Ć

WICZENIE IX

PRZEMIANY ZWIĄZKÓW FOSFORU W GLEBIE

Fosfor jest kluczowym pierwiastkiem kontrolującym immobilizację C i N w systemach biologicznych.
Największym rezerwuarem fosforu są oceany (osady oceanów 840000 x 10

12

kg),

podczas gdy w glebach zawartość fosforu wynosi ok. 100-200 x 10

12

kg.

P wprowadzany jest do gleby
w nawozach mineralnych, z kompostem i obornikiem, w nawozach zielonych i resztkach roślinnych:
słoma roślin motylkowych zawiera 0,3-0,4% P

2

O

5

, słoma zbóż 0,15-0,3%.

Z 10

15

kg

fosfor zawartego w skorupie ziemskiej obiegowi podlega 0,1%.

P tworzy z kationami glebowymi: Ca, K, Na, Al, Fe i innymi
szereg połączeń mineralnych bardzo trudno lub wcale nierozpuszczalnych w wodzie.
Ogólna zawartość fosforu mineralnego w glebach (Polska) waha się w granicach 0,02-0,2% w przeliczeniu na P

2

O

5

,

(gleby uprawne zawierają 0,01-0,15% P

2

O

5

), w tym jedynie 0,1% to fosfor rozpuszczony w roztworze glebowym

(0,1-1 µg/g), który jest bezpośrednio dostępny dla roślin.
P znajduje się w glebie głównie w połączeniach bardzo trudno dostępnych dla roślin wyższych.

Są to mineralne związki P tj. apatyty, fosforyty. Podstawowym źródłem fosforu nieorganicznego jest niemal
nierozpuszczalny fluoroapatyt 3 Ca

3

(PO

4

)

2

x CaF

2

inne zwiazki występujące w glebie:
apatyt węglanowy

3Ca

3

(PO

4

)

2

x CaCO

3

hydroksyapatyt

3Ca

3

(PO

4

)

2

x Ca(OH)

2

oksyapatyt

Ca

3

(PO

4

)

2

x CaO

fosforan trójwapniowy

Ca

3

(PO

4

)

2

fosforan dwuwapniowy

CaHPO

4

fosforan jednowapniowy

Ca(H

2

PO

4

)

2

X w ogólnym wzorze ok. 200 form apatytów M

10

(PO

4

)

6

X może oznaczać CO

3

2-

, HO

-

, Cl

-

, F

-

.

oraz połączenia organiczne: fityna, kwasy nukleinowe, lecytyna i inne.

Fosfor przyswajalny – częściowo mineralny, częściowo organiczny (dostępny dla organizmów żywych) może być ekstrahowany z
gleby: rozcieńczonym kwasem, dwuwęglanami, żywicami.
Przy pH poniżej 6,5 fosfor jest wiązany głownie przez Al i Fe.
Nie znaleziono ścisłej korelacji pomiędzy poziomem CO

2

a rozpuszczaniem apatytów a korelacja pomiędzy zmianą pH a ilością

rozpuszczalnych fosforanów jest niska.
Stężenie fosforu w cytoplazmie roślin jest zwykle do 100 x wyższe jak w roztworze glebowym (0,1 do1 mg kg

-1

).

Ilość fosforu pobieranego przez mikroorganizmy jest wyższa niż ilość pobierana przez rośliny.
Ilość fosforu zawarta w biomasie mikrobiologicznej jest ok. 10 x wyższa niż w biomasie roślinnej.
Zawartość P w mikroorganizmach wynosi 1-2%, a w roślinach 0,05-0,1%.
Brak translokacji P w roślinach (trawach) przy stężeniu P w korzeniach 0,05%, a brak wpływu na wzrost translokacji P, gdy stężenia
P w korzeniach przekracza 0,5%.
Przyrost wzrostu roślin o ok. 10% dziennie wymaga tempa pobierania fosforu 1-2 µ mola g

-1

korzeni dzień

-1

.

Istnieje ścisła zależność pomiędzy liczbą drobnoustrojów a ilością przyswajalnego przez rośliny wyższe P.

Krążenie P w przyrodzie obejmuje procesy:

-utleniania i redukcji nieorganicznych połączeń P.

-mineralizacji organicznych związków P. z uwolnieniem ortofosforanów

-rozpuszczanie trudno przyswajalnych fosforanów tj. trójfosforan Ca i apatyt

-przetwarzanie uwolnionych fosforanów w połączenia organiczne

Przemiany mineralnych związków P odbywają się na drodze:

1.

rozpuszczania przez kwasy wytworzone przez mikroorganizmy.

