roślina

Protoplast Kultura kalusowa Kultura tkankowa

Fizjologia roślin M-2

Skrypt do dwiczeo

Instytut Biologii Eksperymentalnej Roślin

Warszawa 2010

1

Zarówno biolog molekularny jak i biotechnolog często prowadzi eksperymenty na roślinach.

Badania takie wymagają przygotowania odpowiedniego materiału roślinnego. W zależności od potrzeb i

celu doświadczeo używane są całe rośliny, tkanki, zawiesiny komórkowe bądź izolowane protoplasty.

Eksperymentator nie tylko powinien umied przygotowad materiał badawczy tzn. wyhodowad w

kontrolowanych warunkach rośliny, tkanki lub komórki, ale również zdawad sobie sprawę z ograniczeo

oraz interpretacji wyników w zależności od użytego materiału roślinnego.

Kontrolowane warunki hodowli są bardzo istotną sprawą przy powtórzeniu doświadczeo. Warunki

takie zapewniają komory fitotronowe, w których rośliny mogą rosnąd na różnorodnych podłożach.

Umiejętnośd dobrania odpowiednich warunków (długośd dnia, temperatura, podłoże, skład pożywki) to

bardzo istotne czynniki wpływające na wzrost roślin. Często w badaniach stosuje się tzw. kultury in vitro

(tkankowe bądź komórkowe). Materiał taki jest nieco trudniejszy do otrzymania, ale za to daje większe

możliwości wprowadzania do wnętrza komórki różnych związków oraz, co bardzo istotne dla biologa

molekularnego lub biotechnologa, manipulacji na poziomie genu. Kultury tkankowe in vitro dały np.

możliwośd szybkiego uzyskiwania jednorodnych genetycznie roślin (mikrorozmnażanie). Izolowane

protoplasty – komórki pozbawione ścian komórkowych używane są do badao metabolizmu, ale przede

wszystkim umożliwiają transformacje genetyczne tj. wprowadzenie określonych genów do komórki

roślinnej.

Dwiczenia będą uczyły podstawowych technik hodowli materiału roślinnego. Zaznajomią z

funkcjonowaniem komór fitotronowych, warunków szklarniowych, przygotowaniem podłoża oraz metodą

kultur hydroponicznych. Pokażą jak założyd i prowadzid kultury in vitro oraz nauczą podstawowych technik

manipulacji. Podczas zajęd postaramy się również zaznajomid Paostwa z podstawami izolacji organelli

roślinnych oraz oznaczeniami biochemicznymi, którymi możemy charakteryzowad materiał roślinny.

Dwiczenia nie są ilustracją wykładu, natomiast mamy nadzieję, ze zachęcą Paostwa do udziału w innych

zajęciach fakultatywnych IBER rozszerzających wiedzę na temat funkcjonowania roślin.

Dwiczenia będą prowadzone przez Zespół Pracowników Instytutu Biologii Eksperymentalnej

Roślin z Zakładów: Bioenergetyki Roślin, Anatomii i Cytologii Roślin, przy udziale Pracowni Fitotronowej.

Dwiczenia będą trwały przez połowę semestru, w każdym tygodniu w dwóch kolejnych dniach. Obecnośd

na wszystkich zajęciach jest obowiązkowa, zarówno w pierwszym jak i drugim dniu zajęd. Kolokwium

koocowe będzie dotyczyło materiału omawianego na zajęciach.

Anna Rychter

2

Spis dwiczeo:

Zadanie 1. Kultury roślinne (mgr Monika Ostaszewska, Zakład Bioenergetyki Roślin)
Zadanie 2. Kultury tkanek roślinnych in vitro, organogeneza (dr Izabela Juszczuk, Zakład
Bioenergetyki Roślin)
Zadanie 3. Otrzymywanie kultury zawiesinowej (mgr Katarzyna Tracz, Zakład Anatomii i
Cytologii Roślin)
Zadanie 4. Izolacja protoplastów (dr Bożena Szal, Zakład Bioenergetyki Roślin)
Zadanie 5. Oznaczanie stężenia chlorofilu i ATP w tkankach roślinnych (dr Bożena Szal,
Zakład Bioenergetyki Roślin)
Zadanie 6. Podstawy izolacji i charakterystyki organelli (dr Izabela Juszczuk, Zakład
Bioenergetyki Roślin

Plan dwiczeo:

Data

Grupa I A
11.00 - 13.00

Grupa I B
11.00 - 13.00

Grupa II A
13.45 - 15.45

Grupa II B
13.45 - 15.45

5. 10. 2010

Zadanie 2

Zadanie 4

Zadanie 2

Zadanie 4

6. 10. 2010

Zadanie 2

Zadanie 4

Zadanie 2

Zadanie 4

12. 10. 2010

Zadanie 1

Zadanie 2

Zadanie 1

Zadanie 2

13. 10. 2010

Zadanie 1

Zadanie 2

Zadanie 1

Zadanie 2

19. 10. 2010

Zadanie 3

Zadanie 1

Zadanie 3

Zadanie 1

20. 10. 2010

Zadanie 3

Zadanie 1

Zadanie 3

Zadanie 1

26. 10. 2010

Zadanie 4

Zadanie 3

Zadanie 4

Zadanie 3

27. 10. 2010

Zadanie 4

Zadanie 3

Zadanie 4

Zadanie 3

2. 11. 2010

Zad. 2/Zad. 3

Zadanie 5

Zad. 2/Zad. 3

Zadanie 5

3. 11. 2010

Zadanie 1

Zadanie 6

Zadanie 1

Zadanie 6

9. 11. 2010

Zadanie 5

Zad. 2/Zad. 3

Zadanie 5

Zad. 2/Zad. 3

10. 11. 2010

Zadanie 6

Zadanie 1

Zadanie 6

Zadanie 1

16. 11. 2010

Konsultacje

Konsultacje

Konsultacje

Konsultacje

17. 11. 2010

Egzamin

Egzamin

Egzamin

Egzamin

3

Dwiczenie 1. Kultury roślinne

Celem dwiczenia jest poznanie podstawowych sposobów prowadzenia kultur roślin

stanowiących materiał eksperymentalny lub będących źródłem tkanek do innych doświadczeo.

