„Rozwój układu nerwowego”

(WBNZ – 818)

Jolanta Górska-Andrzejak

Neuron hipokampa szczura w hodowli komórkowej. Czerwony –tubulina, Zielony- synapsyna.

Podsumowanie:

Podsumowanie:

Badania z zakresu embriologii

klasycznej wykazały, że układ

nerwowy wykształca się w

czasie rozwoju embrionalnego

z ektodermy na skutek

indukcji ze strony tkanki

budującej tzw. organizator

Spemann’a. Dalsze badania

pozwoliły poznać także

molekularny mechanizm

indukcji układu nerwowego,

polegający na inhibicji ścieżki

sygnałowej BMP (zależnej od

BMP represji) przez induktory

neuronalne.

dpp

zapobiega

różnicowaniu

w neuroektodermę

Sog

promuje

różnicowanie

w neuroektodermę

dpp, Sog

BMP2/4,Chordina

BMP

zapobiega

różnicowaniu

w neuroektodermę

Chordina

promuje

różnicowanie

w neuroektodermę

• Zarówno u

Drosophila

jak i u

Xenopus

do wykształcenia się w

embrionie regionu neurogenicznego konieczny jest antagonizm

czynników TGF-beta, takich jak dpp/BMP, przez substancje będące
induktorami neuronalnymi, które są wytwarzane przez organizator.

Wytwarzane przez organizator

noggina, chordina

noggina, chordina

czy

czy

follistatyna

follistatyna

zapobiegają łączeniu się BMP do ektodermy i mezodermy w

pobliżu organizatora – > zapobiegają indukcji/powstaniu

w tym rejonie epidermy - zezwalają na powstanie tkanki

nerwowej.

Antagonizm BMP jest konieczny i wystarczający do indukcji

układu nerwowego, jednakże u

Drosophila

proces delaminacji

neuroblastów z regionu neurogenicznego (neuroektodermy)

zachodzi dzięki drugiej ścieżce sygnałowej –>

Notch/Delta,

która reguluje ekspresję i funkcję białek proneuralnych

będących czynnikami transkrypcji

bHLH

.

Proneuronalny system

Notch/Delta jest konserwatywny i

występuje również u kręgowców

Wykład 3

Segmentacja układu nerwowego

Różnicowanie zależne od pozycji

Układ nerwowy

D. melanogaster

Różnicowanie zależne od pozycji

Model Flagi Francuskiej

(Wolpert, 1969, 1978)

Kształtowaniem się zróżnicowanej budowy ciała

wzdłuż osi przednio-tylnej

u

Drosophila

zawiaduje hierarchiczny układ

genów regulatorowych.

Plan budowy ciała zostaje zdeterminowany już w

stadium blastodermy

-> uaktywnienie genów wyznaczających pozycję i

organizację przyszłych segmentów ciała.

• 5 grup genów tworzy hierarchiczny

układ regulacyjny.

• Geny wyższej kategorii decydują o

aktywności genów podrzędnych.

• Geny w obrębie tej samej kategorii

mogą nawzajem wpływać na swoją
aktywność

.

geny

polarności

polarności jaja

(decydują o orientacji przedniej i tylnej części ciała;

pozycja nadrzędna)

geny segmentacji

geny segmentacji

(3 kategorie; wyznaczają podział ciała na segmenty)

geny homeotyczne

geny homeotyczne

(decydują o prawidłowym zróżnicowaniu budowy każdego

segmentu zgodnie z jego pozycją wzdłuż osi przednio-

tylnej)

Geny te kodują białka typu regulatorowego, których struktura

wskazuje na to, że mogą wiązać się ze specyficznymi

sekwencjami DNA i jako czynniki transkrypcji wpływać na

aktywność innych i własnych genów.

Geny polarności jaja

Geny polarności jaja

(ang. egg polarity genes)

• Wywołują tzw.

efekt mateczny

,

gdyż ich

produkty zostają zdeponowane w oocycie, są

więc pod kontrola genotypu matki

(pod kontrolą genów matczynych; ang. maternal genes)

Bicoid

Bicoid

(

(

bcd

bcd

)

)

wyznacza

przedni

koniec ciała

• cząsteczki mRNA genu

bicoid

są syntetyzowane

w organizmie matki, w

komórkach odżywczych

jajnika, skąd przechodzą

do oocytu i gdzie od razu

zostają zakotwiczone

• po zapłodnieniu jaja na

matrycach tego mRNA

syntetyzowane jest

białko, które

rozprzestrzenia się i

tworzy gradient stężenia,

malejący ku tyłowi.

