Katedra Andrologii i Endokrynologii

Płodności

Dr n. med. Katarzyna Marchlewska

Nasienie

 plemniki


płyn nasienny (plazma nasienia)

-

wydzielina pęcherzyków nasiennych (60-70%)

- wydzielina prostaty (ok. 30%)

-

wydzielina jąder, najądrzy, gruczołów opuszkowo-cewkowych (5%)



komórki okrągłe (leukocyty, komórki spermatogenezy)



całkowita liczba plemników

– odzwierciedla wydajność produkcji

plemników przez jądra oraz drożność dróg wyprowadzających nasienie



całkowita objętość płynu nasiennego

– odzwierciedla aktywność

wydzielniczą gruczołów

Warunki wstępne badania nasienia:



Informacje dla pacjenta powinny być przekazane ustnie i umieszczone

w formie pisemnej w pokoju przeznaczonym do oddawania nasienia.



Do analizy musi być dostarczony cały ejakulat.



Wstrzemięźliwość płciowa – co najmniej 48 h, ale nie dłużej niż 7 dni.

W przypadku powtarzania badania wstrzemięźliwość płciowa powinna

być taka sama.



Badanie powinno być powtórzone przynajmniej dwukrotne w

odstępach nie krótszych niż 7 dni i nie dłuższych niż 3 tygodnie.

Różnice w całkowitej liczebności oraz koncentracji plemników w okresie 1,5 roku

u 5 zdrowych mężczyzn

Warunki wstępne badania nasienia:



Badanie powinno być rozpoczęte przeciągu 1 h od ejakulacji.



Nasienie powinno być oddawane w specjalnym pomieszczeniu

niedaleko od laboratorium, drogą masturbacji do pojemnika ogrzanego

do temp. 20-37 C



W przypadku gdy pacjent nie jest w stanie oddać nasienia drogą

masturbacji możliwe jest użycie specjalnych prezerwatyw

przeznaczonych do tego celu.

 W przypadku badania mikrobiologicznego pacjent powinien:



oddać mocz



umyć ręce i penis mydłem



dokładnie wypłukać mydło



do wytarcia użyć jednorazowego ręcznika



oddać ejakulat do jałowego pojemnika

PODSTAWOWE BADANIE NASIENIA:

- Ocena makroskopowa nasienia

-

Ocena mikroskopowa preparatów

 Przez pierwsze 5 minut od ejakulacji:

Pojemnik z próbką nasienia umieścić w inkubatorze

(37

C

) na okres potrzebny do upłynnienia.



upłynnienie ocenić makroskopowo i mikroskopowo



w trakcie upłynniania umieścić pojemnik na mieszadle

rotacyjnym (temp. 20-37 C)



jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min odczekać z
rozpoczęciem dalszych analiz kolejne 30 min.

ETAPY BADANIA NASIENIA



Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od

ejakulacji:

-

czas upłynnienia

-

wygląd/kolor

-

lepkość/konsystencja

-

objętość

-pH

-

preparat bezpośredni (ruchliwość i rozcieńczenie)

-

żywotność (w przypadku niskiej ruchliwości)

-rozmaz do morfologii

-ocena liczby

ETAPY BADANIA NASIENIA



Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od

ejakulacji:

- test MAR (mixed antiglobulin reaction)

-

ocena komórek peroksydazo-pozytywnych

- immunobead test (preparat)

- odwirowanie nasienia



Przed upływem 3 godzin od ejakulacji:

-

przesłanie próbki do badania mikrobiologicznego



Później ale tego samego dnia (lub następnego z

zamrożonej próbki)

:

-

ocena markerów czynności gruczołów dodatkowych

- immunobead test

ETAPY BADANIA NASIENIA

Upłynnianie nasienia:

Norma: do 60 min.
(zwykle 15 min.)

Prawidłowe nasienie jest homogenne i upłynnia się w

przeciągu 60 min w temperaturze pokojowej pod wpływem

enzymów pochodzących z

prostaty (PSA)

.

Obecność pasm śluzu może utrudniać procedurę liczenia

plemników i sugeruje stan zapalny lub zaburzenia upłynnienia.



upłynnienie można ocenić makroskopowo i/lub mikroskopowo



w trakcie upłynniania zaleca się umieścić pojemnik na mieszadle rotacyjnym

(temp. 20-37 C)



jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min. odczekać z rozpoczęciem

dalszych analiz kolejne 30 min.