Doświadczenie umożliwia także obserwację skutków niewłaściwego prowadzenia kultur -

deficytu fosforu (P) oraz symbiozę bakterii rodzaju Rhizobium z korzeniami roślin motylkowych

na przykładzie fasoli.

Materiałem na dwiczeniach są rośliny fasoli (Phaseolus vulgaris) i rzodkiewnika (Arabidopsis

thaliana) hodowane w kulturze hydroponicznej, na naturalnym i sztucznym podłożu stałym oraz

w kulturze in vitro na pożywce zestalonej agarem. Hodowle prowadzone są w komorach

fitotronowych oraz w szklarni.

Kultury roślinne zostają założone w drugim tygodniu dwiczeo, zaś obserwacje i pielęgnacja kultur

prowadzona jest przez trzy następne tygodnie.

1 dzieo doświadczenia:

Kultura hydroponiczna:

Przygotowad 3 pojemniki do hodowli hydroponicznej fasoli oraz 2 do hodowli

rzodkiewnika.

Przygotowad pożywki Knopa (pożywkę pełną lub bez fosforu) wg wskazao osoby

prowadzącej.

Kultura torfowa i perlitowa

Przygotowad 12 doniczek z substratem torfowym, podlad wodą dejonizowaną.

Przygotowad 4 doniczki z perlitem, podlad wodą dejonizowaną.

Hodowla w pojemnikach typu „rhizobox”

Przygotowad pojemnik do hodowli napełniając go substratem torfowym, podlad wodą

dejonizowaną.

Kultura in vitro

Przygotowad słoiki do kultur in vitro (3 szt.) i szalki szklane 10 cm (9 szt.).

Przygotowad pożywkę Murashige-Skooga (MS).

Do erlenmayerki na 200 ml odważyd 600 mg agaru i dodad 90 ml pożywki MS. Rozpuścid

agar podgrzewając zawartośd erlenmayerki w kuchence mikrofalowej. Do każdego

słoiczka wylad po ok. 30 ml pożywki z agarem.

4

Do dwóch erlenmayerek na 200 ml odważyd po 600 mg agaru i dodad po 90 ml pożywki

MS. Rozpuścid agar podgrzewając zawartośd erlenmayerek w kuchence mikrofalowej,

erlenmayerki zamknąd folią aluminiową.

Przygotowad do sterylizacji koocówki do pipet automatycznych (żółte).

Szklane pipety Pasteura (15 szt.) zawinąd w folię aluminiową.

2 butelki (o poj. 100 ml) napełnid wodą destylowaną do 1/2 objętości, 1 butelkę napełnid

pożywką MS (bez agaru).

Sterylizowad wszystko w autoklawie w temp. 121°C.

2 dzieo doświadczenia

Kultura hydroponiczna

1 pojemnik do kultur hydroponicznych (do hodowli fasoli) napełnid pożywką pełną Knopa

1 pojemnik (do hodowli fasoli) napełnid pożywką Knopa -P.

1 pojemnik (do hodowli fasoli) napełnid wodą dejonizowaną.

Skiełkowane nasiona fasoli umieścid w pokrywkach, przykryd wilgotną gazą.

Koszyczki do hodowli rzodkiewnika (umieszczone w odpowiednich pojemnikach) napełnid

1% agarem w pożywce MS.

Nasiona rzodkiewnika zawieszone w 0,2% pożywce MS wysiad do koszyczków (przykryd

pokrywami).

Pojemniki ustawid w komorze fitotronowej.

Kultura torfowa

Skiełkowane nasiona fasoli umieścid w 8 doniczkach z substratem torfowym (5-6 na

doniczkę), podlad wodą dejonizowaną.

W 4 doniczkach z substratem torfowym umieścid skiełkowane nasiona fasoli (5-6 na

doniczkę), uprzednio umoczone w zawiesinie Rhizobium.

Doniczki umieścid w szklarni.

Kultura na perlicie

Skiełkowane nasiona fasoli wysadzid do doniczek z perlitem (5-6 na doniczkę) po

uprzednim umoczeniu w zawiesinie Rhizobium.

Doniczki umieścid w szklarni

Hodowla w pojemnikach typu „rhizobox”

Skiełkowane nasiona fasoli wysadzid do pojemnika (ewentualnie po uprzednim

umoczeniu w roztworze Rhizobium wg wskazania osoby prowadzącej).

5

Pojemniki umieścid w szklarni pod odpowiednim kątem (wg wskazao osoby

prowadzącej).

Kultura in vitro

Nasiona rzodkiewnika umieścid w probówce Eppendorfa, dodad 1 ml 70% etanolu,

wstrząsad przez 2 min.

Usunąd etanol, dodad 5% wodny roztwór wody Javelle'a + TWEEN 20 (w proporcji 1

kropla na 50 ml). Sterylizowad nasiona przez 15 min. wytrząsając.

NASTĘPNE CZYNNOŚCI PRZEPROWADZAMY W KOMORZE LAMINARNEJ

Usunąd roztwór sterylizujący, płukad nasiona w 5-ciu zmianach sterylnej wody po 5 min.