Za mikroorganizmy „fosforowe” uważa się te,
które podczas swoich procesów życiowych wydzielają silnie kwasy mineralne, a także organiczne oraz CO

2.

.

Ca

3

(PO

4

)

2

+ 5H

2

O

+ 4CO

2

Ca(H

2

PO

4

)

2

•

H

2

O + 2Ca(HCO

3

)

2

Drobnoustrojami o takich właściwościach są:
bakterie siarkowe, nitryfikacyjne i w mniejszym stopniu wydzielające do podłoża kwasy organiczne.
Należą przede wszystkim do rodzajów:
Pseudomonas, Mycobacterium, Microccus, Flavobacterium, Penicillium, Aspergillus.
Mogą się rozwijać w obecności Ca

3

(PO

4

)

2

lub apatytu jako jedynego źródła P.

Rozwijają się szczególnie silnie w ryzosferze roślin motylkowych.
Ich liczebność jest zależna od: uprawy, wilgotności, temperatury, odczynu gleby.
Najwięcej jest ich w glebach piaszczystych, najmniej w ciężkich glebach ilastych.
2.

rozpuszczania poprzez reakcję wymiany

Drobnoustroje mogą przeprowadzać tę reakcję poprzez własne metabolity tworzące trwałe połączenia z jonami Ca, Fe, Al.
Podczas reakcji wymiany między tymi połączeniami i trudno przyswajalnymi fosforanami mogą uwalniać się pewne ilości kwasu
fosforowego.
Największe znaczenie dla reakcji wymiany mają metabolity typu: kwas szczawiowy, kwas galakturonowy (powstający z rozkładu
pektyn), siarczki (wytwarzane przez drobnoustroje i działające w warunkach niedoboru O

2

).

Uwalnianie fosforanów może także nastąpić pod wpływem alkalizacji środowiska.
Bakterie mogą działać na fosforany glebowe silniej niż rozpuszczalniki chemiczne.

Bakterie oraz niektóre grzyby (Penicillium, Aspergillus) rozpuszczają energicznie fosforany glebowe wtedy, gdy wyczerpią zapas
fosforanów rozpuszczalnych.
Na dużą skalę proces ten zachodzi w warunkach masowego wzrostu drobnoustrojów.

Uwalnianiu P. organicznego sprzyjają:

-wysoka temperatura

-zasadowy odczyn gleby (pożądane wapnowanie)

-warunki tlenowe

-łatwo dostępne źródło N

Niska temperatura gleby zmniejsza dostępność P dla roślin - wynika to m.in. z tego, że:
-mniejsza jest aktywność mikroorganizmów, które udostępniają P dla roślin,
-metabolizm rośliny jest spowolniony,
-mniejsza jest rozpuszczalność mineralnych związków fosforu,
-zwiększa się lepkość wody a tym samym dyfuzja wody jest spowolniona, a zatem zmniejszona jest ilość pierwiastków
dopływających do powierzchni korzenia,
-zmniejsza się tempo mineralizacji P organicznego.

Przemiany organicznych związków fosforu

Ś

rednio największą frakcję fosforu w glebie (warstwa 0-10 cm) stanowi frakcja organiczna.

W większości gleb organiczne formy fosforu mają znacznie większy udział w ogólnej zawartości tego pierwiastka niż
formy mineralne.
- Fosfor organiczny może stanowić od 30 do 50% fosforu ogólnego, jednak jego ilość może się wahać w granicach od 5
do nawet 95%.

Fosfor organiczny znajduje się w mniejszej ilości w glebach alkalicznych niż kwaśnych.

Organiczne związki P dostają się do gleby w resztkach roślinnych i szczątkach obumarłych zwierząt.

Ś

redni stosunek C:N:P w glebie wynosi ok. 150:10:1 (uprawne 119:9:1; inicjalne 80:5:1; zwietrzałe 200:10:1).

Stosunek N : P = 5 : 1 charakteryzuje bakterie glebowe i gleby inicjalne.
Stosunek C : P = 200 : 1 charakteryzuje gleby nieuprawne łąkowe i gleby zwietrzałe.