Nasienie nieupłynnione:

-

dodanie równej objętości

PBS w wersji Dulbecco

(

Dulbecco’s Posphate Buffered Saline) i wymieszanie pipetą

-

mechaniczne mieszanie strzykawką z igłą o średnicy wewnętrznej

0.84

– 0.69 mm

- trawienie roztworem 10 IU/ml bromeliny w Dulbecco-PBS

UWAGA:
Należy odnotować w wyniku użycie określonej metody i
uwzględnić rozcieńczenie przy ocenie liczby plemników

Preparat o dużym stopniu nieupłynnienia

może upośledzać zdolność plemników do

zapłodnienia

Obecność ciałek żelatynowych

Lepkość:

Prawidłowa lepkość

podwyższona

lepkość

Długość nitki nie powinna przekroczyć 2 cm

UWAGA



Preparat o podwyższonej lepkości

może utrudniać

- ocenę ruchu

- ocenę koncentracji /całkowitej liczby plemników

- wykrycie plemników opłaszczonych przeciwciałami

- pomiary markerów biochemicznych

W celu zmniejszenia lepkości próbki stosujemy takie same metody

jak przy próbce nasienia nieupłynnionego.

Hematospermia

Azoo/Oligozoospermia

Prawidłowe nasienie ma wygląd homogenny, nieprzezroczysty, szaro-opalizujący

Wygląd / kolor:

Żółta:

żółtaczka, używanie
niektórych witamin np.
z grupy B

Objętość:

Norma: 1,5 ml

Plazma nasienia produkowana jest głównie w gruczołach dodatkowych.

Większość wydzielana jest z pęcherzyków nasiennych a jedynie od 0,5

and 1 ml pochodzi z gruczołu krokowego.



Zważyć pojemnik przed oddaniem nasienia i zapisać masę



Zważyć pojemnik razem z nasieniem i zapisać masę



Obliczyć masę próbki



Obliczyć objętość próbki przy założeniu, że gęstość właściwa ejakulatu

wynosi 1 g /ml (1,043-1,102 g/ml)

 Metoda wagowa:



Metoda objętościowa:



nasienie może być oddane do specjalnego cylindra

miarowego o szerokim otworze



objętość odczytuje się ze skali z dokładnością do 0,1 ml

Niska objętość ejakulatu:

- utrata części próbki
- zablokowanie dróg wyprowadzających nasienie
- wrodzony obustronny brak nasieniowodów (niedorozwój
pęcherzyków nasiennych)

-

częściowy wytrysk wsteczny

-

niedobór androgenów

Wysoka objętość ejakulatu:

- wysięk w przypadku aktywnego zapalenia gruczołów dodatkowych

Ocena objętości nasienia poprzez aspirację próbki nasienia do skalowanej

pipety/strzykawki, lub przelanie do skalowanego cylindra/probówki

nie jest zalecane !!!

Utrata próbki rzędu 0.3 – 0.9 ml !!!

UWAGA

pH:

Wartość referencyjna: 7,2

Zakres papierków wskaźnikowych : 6.0 do 10.0 lub 6.5 do 10.0

Jeśli pH < 7,0 przy azoosprmii może to

oznaczać obustronną niedrożność

nasieniowodów

Ocenę należy przeprowadzić po

upłynnieniu nasienia ale nie później

niż 60 min od ejakulacji

GRUCZOŁ KROKOWY

PĘCHERZYKI

NASIENNE

Wydzielina

kwaśna

Wydzielina zasadowa



Wstępna ocena preparatu bezpośredniego (pow. 100x):

•

występowanie pasm śluzu

• agregacja lub aglutynacja plemników

• obecność komórek innych niż plemniki tj. leukocytów,

niedojrzałych komórek spermatogenezy, komórek

nabłonkowych

Ocena mikroskopowa preparatów:

Preparat nasienia musi być bardzo dokładnie wymieszany przed

wykonaniem każdej analizy!!

Do mieszania polecana jest jednorazowa pipetka Pasteura o szerokim ujściu

(1,5 mm). Należy delikatnie zaaspirowaś próbkę około 10 razy.

Nie stosować vortexu, ponieważ powoduje uszkodzenia plemników.

Ocena ruchu plemników:

Kategorie ruchu:
PR

- ruch postępowy (niezależnie od szybkości)

NP

- ruch niepostępowy

IM

- brak ruchu

Wartość referencyjna:

40% PR + NP

lub

32% PR

22 mm

10 µl

Głębokość 20µm

Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników

NP

Ocena ruchliwości:

PR

– 30% 50%

NP

- 5% 15%

IM

- 65% 35%

Średnia = (65+35):2 = 50

Różnica = 65 – 35 = 30

200

200

Wynik do

powtórzenia

PR

– 37% 28%

NP

- 3% 6%

IM

- 60% 66%

Średnia = (60+66):2 = 63

Różnica = 66 – 60 = 6

200

200

Wynik

prawidłowy

PR 32%; NP 4%; IM 63%

Żywotność plemników



Żywotność plemników

– ocena integralności błony komórkowej

powinna zawsze

być wykonywana w próbkach nasienia z

nieprawidłowym ruchem plemników (<40% PR), ale

może

być

wykonywana rutynowo dla każdej próbki nasienia

Żywotność plemników:

-

Test eozyna/nigrozyna

- Test eozynowy

- Test wodny (HOS Test)

Wartość referencyjna:

58 % plemników żywych

Ocena:

Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników

X 400

X 1000

Test eozyna/nigrozyna

- zmieszać po 50 µl nasienia i roztworu eozyna-nigrozyna
- wykonać rozmaz
- oceniać od razu po wyschnięciu, lub później po zatopieniu w
odpowiednim (bezwodnym) medium, pod imersją (1000x)

Plemniki nieżywe

- główki czerwone

- ciemnoróżowe

Plemniki żywe

- główki białe

- jasnoróżowe

Test eozynowy

- pobrać po 5 µl

(lub po 10 µl)

nasienia i roztworu eozyny na szkiełko

mikroskopowe, dokładnie wymieszać
-przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm)

(lub 24x40 mm)

- po 30 min. oceniać pod powiększeniem 200 lub 400 x (najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy)

Plemnik nieżywy

- główki czerwone

- ciemnoróżowe

Plemniki żywe

- główki niezabarwione

- jasnoróżowe

Test hipoosmotyczny (HOS test)

- pobrać po 100 µl nasienia i roztworu hipotonicznego
- inkubować w 37ºC przez 5 min (ICSI) lub 30 min (badania nasienia)
- pobrać 10 µl na szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22
mm) i oceniać pod powiększeniem 200x lub 400x najlepiej w
mikroskopie kontrastującym fazy

- alternatywa do testów barwionych
- używany gdy należy uniknąć barwienia plemników (plemniki do ICSI)

Plemniki żywe

- różne typy

puchnięcia witki

Plemnik nieżywy

-brak efektu

puchnięcia witki

Agregacja

–przyleganie (na zasadzie adhezji)

nieruchomych plemników do siebie oraz

przyleganie ruchomych plemników do pasm śluzu

i innych nieruchomych elementów nasienia

komórka

nabłonkowa

ciałka

resztkowe

plemniki

Aglutynacja

– tworzenie zlepów poprzez przyleganie ruchliwych

plemniki do siebie w charakterystyczny sposób: główka-główka, witka-

witka i mieszany

A

B

C

D

E

1

2

3

4

A

– główka do główki

B

– witka do witki

(główki wolne)

C

– koniec witki do

końca witki

D

– mieszana (razem

głowka-głowka i witka-

witka)

E

– plątanina (główki i

witki zaplątane; głowki

w aglutynacie witek))

1

– izolowana

<10

plemników

4

– masywna,

brak wolnych

plemników

2

– średnia

10 – 50

plemników

3

– duża

> 50

plemników

Typ

Stopień

Ocena liczby plemników:

Badanie wstępne:

-

Określenie właściwego rozcieńczenia (preparat bezpośredni)

-Pow. 400x (HPF

– high power field)

22 mm

10 µl

4 nl

50g NaHCO

3

+10ml 35% formaliny uzupełnić

wodą dest. do 1000ml

1. Określenie właściwego rozcieńczenia



korzystamy z preparatu bezpośredniego używanego do oceny ruchu



oglądamy

jeden

z preparatów bezpośrednich



oceniamy liczbę plemników w polu widzenia na podstawie

przynajmniej 5 pól mikroskopu (HPF – high power filed; 200x lub 400x)

22 mm

10 µl

4 nl

pow. 400x



Jedno pole widzenia to zwykle

– ok.

16 nl objętości

próbki nasienia przy powiekszeniu 200x

- ok.

4 nl objętości

próbki nasienia przy powiększeniu 400x

Kamera Neubauera

Głębokość 100 µm

3 mm

1 mm

20 nl

4

4

5

25 nl

22 mm

4 nl

100 plemników

500 plemników

4 nl 100 plemników

20 nl 500 plemników

100 nl 2500 plemników

Rozcieńczenie:

1:5 (1+4) 100 nl 500 plemników

Liczba plemników

w polu widzenia

(pow. 400x)

Rozcieńczenie

Numery pól do

zliczania plemników

< 2

1:

2

(1 + 1)

wszystkie 9 pól

2-15

1:

2

(1 + 1)

pole nr 5,4,6

16-100

1:

5

(1 + 4)

pole nr 5,4,6

> 101

1:

20

(1 + 19)

pole nr 5,4,6

C = (N/n) x (1/20) x

wsp. rozcieńczenia

C = (N/n) x (1/100) x

2

N

– liczba zliczonych plemników

n

- liczba rzędów

Przykład:

rozcieńczenie 1+4 (1:

5

)