Usunąd wodę, dodad sterylną pożywkę.

Zawiesinę nasion wysiad sterylnie pipetą do słoików i na szalki wg wskazao

prowadzącego.

Słoiki zamknąd pokrywkami z filtrem, szalki zakleid parafilmem.

Słoiczki i szalki wyjąd z laminaru, podpisad i umieścid w komorze do hodowli w temp.

21°C (fotoperiod 16 godz).

W następnym tygodniu:

Kultura hydroponiczna

Oznaczyd pH zużytej pożywki.

Wymienid pożywkę w pojemnikach na świeżą.

Usunąd liścienie z roślin.

Hodowle na podłożu stałym

Podlad pożywką kontrolną 4 doniczki z substratem torfowym i doniczki z perlitem.

Podlad pożywką 4x stężoną 4 doniczki z substratem torfowym.

Podlad pożywką (bez azotu) pojemniki z nasionami moczonymi w roztworze Rhizobium.

Kultura in vitro

Porównad morfologię korzeni siewek rosnących w słoikach i w pionowo umieszczonych

szalkach.

Kolejny tydzieo:

Kultura hydroponiczna

Porównad wzrost roślin w poszczególnych pojemnikach (pożywka pełna, pożywka -P,

woda dejonizowana).

6

Oznaczyd pH zużytej pożywki.

Wymienid pożywki na świeże.

Hodowle na podłożu stałym

Porównad wzrost roślin podlewanych pożywką kontrolną i 4x stężoną.

Porównad wzrost roślin hodowanych na podłożu torfowym i perlicie.

Zaobserwowad wzrost korzeni w rhizobox’ach.

Kolejny tydzieo:

Podsumowanie hodowli wg wskazao osoby prowadzącej.

Przygotowanie pożywek

POŻYWKA KNOPA (do kultur hydroponicznych)
1/ Przygotowujemy po 1 l wyjściowych roztworów soli w następujących stężeniach:
Ca(NO

3

)

2

-

144 g/l, KNO

3

- 30 g/l, MgSO

4

- 68 g/l , KH

2

PO

4

- 30 g/l, KCl - 30 g/l

Z każdego z w/w roztworów wyjściowych bierzemy po 5 ml na 1 l pożywki, poza tym:
Fe EDTA 28 g/l (1 ml na 1 l pożywki)

2/ Roztwór wyjściowy mikroelementów
W 1 l wody dejonizowanej rozpuszczamy:
50 mg CuSO

4

x 5 H

2

O, 100 mg ZnSO

4

x 7 H

2

O, 50 mg Co(NO

3

)

2

x 6 H

2

O, 50 mg Al

2

(SO

4

)

3

, 350 mg MnCl

2

x 4 H

2

O, 50 mg

NiSO

4

x 4 H

2

O, 5 mg KJ, 25 mg KBr, 50 mg Na

2

MoO

4

x 2 H

2

O, 2 krople nasyconego roztworu LiCl,

Roztwór mikroelementów dokładnie mieszamy - z tego roztworu bierzemy 1 ml na 1 l pożywki

Po dokładnym wymieszaniu składników pożywki doprowadzamy pH do 5,5 za pomocą 1M NaOH lub 1M HCl.

POŻYWKA HOAGLANDA-ARNOLDA (do podlewania kultur torfowych i perlitowych )
1/ Przygotowujemy po 1 l roztworu soli w następujących stężeniach:
Ca(NO

3

)

2

x 4 H

2

O - 1180 g/l, KNO

3

- 505 g/l, KH

2

PO

4

-

136 g/l, MgSO

4

x 7 H

2

O - 241 g/l,, Fe-cytrynian 5% - 50 g/l

Z każdego z tych roztworów bierzemy po 3,3 ml na 1 l pożywki

2/ Roztwór wyjściowy mikroelementów:
W 900 ml wody destylowanej rozpuszczamy:
50 mg CuSO

4

x 5 H

2

O, 100 mg ZnSO

4

x 7 H

2

O, 50 mg Co(NO

3

)

2

x 6 H

2

O, 50 mg Al

2

(SO

4

)

3

,

350 mg MnCl

2

x 4 H

2

O, 50 mg

NiSO

4

x 4 H

2

O, 25 mg KJ, 25 mg KBr, 50 mg Na

2

MoO

4

x 2 H

2

O, 550 mg H

3

BO

3

2 krople nasyconego roztworu LiCl
Roztwór mikroelementów dokładnie mieszamy - z tego roztworu bierzemy 1 ml na 1 l pożywki

Po dokładnym wymieszaniu składników pożywki doprowadzamy pH do 5,5 za pomocą 1M HCl lub 1M NaOH.

7

Dwiczenie 2. Kultury tkanek roślinnych in vitro, organogeneza

Rozwój roślin jest wynikiem wzrostu i różnicowania się komórek. Procesy te zachodzą w

trakcie kolejnych etapów rozwoju osobniczego (ontogenezy). Jednym z przejawów procesu

różnicowania jest powstawanie organów roślinnych czyli organogeneza.

Żywe komórki roślinne (niezależnie z jakiej tkanki pochodzą), uwolnione spod wpływu

rośliny macierzystej, dośd łatwo podlegają odróżnicowaniu. Możliwośd zmiany rozwoju

komórek w innym (niż dotychczasowy) kierunku świadczy o tym, że proces różnicowania nie

wiąże się ze zmianą jej podstawowej informacji genetycznej. Obserwowane w trakcie

różnicowania zmiany w rozwoju są wynikiem zróżnicowanej ekspresji genów. Komórki roślinne

są zatem totipotencjalne tzn. każda żywa komórka zawiera pełną informację genetyczną i w

może podjąd rozwój w każdym kierunku.