Zarodki mutantów

bcd

pozbawione są

głowy i struktur tułowiowych

bicoid

zachowuje się jak

typowy morfogen, (tzn.

substancja wywołująca

specyficzną indukcję);

cytoplazma zawierająca

białko kodowane przez ten

gen po wprowadzeniu w

dowolną okolicę mutanta

bicoid

indukuje w tym miejscu

powstanie struktur

charakterystycznych dla

przedniej części ciała.

Nanos (nos)

Nanos (nos)

gen wyznaczający tylny koniec jaja, niezbędny do powstania

segmentów

odwłokowych.

cząsteczki mRNA tego genu są

syntetyzowane w organizmie

matki.

ulega translacji w tym samym

czasie co

bicoid

.

• Syncytialna blastoderma zawiera przynajmniej

dwa przeciwstawne gradienty produktów

kodowanych przez geny polarności jaja, takich

jak

bicoid

i

nanos

.

• Białka Bicoid i Nanos dostarczają wstępnych

sygnałów pozycyjnych, które wpływają na

aktywność genów niższej kategorii (genów

segmentacji) zawężając ich ekspresję do

konkretnych regionów ciała.

hunchback i caudal

hunchback i caudal

W jaju występują także matczyne transkrypty genów

hunchback

i

caudal

.

•

hunchback

,

tak jak

bicoid

wyznacza przedni

koniec ciała

•

caudal

, tak jak

nanos

, wyznacza tylny koniec

ciała.

Zależności pomiędzy genami

Zależności pomiędzy genami

• Bicoid zapobiega translacji

caudal

w przedniej części jaja.

• Nanos powoduje inhibicję

translacji

hunchback

w tylnej

części jaja.

• Gradient

hunchback

jest

dodatkowo wzmocniony dzięki

zachodzącej transkrypcji tego

genu w przedniej części jaja=>

białko Bicoid jest czynnikiem

transkrypcji

hunchback

.

Geny Luki

(ang. GAP genes)

-pierwsze geny zygotyczne, które ulegają ekspreji wzdłuż osi

przednio-tylnej

Geny segmentacji, których mutacje

wywołują utratę dużych partii ciała (ang.

gap genes) i wczesną letalność embrionu.

(pierwsza kategoria genów segmentacji)

Np.

Krǜppel

–

ekspresja tego genu

zachodzi tylko w

środkowej części

embrionu

(zarówno w części

przedniej jak i w

tylnej jego

transkrypcja jest

hamowana przez

białka genów

polarności jaja).

Białka Bicoid,

Hunchback i Caudal

są czynnkami

transkrypcyjnymi, które

aktywują geny luki

Geny reguły

Geny reguły

parzystej

parzystej

(geny parzystości segmentów,

ang.pair-rule genes)

• geny segmentacji o bardziej lokalnym działaniu, wyznaczające

regiony tzw. parasegmentów

(zaczątków segmentacji, które

są przesunięte w stosunku do ostatecznych segmentów; 1/3

tylnej części segmentu + 2/3 segmentu następnego )

• ich mutacje wywołują brak co drugiego parasegmentu, np.

mutanty

fushi tarazu

(po japońsku: mało segmentów,

ftz

) nie

mają parasegmentów nieparzystych (brązowy), natomiast

mutanty

even-skipped

(

eve

) parzystych (fioletowy).

• Ich ekspresja zbiega się w czasie z celularyzacją;

przekształcenie blastodermy syncytialnej w komórkową.

(druga kategoria genów segmentacji)

Geny polarności segmentów

(ang. segment polarity genes)

(trzecia kategoria genów segmentacji)

Wyznaczają określoną część każdego

segmentu. Ich mRNA wykrywane jest w

formie prążków, często o szerokości jednej

komórki.