C = (N/n) x (1/20) x

5

C = (N/n) x (1/4)

215

plemników

w

6

rzędach

224

plemników

w

6

rzędach

Suma:

215

+

224

= 439

Różnica:

224

–

215

= 9

C =

(215 + 224) /(6 +6) x (1/4)

C = 9,1 x 10

6

/ml

Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników

22 mm

4 nl

Ok. 4 plemniki

< 1 mln/ml

Ok. 2 plemniki

< 0,5 mln/ml

rozcieńczenie 1+1 (1:

2

)

C = (N/n) x (1/100) x

2

C = (N/n) x (1/50)

Gdzie N –liczba zliczonych plemników

n – liczba zliczonych siatek (9+9=18)

2x

Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników

Jeśli w preparacie przyżyciowym nie znaleziono plemników należy:



próbkę odwirować przy 3000

g

przez 15 min.



cały osad rozprowadzić na szkiełku podstawowym



przykryć szkiełkiem nakrywkowym (zalecane 20 x 50 mm)



oglądać cały preparat w poszukiwaniu plemników.



jeśli nie znaleziono żadnego plemnika jest to

azoospermia



jeśli znaleziono plemniki jest to

kryptozoospermia

Pow.

200x

Oceniamy ok.1200 pól widzenia

Budowa morfologiczna plemników:

Norma:

4% o prawidłowej budowie

(Kruger strict criteria)

Metody barwienia:

-Papanicolaou
-Shorr
-Diff-quick

Budowa morfologiczna plemników:

długość główki 4 – 5

um

długość wstawki

ok. 5 – 7 um

długość witki

ok. 45 um um

szerokość główki
2.5 – 3.5 um

szerokość wstawki

poniżej 1 um

region akrosomalny

40 – 70% powierzchni główki

Główka

– regularny zarys, owalna z wyraźnie

zaznaczonym

akrosomem

zajmującym od

40-

70%

powierzchni ; dopuszcza się obecność

2

małych wakuoli

w regionie akrosomalnym,

których powierzchnia nie przekracza 20%
powierzchni główki; region postakrosomalny nie
może zawierać wakuoli

Wstawka

– smukła, regularna w zarycie o

podobnej długości jak główka; główna oś
wstawki powinna byś przedłużeniem długiej osi
główki; przywieszka cytoplazmatyczna nie
powinna przekraczać 1/3 wielkości główki

Witka

– jednakowa grubość na całej długości,

cieńsza od wstawki, długość 45 m (ok. 10
długości główki); może wykazywać wygięcia,
jednak nie pod ostrym kątem sugerującym
złamanie witki

Prawidłowa budowa morfologiczna plemników:

Nieprawidłowości w budowie plemników:

Barwienie Papanicolaou

Komórka nabłonkowa


Makrofag degenerujący?


Granulocyt obojętnochłonny

Spermatyda




Granulocyt obojętnochłonny

Bakterie

-

-

-

-

-

N

+

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

-

-

-

-

makrofag

cytoplazma

spermatocyty

dzieląca się

spermatyda

degenerująca

spermatyda

dzieląca się

spermatyda

cytoplazma

spermatyda

degenerujące

spermatydy

dzielący się

spermatocyt

spermatocyt

fagocytujący

makrofag

spermatyda

+

monocyt

granulocyty

obojętnochłonne

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

degenerujący leukocyt

+

Ocena „komórek okrągłych”:

Komórki nabłonkowe cewki moczowej

Komórki prostaty

Komórki spermatogenezy

Leukocyty

- neutrofile

– 50 – 60 %

- makrofagi

– 20 – 30 %

- limfocyty

– 2 – 5 %

Immunocytochemiczne barwienie

na obecność antygenu CD45

(wszystkie leukocyty)

Leukocyty:

Komórki preoksydazo-dodatnie

(granulocyty obojętnochłonne)

Wartości referencyjne w badaniu nasienia

WHO 2010

Objętość ejakulatu

1,5 ml

2 ml

pH

7,2

Koncentracja plemników

15 mln/ml

20 mln/ml

Całkowita liczba plemników

39 mln/ejakulat

40 mln/ejakulat

Ruch plemników

40% kat. PR+NP lub; 32 % kat. PR (WHO 2010)

50% kat. a i b lub; 25 % kat. a (WHO 1999)

Morfologia plemników

4 % o prawidłowej budowie (WHO 2010)

14 % o prawidłowej budowie (WHO 1999)

30 % o prawidłowej budowie (WHO 1992)

Żywotność plemników

58%

żywych

50%

żywych

1.

WHO manual:

https://www.who.int/reproductivehealth/publications/infertility/

2. Cooper T i wsp., Human Reproductive Update, 2009
3. Asian Journal of Andrology, 2010, 12