W regulacji różnicowania komórek uczestniczą hormony produkowane przez rośliny.

Świadczy o tym m.in. fakt, że wpływ rośliny macierzystej (produkującej hormony) na

różnicowanie się organów można zastąpid i przyśpieszyd działaniem podanego z zewnątrz

(egzogennego) hormonu.

Najbardziej przekonujące dowody na udział hormonów w różnicowaniu pochodzą z

doświadczeo z zastosowaniem hodowli izolowanych części roślin w warunkach sterylnych in

vitro. Izolacja fragmentów roślin eliminuje korelacyjne oddziaływania rośliny macierzystej, które

mogą byd zastąpione przez odpowiednio dobrane warunki hodowli. Typ wzrostu wyizolowanego

fragmentu rośliny (eksplantatu) i różnicowanie się organów zależą od ilościowej równowagi

pomiędzy dwoma hormonami roślinnymi auksyną i cytokininą. Obecnośd obu tych hormonów

jest niezbędna do przekształcenia zróżnicowanych tkanek eksplantatu w tkankę kalusową

(odróżnicowanie). Zwiększenie w pożywce hodowlanej stosunku cytokininy do auksyny indukuje

powstawanie pędów, a nadmiar auksyny względem cytokininy – tworzenie się korzeni.

Hodowla in vitro jest nie tylko prostym modelem doświadczalnym do badania procesów

związanych z różnicowaniem się tkanek i organów, lecz jest także intensywnie wykorzystywana

do celów praktycznych jak np. mikrorozmnażanie roślin.

Celem dwiczenia jest zapoznanie się z metodą hodowli roślin w warunkach in vitro oraz

wykazanie na przykładzie stymulowanego hormonami powstawania organów (organogenezy), że

komórki roślinne są zdolne do zmiany swojego programu różnicowania i rozwoju.

8

Indukcja powstawania pędów i korzeni u lnu (Linnum usitatissimumm L.) w kulturach in vitro

Materiał do doświadczeo stanowią fragmenty hipokotyli lnu izolowane z 9 dniowych siewek

wyhodowanych na stałym podłożu agarowym w sterylnych warunkach, przy 16 godzinnym

fotoperiodzie.

1 dzieo doświadczenia

Przygotowad 12 słoików przeznaczonych do hodowli in vitro (po 2 na każdy wariant

doświadczenia). Skalpele i pęsety sterylizowad w autoklawie przez 25 min. w

temperaturze 121

°

C.

Przygotowanie pożywek do indukcji organogenezy w izolowanych hipokotylach siewek lnu.

W zlewce na 500 ml przygotowad 300 ml pożywki Murashige i Skooga (4,43g/l).

Odpowiednią naważkę pożywki rozpuścid w wodzie, a następnie dodad sacharozy – tak

aby koocowe stężenie cukru w pożywce wynosiło 3%. Pożywkę rozlad po 50 ml do 6

odpowiednio oznakowanych zlewek (w zależności od wariantu doświadczenia). Do

pożywki podstawowej dodad odpowiednie ilości hormonów- auksyny i/lub cytokininy, w

celu uzyskania wariantów A-F (patrz poniżej). Obliczyd jaką objętośd każdego z

hormonów należy dodad do 50 ml pożywki aby uzyskad odpowiednie stężenie koocowe.

Doprowadzid pH każdej pożywki do wartości 5,8 (przy pomocy 0,1 M KOH) i przelad

pożywki do 12 opisanych słoików (po 25 ml na jedno powtórzenie każdego wariantu

doświadczenia). Następnie do każdego słoika dodad agar w takiej ilości, aby koocowe

jego stężenie wynosiło 8g/l. Tak przygotowane słoiki z pożywkami umieścid w

autoklawie i sterylizowad przez ok. 25 min. w temperaturze 121

°

C. Po wyjęciu z

autoklawu pozostawid pożywkę pod laminarem do zestalenia do następnego dnia.

Uwaga ! – wyjściowe stężenie BA i 2,4 D wynosi 1 mg/ml

A - kontrola (pożywka bez hormonów)

B - 2, 4 D (1mg/l)
C - BA (1mg/l)
D - 2, 4 D (1mg/l) + BA (1mg/l)
E - 2,4 D (1mg/l) + BA (0,1mg/l)
F - 2,4 D (0,1mg/l) + BA (1mg/l)

2,4 D- kwas 2,4-dwuchlorofenoksyoctowy
BA - benzyloaminopuryna

9

2 dzieo doświadczenia

Praca pod wyciągiem laminarnym. Z otrzymanych sterylnych hodowli delikatnie wyjąd

siewki lnu. Umieścid na sterylnych szalkach Petri’ego. Uważad aby nie uszkodzid

młodych siewek! Następnie sterylnym skalpelem wyciąd 2 cm fragmenty hipokotyli.

Umieścid po 3 szt. hipokotyli (lub więcej, w zależności od ilości dostępnego materiału) w

przygotowanych wcześniej słoikach zawierających pożywkę z różnymi kombinacjami

hormonów roślinnych (A,B,C,D,E,F). Sterylną kulturę hipokotyli umieścid w komorze

hodowlanej na 4 tygodnie, w temperaturze 24

°

C w dzieo i 22

°

C w nocy, przy 16

godzinnym fotoperiodzie (tzn. 16 godz. światło-dzieo, 8 godz. ciemnośd-noc).