Uwalnianie kwasu fosforowego z połączeń organicznych ułatwia znaczna ilość C i N w postaci łatwo dostępnej dla drobnoustrojów.
Optymalny stosunek C:N:P. dla tego procesu wynosi

w glebach kwaśnych

60:10:1,

a w glebach zasadowych 45:11:1

Czas rezydencji fosforu organicznego wynosi ok. 1000 lat.
Pulę organicznego fosforu glebowego można uszeregować następująco:
fosforan inozytolu, polimery fosforanów organicznych, P kwasów nukleinowych i P fosfolipidów.
Z kwasów nukleinowych pochodzi średnio ok. 1% ogólnego fosforu glebowego.

Związki inozytolu fitynian (fityna)

są największym rezerwuarem fosforu organicznego,

są syntetyzowane przez

mikroorganizmy i rośliny, i są najbardziej stabilną z organicznych form fosforu w glebie, mogą stanowić do 50% całej
puli (10 – 50% )
- kwasy nukleinowe (ok. 1% 2,5%) i fosfolipidy (1 – 5%),



Podstawowe znaczenie ma w glebie fityna i jej pochodne.

Fityna jest materiałem zapasowym nasion występującym w nich w małych ilościach.
Jej duży zasób w glebie wynika z trudności jej mikrobiologicznego rozkładu.
Występuje w postaci zestryfikowanych kwasem fosforowym soli inozytolu –
w środowisku kwaśnym Fe i Al, a w środowisku zasadowym Ca i Mg.
Sole te są trudno rozkładalne, dlatego fityna stanowi w glebie źródło 50% P organicznego.

Rozkład fityny przebiega dzięki fitazom, które uwalniają stopniowo grupy fosforanowe tak, że ester sześciofosforanowy
inozytolu zmienia się w pięcio-, cztero-, trzy- i tworzy estry fosforowe.
Fitazę wytwarza Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cunninghamella, Arthrobacter.



Duże znaczenie dla wzbogacenia gleby w P mają kwasów nukleinowe.

Rozkładane są przez nukleazę do nukleotydów, a te pod wpływem nukleotydaz uwalniają kwas fosforowy.

Proces rozkładu kwasów nukleinowych może być hamowany przez minerał bentonit, który silnie sorbuje kwasy nukleinowe (w
przeciwieństwie do kaolinitu). Z rozkładu guaniny i adeniny powstają odpowiednio hipoksantyna i ksantyna.



Kolejnym źródłem P organicznego są lecytyny – wymagają do swego rozkładu dodatkowej obecności w
ś

rodowisku węglowodanów i łatwo rozkładających się połączeń azotowych.

Substraty organiczne mogą być źródłem fosforu dla roślin.
Aby stały się dostępne dla roślin, muszą być zhydrolizowane do fosforu nieorganicznego.
Proces ten katalizują enzymy- fosfohydrolazy (fosfatazy) wydzielane przez korzenie roślin i mikroorganizmy glebowe (np. grzyby mykoryzowe).
Różne gleby zawierają zróżnicowane ilości drobnoustrojów aktywnie mineralizujących połączenia organiczne.
Więcej jest ich w glebie poza strefą korzeniową niż w ryzosferze.
Organiczne związki P mineralizują głównie pałeczki i laseczki,
znacznie słabiej ziarniaki (które przeważają w ryzosferze)
Znaczny procent promieniowców i grzybów (m.in. drożdży) wykazuje duże właściwości mineralizujące takich związków organicznych jak:
glicerynofosforan, fityna, lecytyna.

Szczepionka fosforobaktyna składa się z namnożonych bakterii B. megaterium var. phosphaticum rozkładających inozytol i jego
pochodne.
Jej skuteczność zależy od rodzaju gleby, form występowania P, stosunków wodno-powietrznych, odczynu, obecności mikroflory
autochtonicznej mogącej działać antagonistycznie.

Fosforany uwalniane ze związków organicznych są w glebie:

1.

asymilowane przez rośliny i drobnoustroje wchodząc w skład np. kwasów nukleinowych.
Przy dodawaniu do gleby nawozów organicznych należy dbać o to, by stosunek N:P. w glebie wynosił 10:1, aby nie
nastąpiło związanie wszystkich fosforanów (duża ilość białka, mała węglowodanów).
P unieruchomiony w drobnoustrojach, uwolniony zostaje podczas autolizy lub przez oddziaływanie na ich szczątki innych
drobnoustrojów

2.

wypłukiwane

3.

przekształcane z łatwo rozpuszczalnych (jednowapniowych) w trudno rozpuszczalne (trójwapniowe) i odwrotnie
(regulowane odczynem środowiska)

4.

