2011-09-26

1

Klonowanie terapeutyczne

i komórki macierzyste

prof. Marek Mirowski
Pracownia Biologii Molekularnej i Farmakogenomiki
Zakład Biochemii Farmaceutycznej

Cloning Two Different DNA Fragments

30

Cloning: 1960’s

2011-09-26

2

31

1997: Dolly, a Cloned Mammal

Success rate: 1/277. Dolly is now dead

2011-09-26

3

Donor Egg

Skin Cell

Needle

Nucleus

(DNA)

Nucleus

(DNA)

Needle

Chemicals and

Growth Factors

Dividing cells

Neuron

Muscle cell

Pancreatic

Islet

Stem Cells

Somatic Cell Nuclear Transfer or Therapeutic Cloning

Blastocyst

Stem Cells

32

Step 1: The Egg’s Nucleus is Removed

(= the Egg is Enucleated)

33

Step 2: A Somatic Nucleus is Injected into the Enucleated Egg

34

Step 3:

The Injected Egg is Chemically Activated to Induce Nuclear Division

2011-09-26

4

Blastocyst -
from In Vitro Fertilization Clinic

Inner Cell Mass
(Stem Cells)

“Blueprint” cells

A primer on Human Embryonic Stem Cells

A Blastocyst is a hollow ball of cells

with a small clump of stem cells inside

R RC

“Blueprint”

cells

Human Embryonic Stem Cells

Pipette

Stem Cells

To remove the stem cells, the Blastocyst is opened

and the stem cells removed with a pipette

Blastocyst -

from In Vitro Fertilization Clinic

Stem Cells

“Blueprint” cells

A Blastocyst is a hollow ball of cells with a

small clump of stem cells inside

Pipette

Pipette

Stem Cells

Petri Dish

Human Embryonic Stem Cells

To remove the stem cells, the Blastocyst is

broken open and the stem cells removed with

a pipette(an ultra thin glass tube)

The stem cells are

placed in a

dish and are fed and

cared for

(each blastocyst =

1 stem cell line)

Blastocyst -

from In Vitro Fertilization Clinic

Stem Cells

“Blueprint” cells

A Blastocyst is a hollow ball of cells with a

small clump of stem cells inside

Stem Cells

“Blueprint”

cells

Neuron

Muscle

cell

Pancreatic

Islet

Petri Dish

Stem Cells

Different chemicals / molecules are added to the stem

cells to make them become specific types of cells.

Growth factors

Chemical cues

1. They can generate large

quantities of tissue rapidly

2. They can become any cell in the body

Embryonic stem

cells

Brain

Heart

Cartilage

Bone marrow

Fat

Embryonic Stem Cells

Human Embryonic Stem Cells

2011-09-26

5

Typy komórek macierzystych

Pluripotentne komórki macierzyste: in vitro
mogą różnicować się do wszystkich typów
komórek.

Multipotencjane komórki macierzyste: mogą
różnicować się do kilku typów komórek
tkanek lub organów.

Progenitorowe komórki macierzyste: mogą
różnicować się tylko do jednego typu komórki.

Cechy charakterystyczne

komórek macierzystych

• Komórki niewyspecjalizowane

• Zdolne do podziałów i samoodnawiania

przez długi okres czasu

• Zdolne do różnicowania się do wielu

różnych typów komórek

Jakie cechy komórek macierzystych

czyni

ą

je wyj

ą

tkowymi?

•

Zdolne do bardzo wielu podziałów, nie podlegaj

ą

replikacyjnemu starzeniu si

ę

typowemu dla komórek

somatycznych.

•

Aktywna telomeraza.

•

Zdolne do regeneracji/reprodukcji i ró

ż

nicowania do

ponad 200 typów tkanek obecnych w naszym ciele –
krwinki czerwone, płytki krwi, komórki typu B i T,
bazofile i inne

•

Komórki macierzyste mog

ą

by

ć

wykorzystane do

zwalczania szeregu doligliwo

ś

ci m. in. chorób

zwi

ą

zanych z procesem starzenia, chorobami

neurodegeneracyjnymi, zawałem mi

ęś

nia sercowego

i innymi.