(trzecia kategoria genów segmentacji)

Ulegają ekspresji w blastodermie komórkowej, w postaci 14 prążków

• mRNA genu engrailed (en), wykrywalny jest w formie 14 prążków,

każdy o szerokości jednej komórki, zlokalizowanych w przedniej

ćwiartce poszczególnych parasegmentów.

• mRNA genu wingless (wg) – w ćwiartce tylnej. U mutantów, ta część

każdego parasegmentu zbudowana jest jak lustrzane odbicie części

pozostałej.

• Po gastrulacji gen patched ulega ekspresji, ale tylko w tych

komórkach, w których brak jest ekspresji

egrailed i hedgehog.

Ekspresja genów wspomnianych kategorii

Ekspresja genów wspomnianych kategorii

tworzy coraz to dokładniejszą mozaikę

tworzy coraz to dokładniejszą mozaikę

sygnałów pozycyjnych,

sygnałów pozycyjnych,

które dostarczają każdej z komórek

które dostarczają każdej z komórek

informacji

informacji

precyzujących jej dokładną lokalizację w

precyzujących jej dokładną lokalizację w

zarodku.

zarodku.

• Różnicują segmenty:

każdy segment

zdobywa własną

tożsamość, staje się

morfologicznie inny

od pozostałych.

Geny homeotyczne

Geny homeotyczne

(ang. homeotic genes, homeotic selector genes)

(ang. homeotic genes, homeotic selector genes)

Geny

homeotyczne

zostały odkryte

przez

Edwarda Lewisa

(1978)

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1995

Lewis znalazł mutanta muszki owocowej

(

Bithorax

), który posiadał dwie pary

skrzydeł zamiast jednej pary.

Dodatkowa para wytworzyła się na

trzecim segmencie tułowiowym, ponieważ

mutacja (w genie

ultrabitorax

)

przekształciła trzeci segment tułowiowy

w segment drugi.

Mutacja

Antennapedia

Główne geny homeotyczne występują w

Główne geny homeotyczne występują w

prawym ramieniu 3 chromosomu,

prawym ramieniu 3 chromosomu,

w postaci dwóch kompleksów genów

w postaci dwóch kompleksów genów

sprzężonych:

sprzężonych:

- Kompleks

Antennapedia

(

ANT-C

), wyznacza

różnice między segmentem głowowym a trzema

segmentami tułowia

- Kompleks

bithorax

(

BX-C

), wyznacza różnice

między segmentami tułowia a odwłoka.

Geny obu kompleksów

ułożone są w

chromosomie w takiej

samej kolejności jak

parasegmenty, których

specjalizację

wyznaczają.

Geny homeotyczne cd.

• Ich ekspresją kierują białka (zestawy białek)

kodowane zarówno przez geny polarności jaja,

jak i przez geny segmentacji.

• Ekspresja g.h.rozpoczyna się bezpośrednio

przed celularyzacją blastodermy i początkowo

jest dość rozległa.

• W miarę jak aktywowane są kolejne grupy

genów segmentacji i przybywa kodowanych

przez te geny białek regulatorowych ekspresja

genów homeotycznych staje się coraz bardziej

precyzyjna.

• Klonowanie genów homeotycznych

ANT-C

i

BX-C

wykazało, że wszystkie zawierają

sekwencję o bardzo wysokim stopniu homologii

(o długości 180 nukleotydów)

.

• Sekwencja ta, odkryta w roku 1984 i nazwana

homeoboksem

(ang. homeobox), została potem

znaleziona również w genach polarności jaja, w

wielu genach segmentacji oraz w genach

kierujących rozwojem u różnych grup

zwierząt, także u ssaków.

Homeobox

Homeobox

• Homeobox koduje domenę

białkową zwaną

homeodomeną

,

o dł. 60

aminokwasów, złożoną z

trzech fragmentów alfa-

helikalnych, tworzących

strukturę typu „heliks-skręt-

heliks”, typową dla czynników

transkrypcyjnych.

• Białka, które zawierają

homeodomenę biorą udział w

regulacji ekspresji zespołów

genów, które są ze sobą

funkcjonalnie powiązane.

Sekwencja homeoboksu występuje w

genach kierujących rozwojem u zwierząt

bezkręgowych i kręgowych.