W trakcie 4-tygodniowej hodowli w w/w warunkach prowadzid obserwacje, co tydzieo,

rozwoju fragmentów hipokotyli w poszczególnych wariantach doświadczenia. Wyniki

zestawid w tabeli, zaznaczając pojawianie się tkanki kalusowej, pędów i korzeni.

Tabela 1. Wpływ hormonów na powstawanie tkanki kalusowej i odtwarzanie organów
roślinnych w kulturach izolowanych fragmentów hipokotyli lnu.

stężenie hormonów w pożywce efekt morfogenetyczny
mg/l kalus pęd korzeo
2,4 D BA

0

0

1

0

0

1

1

1

0,1

1

1

0,1

Zwrócid uwagę na rolę auksyn i cytokinin w regulacji różnicowania się organów in vitro, oraz na
wpływ stężenia hormonów i wzajemnych ich proporcji na pojawianie się pędów i korzeni.

10

Dwiczenie 3. Otrzymywanie kultury zawiesinowej

Kultura zawiesinowa składa się ze zbioru pojedynczych komórek oraz różnej wielkości

agregatów komórkowych zwieszonych w pożywce płynnej. Utrzymanie takiej kultury wymaga

stałego dostarczania tlenu, co osiąga się dzięki zastosowaniu wytrząsarek lub użyciu

bioreaktorów (fermentatorów) wyposażonych w specjalne systemy napowietrzania. Dodatkowo

ciągły ruch, w jakim znajduje się kultura, zapewnia lepsze rozdrobnienie agregatów

komórkowych oraz utrzymuje komórki w zawieszeniu.

Zawiesiny komórkowe można uzyskad na dwa sposoby:

- przez kulturę określonych fragmentów tkanki roślinnej (tzw. eksplantatów) w pożywkach

płynnych,

- przez mechaniczne rozdrobnienie materiału roślinnego, filtrowanie go na sitach o określonej

wielkości oczek i zawieszenie w pożywce płynnej.

Fragmentami tkanki stosowanymi do zakładania kultury zawiesinowej najczęściej są: młody,

luźny kalus, zarodki oraz różne części siewek (np. hipokotyle). Tkanka roślinna musi byd

całkowicie sterylna i dlatego materiał używany do zakładania kultury zawiesinowej najczęściej

pochodzi z innej kultury in vitro. Przy inicjowaniu kultury zawiesinowej należy pamiętad, że do

tego celu nadają się tylko te fragmenty tkanki, które cechuje duża żywotnośd (ładnie i zdrowo

wyglądające). Stosunek masy wyjściowej eksplantatów do objętości pożywki powinien wynosid

od 0,3 do 1,5 g na 100 cm

3

pożywki. Stosowana w kulturze zawiesinowej pożywka płynna ma z

reguły taki sam skład, jaki pożywki przeznaczone do innych typów kultur in vitro dla danego

gatunku rośliny. Najczęściej spotykaną modyfikacją jest obniżenie o połowę lub więcej stężenia

soli mineralnych (z reguły makroelementów).

Przebieg wzrostu każdej kultury zawiesinowej ma swoisty charakter, jest mniej lub

bardziej zbliżony do krzywej wykładniczej. W każdej kulturze należy ustalid przynajmniej dwa

charakterystyczne punkty tej krzywej: rozpoczęcie fazy wzrostu logarytmicznego i zakooczenie

tej fazy wzrostu. Z reguły dokonuje się tego przez okresowe pomiary świeżej masy kultury. Faza

wzrostu logarytmicznego kooczy się najczęściej po 12 – 24 dniach od zainicjowania kultury. W

momencie zbliżania się tej fazy do kooca można zawiesinę przenieśd do nowej pożywki (pasaż)

lub, po prostu, zlikwidowad.

11

Krzywa wzrostu kultury zawiesinowej.

Celem dwiczenia jest założenie kultury zawiesinowej i zmierzenie jej żywotności. Kultury

zakładane będą poprzez rozdrobnienie kalusa i zawieszenie otrzymanego w ten sposób materiału

w pożywce płynnej. Cała procedura inicjacji kultury zawiesinowej przeprowadzona zostanie w

dwóch wariantach: w warunkach sterylnych (pod laminarem i przy wykorzystaniu wyjałowionych

narzędzi) i w warunkach niesterylnych (na stole laboratoryjnym). Materiałem do doświadczeo

jest kalus.

1 dzieo doświadczenia

Kalus należy delikatnie rozdrobnid, uważając przy tym, aby nie zmiażdżyd komórek.

Następnie tkankę zawiesid w pożywce płynnej Murashige Skooga (MS) i przesączyd przez sitko w

celu odrzucenia zbyt wielkich agregatów komórek. Przesącz pozostawid do odstania i

zdekantowad tak by pozostało około 0,5 cm starej pożywki, a następnie zawiesid w świeżej

pożywce. Zaszczepione kolby odstawid na wytrząsarkę.

Żywotnośd komórek i agregatów komórkowych oceniana jest metodą tetrazoliową, w

której określa się ilośd czerwonego barwnika, powstałego w komórkach w wyniku redukcji

chlorku tetrazoliowego (TTC). Ilośd powstałego barwnika jest proporcjonalna do stopnia

żywotności komórek. za miarę żywotności komórek przyjmuje się zmiany zawartości

wyekstrahowanego etanolem barwnika oznaczone w stosunku do czystego etanolu.

zakooczenie fazy wzrostu

rozpoczęcie fazy wzrostu

lo

g lic

zb

y

ko

m

ó

rek

czas kultury

12

Częśd prób nie wykorzystanych do zaszczepienia pożywki, należy podzielid na naważki o

masie 0,1 g; umieścid w probówce i zalad 3 ml odczynnika TTC o stężeniu 0,4 %. Odstawid na noc

w ciemne miejsce.