Źródła komórek macierzystych

Blastocysta zarodka - pluripotentne

Tkanka płodowa - pluripotentne i multipotentne

Krew pępowinowa - multipotentne

Tkanki dorosłego człowieka – multipotentne

i unipotentne

2011-09-26

6

21

“Regenerative Medicine”:

Stem Cells for Repair of Diseased or Injured Tissue?

•

•

Blood

Blood

•

•

Skin

Skin

•

•

Pancreas

Pancreas

•

•

Heart

Heart

•

•

Liver

Liver

•

•

Muscle

Muscle

•

•

Brain

Brain

Stem Cells: Elixir for the 21

st

Century?

Alzheimer’s Disease

Parkinson’s Disease

Various Leukemias

Hodgkin’s Lymphoma

Non-Hodgkin’s Lymphomas Immune Deficiency Disease

Liver Failure

Heart Disease

Diabetes

Stroke

Multiple Sclerosis

Huntington’s Disease

Osteoarthritis

Rheumatoid Arthritis

Coeliac Disease

Crohn’s Disease

Lupus Erythematosus

Periodontal Disease

Sickle Cell Anaemia

Thalassemia

Psoriasis

Deafness

Blindness

Osteoporosis

Spinal Injuries

Burns

Blackfan Diamond Anaemia

Fanconi Anaemia

Terapia za pomocą komórek

macierzystych

Komórki macierzyste mogą być
wykorzystane w terapii chorób
degeneracyjnych, różnych typów
nowotworów lub znacznych uszkodzeń
tkanek

2011-09-26

7

Komórki macierzyste u dorosłoch

•

Wiele tkanek u osób dorosłych posiada
komórki macierzyste.

•

Najlepiej zbadanymi s

ą

komórki macierzyste

krwi (komórki hematopoetyczne HSC
u

ż

ywane w przeszczepach szpiku) i komórki

macierzyste neuralne.

•

Niedawno doniesiono,

ż

e komórki

macierzyste jednej tkanki dorosłego
człowieka mog

ą

funkcjonowa

ć

jak komórki

macierzyste w innej jego tkance.

22

Cell Replacement Therapy for Neurodegenerative Disease?

Parkinson’s

Huntington’s

Alzheimer’s

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)

Spinal cord injury

Multiple sclerosis (MS)

23

Theoretical example:

Cell Transplant Therapy for Parkinson’s Disease

Approaches to Stem Cell Therapies For Neurological Disease

1.

Transplantation of neural stem cells

Donor: fetal brain

Advantages

Disadvantages

•

Risk of graft vs. host disease;

Immunosuppression needed

•

Risk of graft vs. host disease;

Immunosuppression needed

Material comes from IVF clinics;
access to aborted fetal tissue not
required

Material comes from IVF clinics;
access to aborted fetal tissue not
required

Advantages

Disadvantages

Approaches to Stem Cell Therapies For Neurological Disease

2.

Transplantation of ES cell-derived neural stem cells

3.

Donor: blastocyst

2011-09-26

8

-economics

-economics

Pending legislation to criminalize procedure

Pending legislation to criminalize procedure

“somatic cell nuclear transfer”

“somatic cell nuclear transfer”

aka

aka

“therapeutic cloning”

“therapeutic cloning”

Advantages

Disadvantages

Approaches to Stem Cell Therapies For Neurological Disease

3.

Transplantation of ES cell-derived neural stem cells

Donor: nuclear transfer

42

Approaches to Stem Cell Therapies For Neurological Disease

4.

Transplantation of adult brain cells

Donor: adult brain

Advantages

Disadvantages

• Not all brain regions may respond to

the factors

• Not all brain regions may respond to

the factors

Approaches to Stem Cell Therapies For Neurological Disease

5. In vivo mobilization of endogenous brain stem cells with growth factors

Advantages

Disadvantages

43

Adult Stem Cell Plasticity:

Bone Marrow-Derived Stem Cells for Brain

Would Provide

Stem Cell Therapy without Transplantation

?

?

?

25

What Organism Should Supply the Stem Cells?

People

Animals

Lawyers

Ale czy komórki macierzyste

mogą różnicować się do komórek

nowotworowych?