redukowane przez drobnoustroje na kwas fosforawy i fosforowodór

2H

2H

2H

H

3

PO

4

H

3

PO

3

H

3

PO

2

PH

3

co powoduje straty P z gleby.
Rośliny przyswajają fosfor jedynie w postaci jonów kwasu ortofosforowego H

2

PO

4

-

i HPO

4

-2

Objawy niedoboru fosforu w roślinie
* ciemnozielone zabarwienie starszych liści w wyniku dużej koncentracji chlorofilu w powierzchniowych tkankach;
* pojawianie się liści o fioletowym lub purpurowym zabarwieniu w miarę pogłębiania się deficytu fosforu;
* skrócone pędy;
* obumieranie pączków bocznych i ograniczony wzrost pędów bocznych;
* sztywny pokrój rośliny;
* wcześniejsze odrzucanie starszych liści, młode liście pozostają zielone;
* czasem mogą występować brązowe, matowe plamy lub uschnięte na brązowo brzegi liści;
Rośliny szczególnie wrażliwe na niedobór P to
kukurydza, rośliny kapustne, pomidor, ogórek, sałata, ziemniak, owoce cytrusowe i owoce miękkie.
Czynniki środowiskowe wpływające na ilość biodostępnego P w glebie
- typ skały macierzystej, z której powstała gleba,
- ilość substancji organicznej w glebie
- warunki klimatyczne
Na ilość biodostępnego fosforu wpływa przede wszystkim odczyn gleby
- w glebach kwaśnych powstają fosforany glinu
Al

3+

+ H

2

PO

4

- + 2H

2

O → Al(OH)

2

H

2

PO

4

+ 2 H

+

P wiąże się z uwodnionymi tlenkami żelaza i glinu tworząc (np. limonit i getyt), a także z minerałami ilastymi (kaolinit, illit,
montmorylonit)
- w glebach zasadowych powstają połączenia z wapniem
Ca(H

2

PO

4

)- + CaCO

3

→ 2CaHPO

4

+ H

2

O + CO

2

3 HPO

4

2-

+ 5CaCO

3

+ 2 H

2

O → Ca

5

(PO

4

)

3

OH + 5 HCO

3

Mechanizmy mikrobiologicznego rozpuszczania fosforanów nieorganicznych
Mikroorganizmy rozpuszczające fosforany określamy skrótem PSM (ang. Phosphate Solubilizing Microorganisms)
Mechanizmy:
- obniżanie odczynu gleby poprzez produkcję kwasów przez PSM
- chelatowanie
- reakcje wymiany
Mechanizm zakwaszania środowiska jest mechanizmem niespecyficznym, a więc zachodzącym z udziałem wielu mikroorganizmów.
Najistotniejszą rolę w rozpuszczaniu fosforanów mineralnych pełnią heterotrofy wytwarzające kwas węglowy i inne liczne kwasy
organiczne będące przejściowymi produktami w szlakach metabolicznych.

Mikroorganizmy:

Syntetyzowane kwasy organiczne:

Aspergillus niger
Penicillium sp., Aspergillus sp.
Penicillium bilaji
A. fumigatus, A. candidus
Bacillus sp.

Pseudomonas sp.
Pseudomonas cepacia
B.megatherium
Rhizobium leguminosarum, R. meliloti
P. striata

szczawiowy, cytrynowy, glukonowy, bursztynowy
szczawiowy, cytrynowy, bursztynowy, 2-ketoglukonowy
szczawiowy, cytrynowy
szczawiowy, cytrynowy, winowy
2-ketoglukonowy, bursztynowy
cytrynowy, glukonowy
glukonowy, 2-ketoglukonowy
mlekowy, jabłkowy
2-ketoglukonowy
jabłkowy, bursztynowy, fumarowy, winowy

Mechanizmy mikrobiologicznego rozpuszczania fosforanów nieorganicznych
1. W glebach o odczynie alkalicznym kwasy organiczne zakwaszają podłoże, przez co fosforany trójwapniowe
przechodzą w dwu- i jednowapniowe formy, łatwiej przyswajalne.
2. Protony z kwaśnych metabolitów mogą podstawiać się do nieorganicznych związków fosforu na miejsce innych
kationów (np.Ca

2+

).