• Posługując się sekwencją homeoboksu jako sondą do

hybrydyzacji DNA banków genomowych różnych zwierząt,

stwierdzono obecność homeoboksu w genach wielu bardzo

odległych od siebie ewolucyjnie grup:

• u nicienia

C.elegans

• u pierścienic

• u jeżowców

• u prymitywnych strunowców

• u kręgowców ( żaby, kury, myszy i człowieka)

• Geny zawierające homeoboks zostały dość dobrze poznane u

człowieka i u myszy, u których nazwano je genami

Hox

.

• Geny

Hox

występują w 4 grupach sprzężeń jako kompleksy

HOX

.

• Ułożenie genów w każdym z tych kompleksów wykazuje bardzo

duże podobieństwo do połączonych kompleksów

ANT-C

+

BX-C

u

Drosophila

: Najbardziej homologiczne w stosunku do siebie geny,

tworzące tzw. podrodziny, występują w tej samej kolejności.

Podobnie jak u

Drosophila

istnieje

ścisły związek między

kolejnością ułożenia

genów w chromosomie

a miejscem ich

aktywacji w osobniku.

• przednia granica ekspresji genu

(na przednio-tylnej osi ciała) zależy od pozycji genu w

kompleksie

• geny wykazujące ekspresję w tym samym regionie

pochodzą z tej samej podrodziny

Układ nerwowy

Układ nerwowy

• Granica ekspresji poszczególnych genów

Hox

jest bardzo wyraźna

w układzie nerwowym zarodka myszy i odpowiada kolejności tych

genów w chromosomie.

• Geny

Hox

, których ekspresja pojawia się najpierw w narządach

osiowych (system nerwowy, zawiązki kręgów), wykazują ekspresję

również w narządach obwodowych, np. kończynach. Układowi

przednio-tylnemu w narządach osiowych odpowiada układ

proksymalno-dystalny w kończynach.

=> Ten sam system regulacyjny jest stosowany wielokrotnie, w

podobny sposób na różnych etapach rozwoju

Geny

Hox

zachowały

zachowały swoje pierwotne funkcje:

• Po wprowadzeniu do

organizmu

Drosophila

genu

myszy

odpowiadającego

genowi

Antennapedia

i

spowodowaniu jego

nadmiernej ekspresji,

uzyskano muchy z odnóżami

zamiast czułków => podobnie

jak przy nadmiernej

ekspresji własnego genu.

Eliminacja wszystkich genów

Hox

u

Tribolium

–> wszystkie segmenty wyglądają tak samo

(Stuart i inni, 1993)

• A: normalny wygląd B: osobnik pozbawiony grupy genów

Hox

Kształtowanie tyłomózgowia

Funkcja genów

Hox

w różnicowaniu regionalnym układu

nerwowego kręgowców została najlepiej zbadana

w tyłomózgowiu (

rhombocephalon

).

Tyłomózgowie (

Tyłomózgowie (

rhombocephalon

rhombocephalon

)

)

Kontroluje automatyczne czynności organizmu

(oddychanie, krążenie) i ruchy ciała.

Mózg i rdzeń kręgowy kręgowców powstają

z cewy nerwowej.

• W pierwszym stadium rozwoju z przedniej części cewy nerwowej

tworzą się trzy pęcherzyki: przodomózgowie, śródmózgowie i

tyłomózgowie. W dalszym rozwoju następuje kolejny podział

przodomózgowia i tyłomózgowia.

Segmentacja tyłomózgowia kręgowców

-> 8 segmentów (rombomerów) a w każdym unikalny zestaw neuronów

unerwiających głowę.

trójdzielny

twarzowy

odwodzący

językowo-gardłowy

błędny

nerwy czaszkowe

Delecja genów

Delecja genów

Hox

Hox

w układach eksperymentalnych:

w układach eksperymentalnych:

Delecja genu

Hoxa1

u myszy wywołuje utratę rombomeru nr 5 i redukcję

rombomeru nr 4

=> brak wielu neuronów unerwiających mięśnie głowy oraz neuronów

które budują struktury mózgowe w rejonie tyłomózgowia.

Wektory:

• Wyposażone są w tzw. markery = geny

odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy

fenotypowe, np. odporność na antybiotyk;

zdolnośc do syntezy łatwo oznaczalnego enzymu

(np.