2 dzieo doświadczenia

Obejrzed i opisad wyniki testu TTC. Obejrzed pod mikroskopem i opisad komórki

zawiesiny. Wyniki przedstawid w tabeli.

W następnym tygodniu przeprowadzid dalsze obserwacje kultur zawiesinowych.

13

Dwiczenie 4. Izolacja protoplastów z liści jęczmienia (Hordeum vulgare L.)

Izolacja protoplastów mezofilu polega na uzyskaniu z tkanki miękiszu asymilacyjnego liści

pojedynczych „komórek” pozbawionych ściany komórkowej, a ograniczonych tylko błoną

komórkową (protoplasty), przy użyciu odpowiednich enzymów, do których należą: celulaza,

pektynaza, hemicelulaza. Enzymy te mają zdolnośd rozkładu poszczególnych składników

budujących ścianę komórkową. Komórki roślinne pozbawione ściany komórkowej, in vitro

przyjmują kształt kulisty i nie wykazują zdolności do podziału. W odpowiednich warunkach w

płynnej pożywce protoplasty odbudowują ścianę, a powstałe komórki wchodzą w fazę

podziałową. W ten sposób tworzą się agregaty komórkowe, a kultura protoplastów stopniowo

staje się kulturą zawiesinową.

Izolowane protoplasty stanowią doskonały obiekt do tzw. badao przyżyciowych komórek

roślinnych. Stanowią one użyteczne narzędzie do badao metabolizmu roślin. Uzyskiwanie

protoplastów z różnych typów tkanek znalazło również zastosowanie w biotechnologii roślin.

Protoplasty stanowią bowiem jednorodną populację komórek roślinnych pozbawionych ściany

komórkowej, do której każdy czynnik eksperymentalny dociera jednocześnie i w tym samym

stężeniu. Wprowadzanie do protoplastów obcego DNA umożliwia uzyskanie transgenicznych

roślin wykazujących cechy kodowane przez wprowadzony gen. Możliwa jest regeneracja in vitro

całych roślin z kultury protoplastów prowadzonej w odpowiednich warunkach laboratoryjnych.

Celem doświadczenia jest zapoznanie się z metodą izolacji nienaruszonych protoplastów.

Materiałem doświadczalnym będą liście 6-dniowego jęczmienia ozimego odm. Gregor

hodowanego w kulturach hydroponicznych

Izolacja protoplastów z liści jęczmienia zostanie przeprowadzona wg metody opisanej

przez Gardestrom i Wigge (1988, Plant Physiol. 88: 69-76). Fragmenty liści pozbawione epidermy

umieszczamy w szalkach Petri’ego w roztworze do płukania tkanek (TWM). Powierzchnia blaszki

liściowej pozbawiona epidermy powinna byd zanurzona w roztworze. Po kilku min. usuwamy

roztwór TWM, a następnie pipetujemy do szalki roztwór do trawienia. Fragmenty liści w szalce

nie powinny nakładad się na siebie lub byd pozwijane. Tak przygotowany materiał trawimy ok. 1

godz. w temperaturze 27-29 C w słabym świetle. Po tym czasie bardzo delikatnie usuwamy

roztwór do trawienia i do szalek delikatnie wlewamy niewielką ilośd buforu do płukania (WM)

(bufor powinien byd schłodzony do temp 4°C) i delikatnie wytrząsając uwalniamy protoplasty.

Zawiesinę protoplastów przesączamy napierw przez sitko a następnie przez filtr o średnicy oczek

14

100 µm. Pozostały materiał przemywamy dwukrotnie niewielką ilością roztworu do płukania.

Następnie zawiesinę protoplastów wirujemy 3 min. przy 200 x g, uzyskany osad zawiera zarówno

całe jak i uszkodzone protoplasty. Powstały osad zawieszamy ostrożnie (delikatnie potrząsając) w

schłodzonym do temp. 4°C buforze F1 i przenosimy do probówek wirówkowych, po czym na

powierzchnię tej warstwy delikatnie pipetujemy niewielkie ilości najpierw roztworu F2 a później

roztworu F3 (oba roztwory powinny mied temp. 4°C). Powstały gradient wirujemy 5 min przy

300 x g. Po wirowaniu protoplasty z nienaruszoną błoną powinny znaleźd się pomiędzy

warstwami F2 i F3.

Przeprowadzamy obserwację otrzymanych protoplastów w mikroskopie świetlnym.

ROZTWORY DO IZOLACJI PROTOPLASTÓW Z LIŚCI JĘCZMIENIA:

Roztwór do płukania tkanek (TWM): 0,5 M sorbitol; 1 mM CaCl

2

; 0,05% PVP; 5 mM Hepes pH 7,2

Roztwór do trawienia: 1% celulaza; 0,3% maceraza; 0,5 M sorbitol; 10 mM MES pH 5.5; 0,05% PVP; 1

mM MgCl

2

; 1mM CaCl

2

; 0,05% albumina, 20 mM askorbinian

Roztwór do płukania (WM): 0,5 M sorbitol; 1 mM CaCl

2

; 0,05% PVP; 5 mM Hepes pH 7,0; 0.05%

albumina (odtłuszczona)