Jony Fe

3+

i Al

3+

zawarte w glebach kwaśnych tworzą związki kompleksowe z kwasami organicznymi,

co powoduje uwalnianie P do środowiska. Możliwa jest także reakcja wymiany między fosforanami glinu i żelaza a
siarczkami wytwarzanymi przez drobnoustroje.
3. Kwasy organiczne ponadto mają zdolność do chelatowania kationów Ca

2+

i tworzą z nimi stabilne połączenia.

4. Na drodze asymilacji jonu NH

4

+

lub w procesie oddychania.

-

Protony powstające w procesie oddychania, mimo, że nie biorą bezpośredniego udziału w rozpuszczaniu, to
jednak przyczyniają się do zapoczątkowania go przez obniżanie pH,

-

protony wydzielane podczas asymilacji jonu amonowego wpływają na poziom rozpuszczania.

5. Nitryfikatory (np. Nitrosomonas, Nitrobacter) uwalniają kwas azotowy w wyniku utleniania
soli amonowych,
6. Heterotroficzne mikroorganizmy utleniające S - wiele mikroorganizmów glebowych a wśród nich:
bakterie z rodzajów: Arthrobacter, Pseudomonas, Mycobacter,
wolno żyjące grzyby: Absidia, Alternaria, Fusarium, Trichoderma,
Nawozy mineralne- fosforowe
Do produkcji nawozów fosforanowych jest wykorzystane 80% całkowitej ilości wydobywanych kopalin fosforanowych,
głównie skał osadowych fosforytów.
Fosfor zalicza się do grupy zasobów nieodnawialnych, którego zasoby geologiczne przy obecnym tempie eksploatacji
mogą być całkowicie wyczerpane w okresie 200 lat, natomiast względnie tanie, w warunkach aktualnego wykorzystania,
zostaną wyczerpane w okresie najbliższych 50 lat.
Cena fosforowych nawozów mineralnych zależy przede wszystkim od dwóch czynników:
-zawartość P

2

O

5

-zawartość metali ciężkich (głównie Cd).
Nawozy mineralne- fosforowe
W Polsce efektywność wykorzystania nawozów wynosi tylko 42%.
Jeśli w krótkim czasie po wprowadzeniu nawozu fosforowego do gleby jony fosforanowe nie zostaną pobrane przez
rośliny to ulegają one sorpcji przez fazę stałą gleby, tworząc trudno rozpuszczalne połączenia z kationami obecnymi
w roztworze glebowym lub remobilizacji przez mikroorganizmy glebowe.
Bionawozy
Bionawozy to produkty zawierające żywe szczepy wyselekcjonowanych mikroorganizmów (bakterii, grzybów i
promieniowców). Drobnoustroje te poprzez swoją aktywność mogą wzbogacać glebę w azot (wiązanie azotu) i zwiększać
pulę biodostępnych form pierwiastków tj. P i K z minerałów glebowych.
Powstająca w glebie nadważka składników odżywczych jest wykorzystywana przez rośliny

Nazwa
biopreparatu

Producent Mikrobiologiczny składnik

Provide

Kanada

Penicillium bilaji

B6 (OMEX)

RPA

B. subtilis, B.pumilis, B.laterosporus, B.chitonosporus, B. licheniformis, B. megatherium

PHOSPHERT

Indie

Azotobacter chroococum, A. vinelandii B. megatherium var. phosphaticum

BPF ‘JUWEI’

Chiny

Bacillus circulans

CBI ‘JUWEI’

Chiny

B. megatherium, B. mucilaginosus

Biosuper

Australia

Thiobacillus sp.

Symbion-P

Indie

B. megatherium var. phosphaticum

Phylazonit MC Rumunia

Azotobacter, B. megatherium

TagTeam

Kanada

Penicillium bilaji, Rhizobium

Właściwości mikroorganizmów brane pod uwagę przy selekcji do bionawozów
1. Zdolność do uruchamiania P i K z niedostępnych frakcji glebowych w obecności różnych źródeł C i N

2

.

2. Wiązanie azotu lub zdolność do wzrostu w środowisku ubogim w N (oligonitrofile).
3. Aktywność w szerokim zakresie pH i temperatur.
4. Zdolność do syntezy substancji korzystnych dla roślin (witaminy, siderofory, auksyny i cytokiny).
5. Zdolność przetrwania i zasiedlenia niszy (spory).
Grzyby mykoryzowe wykorzystują 4 mechanizmy przy przenoszeniu P do roślin:
(1) rozpuszczanie mineralnych form P poprzez kwasy organiczne i CO

2

z respiracji;

(2) eksploatacja środowiska glebowego poprzez penetrację grzybni cząsteczek SOM i makroagregatów;
(3) zdolność pobierania P przez strzępki grzybni przy niższym jego stężeniu w roztworze niż korzenie;
(4) produkcja fosfataz.