β

-galaktozydazy; komórki zawierające ten

enzym zabarwiają się na niebiesko w obecności

substratu: X-gal).

• Geny reporterowe (markerowe) mogą pochodzić z

dowolnego organizmu, jednak muszą być wyposażone

w sekwencje warunkujące ich prawidłową

transkrypcję i translację w komórkach, do których

wprowadzamy dany wektor.

Ekspresja genów

Hox

w tyłomózgowiu

• Przekrój przez tyłomózgowie 9.5

dniowego, transgenicznego embrionu

myszy.

• 2 wektory:

1) wektor zawierający gen

Lac-Z

(kodujący enzym

β

-galaktozydazę) pod

kontrolą enhansera genu

Hoxb2

=>

wywołuje ekspresję w rombomerach nr

3 i 5.
2) wektor zawierający gen kodujący

alkaliczną fosfatazę, pod kontrolą

enhansera genu

Hoxb1

=> wywołuje

ekspresję w rombomerze nr 4.

Eliminacja wszystkich genów

Hox

u

Tribolium

–> wszystkie segmenty wyglądają tak samo

(Stuart i inni, 1993)

• A: normalny wygląd B: osobnik pozbawiony grupy genów

Hox

Jak wyglądałoby tyłomózgowie

bez ekspresji genów

Hox

?

Badania na organizmach tak kręgowców jak i

Drosophila

wykazały, że produkty genów

Hox

wpływają

znacznie bardziej specyficznie na odcinki

promotorowe genów znajdujących się niżej w ścieżce

sygnałowej, jeśli wchodzą w interakcje z białkami Pbx

i Meis (kodowane przez geny zawierające

homeodomenę).

Rombomer1 – podstawowy stan (default condition)

Brak rombomerów 2-6, brak neuronów z tych miejsc.

Rybka Danio

-inaktywacja genów

Pbx

TYP DZIKI

MUTANT

-inaktywacja genów

Pbx

Regulacja ekspresji genów

Hox

u kręgowców

Czy tak jak u

Drosophila regulują ją geny luki, geny reguły

parzystej itp.?

Dotychczasowe badania wskazują na to,

że może być nieco inna niż ta, opisana

u muszki owocowej.

działanie kwasu retinowego

(pochodna witaminy A, ang. retinoic acid, RA)

Kwas retinowy to silny teratogen, który

może wywoływać wady rozwojowe.

Gradient koncentracji RA

w normalnym embrionie:

stężenie kwasu retinowego

jest około 10x większe w

tylnej części embrionu.

Embriony poddane

działaniu zwiększonego

stężęnia kwasu retinowego

nie wytwarzają struktur

głowowych, a ekspresja

genów Hox przedniej

części ciała ulega u nich

inhibicji.

bezpieczeństwo stosowania retinoidów

Od czasu wprowadzenia kwasu retinowego

do leczenia ciężkich form trądziku

(reguluje procesy metaboliczne w

naskórku) w 1982 roku, urodziło się około

tysiąc dzieci z wadami rozwojowymi

części twarzowej czaszki i mózgu.

• Kwas retinowy wnika

do wnętrza komórki

poprzez błonę

komórkową i łączy się

z receptorem

cytoplazmatycznym.

• RAR (retinoic acid

receptor) przedostaje

się do jądra

komórkowego gdzie

może regulować

ekspresję genów

poprzez interakcje z

RARE (retinoic acid

respons element).

Już Spemann i wsp. wykazali, że mogą

istnieć oddzielne organizatory głowy i

ogona.

Hipoteza Aktywatora-Transformera

• Pierwszy sygnał dochodzący z organizatora, zwany

aktywatorem, powoduje, że komórki ektodermy

nabywają cech komórek przedniej części ciała.

• Drugi sygnał, zwany transformerem, jest wymagany

do przekształcenia części tkanki nerwowej w
tyłomózgowie i rdzeń kręgowy.

(w zgodzie z tym modelem induktory neuronalne –noggina, chordina,

follistatyna- wywołują powstanie przednich struktur mózgowych, gdy są

dodane do hodowli komórek dorsalnej części embrionu; podwójny knockout

mysi noggina/chordina -> brak struktur głowowych)

Blokując sygnał BMP, induktory neuronalne

umożliwiają powstanie neuroektodermy

przedniej części ciała

Gradient RA działa jako transformer

wzmagający ekspresję genów

Hox

tylnej

części ciała.

