probówek wyczuwalny jest

siarkowodór, którego obecnośd stanowi cechę diagnostyczną

szczególnie istotną przy nikłych makroskopowych objawach

wzrostu

• Wynik ujemny to brak zabarwienia bakterii i podłoża oraz brak

zapachu po usunieciu korka

Oznaczanie beztlenowych bakterii przetrwalnikujących redukujących siarczyny

(Clostridium) metodą hodowli na pożywce płynnej

1.

Zakres stosowania metody

Metodę stosuje się do wykrywania beztlenowych bakterii przetrwalnikujących,

redukujących siarczyny (Clostridium) w wodzie i ściekach.

2.

Zasada metody

Metoda polega na posianiu odpowiedniej objętości próbki wody lub ścieków, w której

zniszczono poprzez działanie termiczne formy wegetatywne bakterii. W wyniku

wytrącającego się siarczku żelaza pod wpływem rozwijających się bakterii pożywka

barwi się na kolor od szarego do smolistoczarnego. Hodowle prowadzi się w

warunkach beztlenowych przez określony czas

Oznaczanie beztlenowych bakterii przetrwalnikujących redukujących siarczyny

(Clostridium) metodą hodowli na pożywce płynnej

Wykonanie oznaczenia

•

Przygotowad odpowiednią liczbę oznakowanych probówek z pożywką.

•

Dobraną objętośd badanej próbki posiad za pomocą pipety w taki sposób żeby uniknąd

natlenienia pożywki. Następnie wprowadzid na powierzchnię zaszczepionej pożywki 3 ml

jałowej płynnej parafiny w celu odcięcia dostępu powietrza

•

Posiane próbki umieścid w cieplarce i inkubowad w temperaturze 37

0

C przez 24 – 48h.

•

Odczytywanie wyników. Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny,

rozwijające się w pożywce zmieniają jej barwę od szarej do czarnej. Wszystkie próbki o

zmienionej barwie pożywki od szarej do czarnej należy uznad za dodatnie