Roztwór F1: 0,5 M sacharoza; 1 mM MgCl

2

; 5 mM Hepes pH 7,0

Roztwór F2: 0,4 M sacharoza; 0,1 M sorbitol; 1 mM MgCl

2

; 5 mM Hepes pH 7,0

Roztwór F3: 0,5 M sorbitol; 1 mM MgCl

2

; 5 mM Hepes pH 7,0

15

Dwiczenie 5. Oznaczenia stężenia chlorofilu i ATP w tkankach roślinnych

Badania metabolizmu roślin wymagają precyzyjnych metod oznaczania stężenia

poszczególnych związków (tzw. metabolitów). Do oznaczeo takich wykorzystujemy np. metody

spektrofotometryczne, luminometryczne, fluorymetryczne. Podstawową zasadą w oznaczaniu

metabolitów jest zastosowanie wydajnej ekstrakcji co wiąże się z doborem odpowiedniego

roztworu oraz warunków do ekstrakcji (np. temperatura). Procedura oznaczania danego

metabolitu również musi byd dobrze dobrana do osiągnięcia zamierzonego celu. W wielu

przypadkach metody oznaczeo opierające się na właściwościach fizykochemicznych danego

związku są wystarczające, metody te wykorzystują reakcje chemiczne oraz właściwości

spektralne badanego związku; w ten sposób oznaczyd możemy np. stężenie chlorofilu. Jednak do

oznaczenia sporej grupy metabolitów, szczególnie takich, które znajdują się które mogą

znajdowad się w komórkach w bardzo małych stężeniach (np. ATP), konieczne jest wykorzystanie

specyficzności enzymów.

Celem dwiczenia jest oznaczenie stężenia chlorofilu z wykorzystaniem znanych wartości

współczynników ekstynkcji otrzymanych dla chlorofilu a i chlorofilu b oraz oznaczenie statusu

energetycznego tkanek liści rzodkiewnika zbieranych po okresie światła lub ciemności z

wykorzystaniem specyficzności układu lucyferyna-lucyferaza.

Ekstrakcja oraz spektrofotometryczne oznaczanie stężenia chlorofilu w liściach rzodkiewnika

Oznaczanie stężenia chlorofilu a i b wykonujemy wg metody opisanej w Porra i wsp.

(1989) [Biochim Biophys Acta, 975: 384-394]. Zważyd i zanotowad masę krążka wyciętego z liścia

rzodkiewnika; tkankę umieścid w probówce typu eppendorff (procedurę ekstrakcji

przeprowadzamy w temp 4 °C). Następnie dodad 1 ml 80% schłodzonego acetonu oraz dwie

stalowe kulki do homogenizacji. Homogenizowad tkankę przez 3 min. w młynie kulkowym.

Ekstrakty zwirowad 10 min. przy 10 000 x g w temp. 4 °C (przed wirowaniem należy koniecznie

usunąd kulki z probówek!). Zebrad supernatant i zmierzyd absorbancję próbek przy 2 długościach

fali: λ = 663,3 nm; λ = 646,6nm.

Stężenia chlorofilu (µg ml

-1

) wyliczyd wg wzoru:

Chl a = 12,25 Abs

663,3

– 2,55 Abs

646,6

Chl b = 20,31 Abs

646,6

– 4,91 Abs

663,6

Chl a + b = 17,76 Abs

646,6

+ 7,34 Abs

663,6

Obliczyd zawartośd chlorofilu w 1 g świeżej masy tkanki oraz w 1 cm

2

powierzchni liścia.

16

Ekstrakcja i luminometryczne oznaczanie stężenia ATP w liściach rzodkiewnika

Ekstrakcja: Zważyd i zanotowad masę liścia rzodkiewnika; liśd umieścid w probówce typu

eppendorff (procedurę ekstrakcji przeprowadzamy w temp 4 °C). Następnie dodad 400 µl 3%

schłodzonego kwasu trójchlorooctowego oraz dwie stalowe kulki do homogenizacji.

Homogenizowad tkankę przez 3 min. w młynie kulkowym. Ekstrakty zwirowad 10 min. przy

10000g w temp. 4 °C (przed wirowaniem należy koniecznie usunąd kulki z probówek!).

Zebrad supernatant i oznaczyd w nim stężenie ATP.

Oznaczanie: Oznaczanie wykonujemy z wykorzystaniem zestawu do oznaczania ATP firmy

Biothema (Szwecja). Do probówki typu eppendorff odpipetowad: 60 µl buforu do oznaczeo

oraz 200 µl roztworu lucyferyny-lucyferazy i zmierzyd luminescencję (tło). Następnie dodad

3 ul ekstraktu tkankowego i ponownie zmierzyd luminescencję. Z różnicy luminescencji

wykorzystując krzywą wzorcową wyliczyd zawartośd ATP w próbce. Przeliczyd zawartośd ATP

w 1 g świeżej masy tkanki.

Wykonanie krzywej wzorcowej. Do probówki typu eppendorff odpipetowad: 60 µl buforu do

oznaczeo oraz 200 µl roztworu lucyferyny-lucyferazy i zmierzyd luminescencję (tło).

Następnie dodad 1-5 ul wzorcowego 10 µM roztworu ATP i ponownie zmierzyd

luminescencję. Wyrysowad krzywą wzorcową zależności ilości ATP od luminescencji roztworu

(wyrażanej w jednostkach CPS, counts per second)

17

Dwiczenie 6. Podstawy izolacji i charakterystyki organelli

Mitochondria to organella przetwarzające energię w komórce w procesie oddychania.