Induktory głowy

• Cerberus – inhibuje ścieżki sygnałowe BMP

i Wnt

• frzB (frizzled)- inhibitor Wnt
• Dickkopf

Ulegją ekspresji w rejonie organizatora w czasie gdy

zachodzi indukcja; wszystkie indukują powstawanie

głowy, zwłaszcza gdy działają wraz z inhibitorami BMP.

Heads vs Tails

-rola ścieżki sygnałowej

Wnt

Inhibicja ścieżki

sygnałowej

BMP i Wnt

leży u podstaw indukcji

przednich struktur

nerwowych

-> indukcji mózgu

•

dickkopf

- gen

zaangażowany w

indukcję głowy

tBR- skrócony receptor BMP

dnXwnt8 –dominująca negatywna

forma

wnt8

Dkk1 i noggina współdziałają w indukcji głowy

(delecja jednego allelu

Dkk1

i

Nog

)

Geny

otx

• Drosophila- mózg powstaje z tzw. neuromerów-

neuromer przedni wykazuje ekspresję genu

orthodenticle

(

otd

), który jest spokrewniony z genem

bicoid

.

• Delecja tego genu u muszki owocowej powoduje że nie

posiada ona czułek ani innych struktur głowowych,

które powstają z tych segmentów preantenalnych.

• Geny homologiczne do genu

otd

muszki znaleziono

także u ssaków. Mysz, z delecją tego genu nie

wykształciła przedniej części układu nerwowego.

Ekspresja

otx2

Otx2 jest konieczne do powstania głowy w

embrionie myszy.

Wnt1, engrailed-1, fgf8

Rozwój różnych części mózgu:

Otx2 i Gbx2

- czynniki transkrypcji zawierające domenę

homeoboksu

-> podział między tyłomózgowiem a

przodomózgowiem

Już w okresie neurulacji komórki są

zróżnicowane w zależności od lokalizacji

w obrębie płytki nerwowej

.

Mapa przeznaczenia

geny

Pax

• Zawierają 2 domeny konserwatywne:

homeodomenę i domenę ang. paired box.

• 9 różnych genów

Pax

i wszystkie za wyjątkiem

Pax1

i

Pax9

, ulegają ekspresji w układzie

nerwowym.

• Homozygotyczna mutacja w genie

Pax6

-brak oczu (u człowieka, myszy i….muszki

owocowej)

• Drosophila Pax 6- eyeless

w dysku imaginalnym

odnóża

Model indukcji oka

Kształtowanie się

Kształtowanie się

grzbieto-brzusznej osi

grzbieto-brzusznej osi

cewy nerwowej

cewy nerwowej

Shh

Shh

(

(

sonic hedgehog

sonic hedgehog

–

–

ssaczy homolog genu

ssaczy homolog genu

hedgehog

hedgehog

) i

) i BMP

BMP

• Białka SHH (ang. sonic hedgehog

proteins) pochodzące ze struny

grzbietowej indukują tworzenie się

blaszki brzusznej w dolnej ścianie

cewy nerwowej. Blaszka brzuszna

także zaczyna wydzielać własne białka

SHH -> sygnał do różnicowania się

neuronów ruchowych.

• Ektoderma naskórka wydziela białka

morfogenetyczne kości (ang. bone

morphogenetic proteins, BMPs), które

są sygnałem indukującym tworzenie

się blaszki grzbietowej w górnej

ścianie cewy nerwowej. Płytka górna

również wydziela BMP, co wspomaga

różnicowanie komórek nerwowych

rogów grzbietowych.

struna grzbietowa ->

<- blaszka brzuszna

<- blaszka grzbietowa

SHH

SHH

i

i BMP

BMP

kontrolują ekspresję genów

Pax

, odpowiedzialnych za grzbieto-

brzuszne różnicownie cewy nerwowej.

Podobnie jak geny

Hox

, geny

Pax

kodują białka będące czynnikami

transkrypcyjnymi.

Indukcja układu nerwowego

-podsumowanie