1

Ćwiczenie 4

Opracowanie:

lek. wet. Jan P. Madej

prof. dr hab. Wojciech Nowacki

Materiały do ćwiczeń dla

Wydziału Medycyny

Weterynaryjnej

Mechanizmy odporności nieswoistej

Izolacja granulocytów

Funkcje granulocytów

Odporność wrodzona (nieswoista)

Składowe odporności wrodzonej:

• bariery anatomiczne

• bariery fizjologiczne

• składniki komórkowe

komórki dendrytyczne - należą do komórek odporności wrodzonej i są

najważniejszym ogniwem pomiędzy odporością

wrodzoną i nabytą

• składniki humoralne

Cechy odporności wrodzonej:

• niezmienność w rozpoznawaniu Ag

• brak pamięci o Ag

• szybkość odpowiedzi

• spontaniczna fagocytoza (np. węgiel, karbonylek)

• immunofagocytoza (z udziałem opsonin)

• wybiórcza aktywacja poprzez interakcję PRR - PAMP

2

Odporność nieswoista komórkowa

Komórki fagocytujące:

neutrofile (w mniejszym stopniu eozynofile),

monocyty i makrofagi

Cechy granulocytów:

• zdolność ruchu

• zdolność adherencji:

a) in vivo

– do powierzchni śródbłonka naczyń włosowatych i do

migracji przez ścianę naczyń do tkanek
(czynniki chemotaktyczne)

b) in vitro

– do powierzchni szkła i plastiku

• zdolność rozpoznawania (PRR – PAMP) i fagocytowania

• zdolność zabijania (destrukcji) na drodze mechanizmów zależnych

i niezależnych od tlenu:

a) wewnątrzkomórkowo

b) zewnątrzkomórkowo (ADCC)

I. Badania zdolności ruchu granulocytów

• test migracji spontanicznej i chemotakcji leukocytów

pod agarem

• test kapilarowy migracji spontanicznej i chemotaksji

leukocytów

• test chemotaksji leukocytów w komorze Boydena

Gatunek

Liczba leukocytów

(10

9

/L lub tys/mm

3

)

pies

kot

konie
bydło
świnie
owce

12,0

15,0

10,0

8,0

15,0

8,0

Liczba leukocytów u niektórych gatunków zwierząt

Krzymowski T.: „Fizjologia zwierząt”, Warszawa 1998

3

Pobranie krwi

krew pełna

(antykoagulant)

(morfologia)

surowica

(skrzep)

(biochemia)

Test spontanicznej migracji granulocytów

Izolacja granulocytów:

• pobrać krew na heparynę (20 j.m./ml)

• odwirować 600 x g, 20 min

• usunąć osocze z „kożuszkiem” – na dnie pozostają granulocyty (PMN –

polymorphonuclear cells) i erytrocyty

• zlizowć erytrocyty przy użyciu 0,84% NH

4

Cl lub H

2

O

• odwirować (200 x g, 10 min) i 3x odpłukać PBS z dodatkiem

antybiotyków

• określić żywotność komórek 1% roztworem błękitu trypanu

• doprowadzić do koncentracji 2x10

8

/ml

Izolacja granulocytów

woda

2000 obr/min 7min

erytrocyty i leukocyty

45 sek

PBS

10 x stęż.

płyn

komórki

1500 obr/min 10min

4

Przygotowanie podłoża do migracji:

• dwukrotnie stęż. r-r płynu Hanksa uzupełnić antybiotykami i surowicą o

końcowej koncentracji 10%. (pH 7,2 - 7,4 )

• zmieszać w łaźni wodnej o temp 48°C, z równą objętością 1,5% r-ru

wodnego agarozy (lub agaru); stężenie końcowe 0,75%.

• rozlać do szklanych płytek Petriego

• po zestaleniu agaru, wyciąć zbiorniki o średnicy 2 mm.

Wykonanie testu i odczyt:

• nanieść komórki w objętości 5 µl (każda próba w 3 powtórzeniach)

• inkubować płytki w cieplarce, w komorze wilgotnej, przez 18 h.

• płytki utrwalić 40% roztworem buforowanej formaliny, przez 30 min,

a następnie alkoholem metylowym przez 20 min.

• zdjąć agar, komórki zabarwić metodą May - Grünwalda - Giemsy.

• określić wielkość strefy migracji (średnia 3 pól migracji r

2

)

Test migracji leukocytów pod agarem

5

Test chemotaksji leukocytów pod agarem

Kowalski M.2000

Indeks chemotaksji:

jest to stosunek odcinka „A” do „B”

indeks > 1

działanie chemotaktyczne

indeks = 1

brak chemotaksji

indeks < 1

działanie hamujące

Test kapilarowy migracji leukocytów

Kowalski M.2000

6

Test chemotaksji leukocytów w komorze Boydena

Kowalski M.2000

7

II. Test na zdolność granulocytów do adherencji

8

Etapy fagocytozy

III. Fagocytoza

Kuby Immunology ed.Goldsby et al.
WH.Freeman and Co.2000

skupiska bakterii

9

IV. Mechanizmy zabijania

wykorzystywane przez neutrofile

Mechanizmy zależne od tlenu:

OKSYDAZA NADPH

NADPH + 2 O

2

2 O

–

2

+ NADP

+

+ H

+

DYSMUTAZA PONADTLENKOWA

2 O

–

2

+ 2 H

+

H

2

O

2

+ O

2

KATALAZA

H

2

O

2

H

2

O + 0

2

H

2

O

2

+ Fe

2+

Fe

3+

+ OH

–

+

OH

HOCl + H

2

O

2

1

O

2

+ H

2

O + Cl

–

+ H

+

HOCl + aminy

chloraminy

MIELOPEROKSYDAZA

H

2

O

2

+ Cl

-

HOCl + OH

-

Mechanizmy niezależne od tlenu:

• BPI – czynnik bakteriobójczy zwiększający przepuszczalność

• katepsyna G

• defensyny

• kateliny

• lizozym

• laktoferyna

• MBP – główne białko zasadowe (major basic protein)

• białko kationowe eozynofilów (ECP), neurotoksyna eozynofilów (EDN)

•

elsataza, azurocydyna, kalprotektyna, ubikwicydyna

10

Mechanizm działania defensyn

Gołąb, Jakóbisiak, Lasek, 2005

Gołąb, Jakóbisiak, Lasek, 2005

Test NBT

Komórki

posiadające

zdolność

wewnątrzkomórkowego

zabijania

drobnoustrojów wykazują wysoki potencjał oksydo-redukcyjny i mogą
zredukować błękit nitrotetrazolowy (NBT) (żółty) do nierozpuszczalnego
formazanu (ciemnogranatowy).

Test spontaniczny:

komórki

+

barwnik

ocena

liczby

komórek

redukujących

i

nieredukujących (rozmaz)

Test pobudzony:

komórki + endotoksyny bakteryjne lub inne czynniki pobudzające
(np. zymozan).

Jeżeli w teście pobudzonym ilość komórek redukujących

wynosi mniej

niż 80% świadczy to o defektach leukocytów.

U zdrowego

bydła: 21% neutrofilów w teście spontanicznym i 40% w pobudzonym.

U

psów w teście spontanicznym: 8% redukuje prawidłowo; podczas infekcji

powyżej 14%

11

Wykonanie testu:

• szkiełka podstawowe powlec 0,1% alkoholowym r-rem NBT i wysuszyć

• pobrać krew z dodatkiem heparyny (do 10 j.m./ml)

• wykonać cienki rozmaz z krwi pełnej na szkiełku podstawowym z filmem

NBT

• inkubacja w łaźni wilgotnej 20 min 37°C, a następnie 20 min w temp.

pokojowej

• po wyschnięciu barwić metodą May-Grünwalda-Giemsy

prawidłowy eozynofil, neutrofil i limfocyt

12

reakcja +/–

reakcja ujemna

Badania funkcji granulocytów:

1) in vivo:

• badanie zdolności ruchu i migracji z krwi do miejsc działania czynnika

zapaleniotwórczego

2) in vitro:

• liczba leukocytów we krwi lub innych płynach ustrojowych

• obecność receptorów umożliwiających adherencję i migrację z naczyń

• zdolność ruchu pod warstwą żelu agarozowego

• zdolności fagocytujące (bakterie, ziarna zymozanu)

• właściwości oksydacyjno-redukcyjne oraz aktywność mieloperoksydazy

i produkcji nadtlenków (w tym H

2

O

2

)

• właściwości bakteriobójcze

• produkcja cytokin

13

Diagnostyka zaburzeń fagocytarnych

I. Testy przesiewowe (skriningowe):

•

leukocyty: liczba, wzór, morfologia

•

test NBT

II. Testy zaawansowane:

•

specjalna morfologia

•

okienko skórne Rebuck’a

•

ruchliwość spontaniczna (przypadkowa) i chemotaksja

•

fagocytoza

•

czynność bakteriobójcza

III. Testy specjalne:

•

chemiluminescencja

•

metabolizm tlenowy fagocytów

•

analiza molekuł adhezyjnych

•

badania enzymatyczne

•

ocena zdolności odkształcenia, adherencji, agregacji

TEST FAGOCYTOZY IN VITRO
Do testu używa się najczęściej komórek fagocytujących, wyizolowanych z krwi,
płuc,
wysięku otrzewnowego.
A. Przygotowanie zawiesiny bakterii
Skosy agarowe z wyhodowanymi bakteriami Staphylococcus aureus zmywa się
PBS-
em. Zawiesinę bakterii odwirowujemy przy 3000 obr/min przez 20 minut, płuczemy
3 x w
PBS, każdorazowo wirując w tych samych warunkach. Z uzyskanego osadu
przygotowujemy
zawiesinę komórek o gęstości 0,5 - 7,0 x l O9 komórek ml"1 ( ilość bakterii
sprawdzona
spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm porównując zmętnienie zawiesiny
badanej ze
zmętnieniem zawiesiny standardowej przygotowanej według skali McFarlanda ).
B. Izolujemy badane komórki fagocytujące z krwi, płuc lub otrzewnej.
C. Wykonanie testu i odczyt
'7
B
Łączymy badane komórki 0,lml(5xl0 komórek/ml) z O, l ml zawiesiny gronkowca (
3x10
komórek/ml ) i 0,1 ml surowcy ( aktywnej lub dekomplementowanej - inaktywacja
dopełniacza 56 C, 30 min ). Inkubujemy 45 minut w łaźni wodnej o temp. 37° C.