2011-09-26

9

Nowotworowe komórki macierzyste

Pojedyncze komórki wewn

ą

trz nowotworów

posiadaj

ą

ce zdolno

ść

samoodnowy, która stwarza

niebezpiecze

ń

stwo powsatnia fenotypowo ró

ż

nej

populacji komórek nowotworowych stymuluj

ą

cych

dalsz

ą

tumorogenez

ę

Komórki macierzyste zdrowych tkanek

Pojedyncze komórki wewn

ą

trz narz

ą

dów

posiadaj

ą

ce zdolno

ść

samoodnowy i ró

ż

nicowania

si

ę

do wszystkich typów komórek danego narz

ą

du

Therapeutic implications of Cancer Stem Cells

• Most therapies fail to consider the difference in drug sensitivities of cancer stem cells

compared to their non-tumorigenic progeny.

• Most therapies target rapidly proliferating non-tumorigenic cells and spare the

relatively quiescent cancer stem cells.

Organizmy Modyfikowane Genetycznie (GMO)

Skrót GMO pochodzi od słów: Genetically Modified Organism – Organizm
zmodyfikowany genetycznie.

Używa się też nazwy: Organizm Transgeniczny – organizm zawierający obcy gen

tzw. transgen

GMO są to rośliny lub zwierzęta, które dzięki modyfikacji w ich genomie uzyskały
nowe cechy.

Modyfikacja genetyczna zwykle polega na wstawieniu nowego genu do genomu
modyfikowanego organizmu.

Metody tworzenia genetycznie zmodyfikowanych organizmów(GMO)

Do otrzymania organizmu GMO niezbędny jest:

• gen odpowiedzialny za biosyntezę określonego białka, który jest

wycinany z genomu dawcy lub syntetyzowany chemicznie

• sekwencje regulacyjne (promotory, terminatory, peptydy sygnałowe)

• wektor, cząsteczka DNA, która przenosi gen do genomu biorcy

(opcjonalnie)

Struktura typowego konstruktu

Promotor

Klonowany gen

Peptyd sygnalny

Terminator nos

2011-09-26

10

Metody tworzenia genetycznie zmodyfikowanych organizmów (GMO)

Cele modyfikacji:

Wytwarzanie szczepionek, leków białkowych

•

Odporność na herbicydy

•

Odporność na choroby

•

Odporność na owady

•

Odporność na niekorzystne warunki środowiska

•

Poprawa cech jakościowych oraz użytkowych

Odporność na herbicydy

Najpowszechniejsza modyfikacja (gł. soja i rzepak), pozwala na stosowanie herbicydu
(środka chwastobójczego) bez obawy o zniszczenie uprawianych roślin. Giną wtedy
chwasty, przeżywają rośliny uprawne. Do rośliny wprowadzany jest gen, który
odpowiada za produkcję enzymu rozkładającego dany herbicyd (gł. Glifosat i
glufosynat).
Glifosat - czynnik aktywny czynnik herbicydu Roundap blokuje enzym EPSPS
(5-enolpiruvilshikimate-3-phosphate synthase)

GMO

Kontrola

A tak to wygląda w polu

Przed opryskiem

Po oprysku

Roundup

Złoty ryż

Ingo Potrykus i Peter Beyer przenieśli dwa geny od narcyzów i jeden od

bakterii Erwinia uredovora do ryżu

Te geny zapewniają przemianę GGDP do prowitaminy A

2011-09-26

11

Połączenie genu GFP z promotorem zależnym od estrogenu pozwala monitorować
zanieczyszczenie wód substancjami o aktywności estrogenów,

a połączenie z stress-responsive promotor – kontrolować zanieczyszczenie wód

ciężkimi metalami i toksynami

Zwierz

ę

ta modyfikowane genetycznie



Zwierz

ę

ta transgeniczne – posiadaj

ą

ce

nowy gen lub dodatkowa kopi

ę

istniej

ą

cego genu dodane do genomu



Zwierz

ę

ta nokautowane – pozbawione w

wyniku celowanej mutacji funkcjonalnej
kopii genu

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Dwie metody tworzenia zwierz

ą

t transgenicznych –

pierwsza rozpoczyna si

ę

od izolacji zapłodnionej komórki

jajowej

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Za pomoc

ą

specjalnej igły obce DNA

wprowadzane jest do m

ę

skiego przedj

ą

drza

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Obce DNA integruje w losowych pozycjach w genomie
zwykle po jednym lub dwóch podziałach – powstałe
zwierz