Zawartośd macierzy mitochondrialnej otoczona jest podwójną błoną białkowo-lipidową, w której

zlokalizowane są białka odpowiedzialne za transport elektronów i syntezę ATP. Izolacja

mitochondriów roślinnych opiera się na zastosowaniu serii wirowao różnicowych

zhomogenizowanych tkanek. Mieszanina do homogenizacji powinna: 1) byd schłodzona i

buforowana poprzez zapewnienie pH ok. 7,5 -8,0; 2) mied zbliżone do tego, jakie panuje w

cytosolu ciśnienie osmotyczne, które zapewnia najczęściej obecnośd cukru; 3) zawierad

substancje wiążące fenole, jony metali dwuwartościowych i wolne kwasy tłuszczowe, które po

wydostaniu się z wakuoli mogą powodowad uszkodzenia m.in. białek i/lub kwasów

nukleinowych; 4) zawierad związki o charakterze redukującym, które są odpowiedzialne za

utrzymanie struktury białek i mają właściwości przeciwutleniaczy. Homogenizacja tkanek

roślinnych ma na celu rozbicie ściany komórkowej i uwolnienie jak najmniej uszkodzonych

organelli i dlatego powinna trwad możliwie krótko. Najlepsze efekty przynosi zastosowanie

moździerza przy przeprowadzeniu całej procedury w chłodni. Wyizolowane mitochondria, po

oznaczeniu stopnia integralności błony zewnętrznej, wykorzystuje się do charakterystyki

oddychania komórkowego in vitro. Zastosowanie elektrody tlenowej Clarka pozwala na badanie

zużywania tlenu i wytwarzania ATP przez izolowane mitochondria po dodaniu różnych

substratów oddechowych oraz związków stymulujących lub hamujących oddychanie. Najprostsza

procedura preparatyki mitochondriów to otrzymanie aktywnych „mitochondriów płukanych”,

zanieczyszczonych przez inne organella lub ich fragmenty (np. błony chloroplastowe, jeśli

preparat został przygotowany z tkanek zielonych).

Celem dwiczenia jest wykonanie izolacji i przeprowadzenie krótkiej charakterystyki oddechowej

mitochondriów z liści rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana L.).

Izolacja mitochondriów z liści rzodkiewnika

Izolacja mitochondriów zostanie przeprowadzona wg metody opisanej przez Keech i wsp. (2005,

Physiol Plant 124: 403-409). Około 5 g świeżych liści rzodkiewnika odciąd od rozet, rozdrobnid na

mniejsze fragmenty i umieścid bezpośrednio w schłodzonym moździerzu. Homogenizowad w

mieszaninie o pH 8,0 i składzie: 0,3 M sacharoza, 60 mM TES *(hydroksymethyl)-methyl-2-

aminoethanesulphonic acid], 10 mM EDTA [etylene diamine tetra-acetic acid], 10 mM KH

2

PO

4

,

25 mM pirofosforan czterosodowy, 1 mM glicyna, 1% (w/o) PVP-40 [poliwinylopirolidon], 1%

18

(w/o) odtłuszczona albumina (BSA), 50 mM askorbinian sodu i 20 mM cysteina. Homogenat

ostrożnie przesączyd przez nylonową siatkę o wielkości oczek 20 µm i odwirowad przez 5 min.

przy 2 500 x g w celu mechanicznego usunięcia większości całych chloroplastów i błon

tylakoidów. Nadsącz przelad do nowej probówki wirówkowej i wirowad 15 min. przy 15 000 x g.

Nadsącz odrzucid a osad zawierający nieoczyszczone „płukane” mitochondria zawiesid w 200 µl

buforu do płukania o pH 7,5 i składzie: 0,3 M sacharoza, 10 mM TES, 2 mM EDTA, 10 mM

KH

2

PO

4

.

Oznaczanie aktywności oddechowej „płukanych” mitochondriów

Pomiary zużywania tlenu przez izolowane mitochondria prowadzid w stałej temp. 25 °C,

wykorzystując połączoną z rejestratorem komputerowym elektrodę tlenową Clarka (Hansatech).

Objętośd koocowa mieszaniny reakcyjnej o pH 7,5 i składzie: 0,3 M sacharoza, 10 mM TES, 10

mM KCl, 2 mM MgSO

4

, 10 mM K H

2

PO

4

, 0,1% BSA, powinna wynosid 0,5 ml. Do oznaczania

aktywności oddechowej pobierad 10-100 µl zawiesiny mitochondriów. Jako substraty

oddechowe stosowad 10 mM jabłczan (w obecności 1 mM glutaminianu) lub 1 mM NADH.

Wytwarzanie ATP mierzyd w obecności 50 nmoli ADP. Inhibitory oddychania, KCN lub SHAM

stosowad w koocowym stężeniu 1 mM.

19

Regulamin pracy w laboratorium

1.

W pracowni nie wolno jeśd, pid oraz palid.

2.

Ubranie wierzchnie należy pozostawid w szatni, natomiast torby, siatki, itp. składad w miejscu do tego

przeznaczonym.

3.

Każda grupa ma wyznaczone miejsce pracy, za którego czystośd jest odpowiedzialna.

4.

Przed przystąpieniem do pracy należy zapoznad się z obsługą używanej aparatury.

5.

Alkohol używany w pracowni skażony jest w dawkach niebezpiecznych dla zdrowia.

6.

Mając do czynienia z silnie trującymi związkami zachowad szczególną czystośd rąk i miejsca pracy.

Prace wykonywad w rękawiczkach.

7.

Ze stężonymi kwasami, zasadami oraz innymi substancjami żrącymi pracowad można w wyznaczonych

miejscach. Szczególną ostrożnośd zachowad przy ich odmierzaniu. Skórę oparzoną kwasem lub

zasadą należy spłukad dokładnie wodą bieżącą, następnie przemyd 5% NaHCO

3

(kwas) lub 2%

CH

3

COOH (zasada). W przypadku stężonych kwasów skórę należy przed spłukaniem osuszyd.

8.

O każdym, nawet drobnym, wypadku należy powiadomid asystenta prowadzącego dwiczenie.