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

PRZEMIANY MINERALNYCH ZWIĄZKÓW FOSFORU

Fosfor znajduje się w glebie najczęściej w połączeniach bardzo trudno dostępnych dla roślin wyższych.
Są to przede wszystkim mineralne związki fosforu, tj: apatyty, fosforyty oraz połączenia organiczne - fityna,
kwasy nukleinowe, lecytyna. Fosfor zgromadzony w tych związkach staje się dostępny dla roślin głównie
dzięki działalności (uruchamianiu go) różnych zespołów drobnoustrojów glebowych.

Uruchamianie fosforu mineralnego w glebie

Przejście nierozpuszczalnych fosforanów w stan rozpuszczalny zachodzi pod wpływem działania

specyficznych drobnoustrojów, a także w następstwie oddziaływania na fosforany wytworzonych przez
mikroorganizmy kwasów.

Przygotowanie podłoża:

Podłoże PN - do oznaczania zdolności do rozpuszczania
nieorganicznego fosforu
Roztwór A:
K

2

SO

4

0.2g

MgSO

4

×

7H

2

O

0.4g

hydrolizat kazeiny 0.2g
asparagina

1.0g

glukoza

10.0g

H

2

O jał.

do 1000ml

Agar

17.0g

Roztwór B:

B1 – Na

3

PO

4

×

12H2O

10.9g w 100ml

B2 – CaCl

2

22.0g w 100ml

Na płytkę wylać 0.7 ml roztworu B1 i 0.3 ml roztworu B2, a
następnie 20 ml roztworu B1. Dokładnie wymieszać i pozostawić do
zastygnięcia, prawidłowo wylana powinna płytka powinna być
jednolicie mętna (powstaje biało-mleczny strąt Ca

3

(PO

4

)

2

.

Wykonanie ćwiczenia:
0,1 ml odpowiedniego rozcieńczenia glebowego przenieś jałowo na podłoże PN.
Po okresie inkubacji (1 tydzień) policz kolonie otoczone przezroczystymi strefami

.

ROZKŁAD ORGANICZNYCH ZWIĄZKÓW FOSFORU

Oznaczanie aktywności fosfataz w glebie

Fosfatazy katalizują hydrolityczne rozbicie wiązania estrowego w różnych fosforanach organicznych.

Wszystkie fosfatazy działają na ten sam typ substratów, a podział ich przeprowadzamy na podstawie optimum
pH, w którym katalizują reakcję.
Optimum pH dla fosfataz alkalicznych wynosi 9,2 - 9,6 a dla fosfataz kwaśnych 3,4 - 6,2.

Aktywność enzymu określamy na podstawie ilościowego oznaczania produktu reakcji.

Jako substratu używamy fenylofosforanu sodu.

Reakcja ma następujący przebieg:
C

6

H

5

-O-PO(OH)

2

+ H

2

O -------> C

6

H

5

OH + H

3

PO

4

Przebieg analizy
Odważkę 5 g gleby (przesianej i suchej) przenosimy do kolby stożkowej
i dokładnie mieszamy z 2,5 ml toluenu.
Po 15 min.
dodajemy 20 ml roztworu fenylofosforanu sodowego w buforze boranowym o pH 9.4,
a do próby kontrolnej 20 ml buforu boranowego o pH 9.4
i umieszczamy na 1.0 godzinę w temperaturze 28

o

C.

Po inkubacji dodajemy 100 ml H

2

O i przesączamy przez twardy sączek.

0 Oznaczanie ilości wytworzonego fosforanu:
Do 5 ml próbki dodajemy kolejno:

- 2 ml 3 N H

2

SO

4

- 1 ml 7.5% molibdenianu sodu w 3 N H

2

SO

4

- 1 ml 0.03% roztworu SnCl

2

x 2H

2

O + 0,3% siarczanu hydrazyny w 1 N H

2

SO

4

- uzupełniamy wodą destylowaną do 10 ml
Po dodaniu każdego z odczynników próbkę należy wymieszać.
Po 10 min. Odczytujemy wartość Abs prób przy 670 nm, a ilość uwolnionego fosforanu obliczamy stosując
wzór: Cp=Abs/K

Współczynnik K został wyznaczony na podstawie krzywej kalibracyjnej.

K=2,232