ę

cz

ęś

ciowo transgeniczne

2011-09-26

12

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Je

ż

eli komórki transgeniczne przekształc

ą

si

ę

w

lini

ę

komórek płciowych – potomstwo b

ę

dzie

całkowicie transgeniczne

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Druga metoda – wprowadzanie obcego DNA do
komórek ESC (embryonic stem cells)

Zwierz

ę

ta transgeniczne



DNA wprowadzane do komórek mo

ż

e integrowa

ć

losowo lub je

ż

eli jego sekwencja jest podobna do

sekwencji genomowej mo

ż

e zaj

ść

rekombinacja

homologiczna

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Komórki ESC integrowane s

ą

z embrionem

myszy o innym kolorze futra

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Rezultatem jest chimera – komórki ESC wyw

ę

drowuj

ą

do linii komórek płciowych – powstałe zwierz

ę

produkuje

pewn

ą

ilo

ść

komórek płciowych z obcym DNA

Zwierz

ę

ta transgeniczne



Kolejne pokolenie myszy w ka

ż

dej komórce ciała

ma obce DNA

2011-09-26

13

Zwierz

ę

ta nokautowane



Nokautowane zwierz

ę

zawiera w swoich

komórkach sztucznie wywołan

ą

mutacj

ę

wybranego genu

Zwierz

ę

ta nokautowane



Proces celowanej mutacji dokonywany jest przy
wykorzystaniu komórek ESC

Zwierz

ę

ta nokautowane



Zmutowana wersja wybranego genu
wprowadzana jest do komórek ESC

Zwierz

ę

ta nokautowane



W wyniku homologicznej rekombinacji
zmutowana wersja genu wprowadzana jest do
genomu

1976

Powstaje Genentech (R. Swanson, H. Boyer)

1977

Synteza somatostatyny w bakteriach

1978

Sklonowano ludzką insulinę

1979

Sklonowano ludzki hormon wzrostu

1980

Firma Genentech wchodzi na rynek z kapitałem 35 milionów dolarów

1982

Pierwszy produkt firmy - ludzka insulina

1984

Produkcja laboratoryjna czynnika VIII (w terapii pacjentów z hemofilią)

1985

Firma wchodzi z produkcją protropiny (ludzki czynnik wzrostowy) preparat dla

upośledzonych dzieci

1987

Firma produkuje Activase (aktywator plazminogenu) rozpuszcza zakrzepy krwi u

pacjentów zawałowych

1990

Firma produkuje Actimmune (interferon

γγγγ

1

ββββ

)

1990

Fuzja z Roche (kapitał 2.1 miliarda dolarów)

5mg somatostatyny=0.5miliona mózgów owczych=kilka litrów hodowli bakteryjnej

najmniejszą ilość EGF z 150 000 litrów ludzkiego moczu

Największy sukces finansowy odniosły firmy produkujące białka terapeutyczne:
Czynniki krzepnięcia
Antykoagulanty
Insuliny
Hormon wzrostowy
Hormon stymulujacy jajeczkowanie
Czynnik hematopoezy
Interferony interlekiny

Wartość sprzedaży tych białek wyniosła 34 biliony $ w 2004
Przewidywana wartość sprzedaży w 2010 – 52.2 biliona $

Aktualne prace nad wydłużeniem czasu półtrwania (protease resistance technology,
PEGYlation) i technologiami lokowania białek w odpowiednich organach lub tkankach

2011-09-26

14

Ethanol Production

Produced via anaerobic fermentation by yeast

Corn starch is hydrolyzed to glucose monomers

Plastics

Polyhydroxyalkanoate (PHA) is a polymer made by some
microbes as a way of storing carbon

Up to 80% of the microbe’s biomass is plastic

PHA is sold to make shampoo bottles in Germany, and
disposable razors in Japan

The microbe

Pseudomonas putida

converts styrene to PHA

http://www2.unil.ch/ibpv/WWWPoirier/images/Fig1.jpg

http://www2.unil.ch/ibpv/WWWPoirier/images/Fig2.jpg